Heparinem indukovaná trombocytopenie (HIT) – rozumný laboratorní přístup (snad)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Vloženo: Leden 28, 2020

Heparinem indukovaná trombocytopenie (HIT) – rozumný laboratorní přístup (snad)

V roce 1980 jsem byl poprvé vystaven žádosti o vyšetření poruchy, se kterou jsem se nikdy nesetkal. Hematolog z našeho pracoviště přišel s žádostí, zda se u pacienta v našem zařízení může jednat o heparinem indukovanou trombocytopenii (HIT). V té době jsem o této poruše nikdy neslyšel, takže jsem musel jít starým způsobem a vyhledat si ji v Index Medicus (skutečných knihách). V té době jsem v naší oblasti nemohl najít žádné laboratorní postupy, a tak jsem se pustil do mise, jejímž cílem bylo získat ověřenou metodu, abych mohl tomuto lékaři pomoci při léčbě tohoto subjektu. Později jsem našel metodu využívající světelnou transmisní agregometrii (LTA). Tento postup používal normální dárcovskou plazmu bohatou na krevní destičky (PRP) a dárcovské sérum pacienta s několika koncentracemi UFH ke kontrole agregační reakce. Tento postup byl proveden na dvoukanálovém agregometru LTA Chronolog. Nemohu vám dát odkaz, protože Pubmed na toto téma sahá pouze do roku 1983.

Pak jsem se musel naučit, co je to HIT. HIT je následek imunitní reakce, která je rozporuplná neboli „paradox“ reakcí. Imunitní trombocytopenie vyvolaná léky může být způsobena léky jako chinin a vankomycin, které způsobují okamžitou a drastickou trombocytopenii (<20 x 109/l), která způsobuje závažné krvácení. Osoba se skutečnou reakcí HIT může ztratit 50 % krevních destiček počínaje zahájením léčby heparinem po dobu 5 a více dnů, ale místo krvácivých problémů se u ní vyvinou trombotické problémy.

HIT je problém imunitní reakce způsobený protilátkami IgG. Protilátky se vyvíjejí v reakci na nefrakcionovaný heparin (UFH) a nízkomolekulární heparin (LMWH). Výskyt v reakci na léčbu UFH je 0,5-5 %. Při léčbě LMWH je výskyt HIT desetinový ve srovnání s výskytem, který je pozorován při léčbě UFH.

HIT je onemocnění, které vyžaduje od lékaře rychlé rozhodování, aby zabránil katastrofickým následkům pro pacienta. Mohou použít skóre 4Ts spolu s počtem trombocytů jako vodítko, zda nařídit protokoly laboratorních vyšetření: 4Ts je systém předběžného skórování pro HIT, který je široce používán v klinické praxi. Viz tabulka níže. Název odkazuje na čtyři charakteristiky HIT:

• Trombocytopenie
• Čas trombocytopenie vzhledem k expozici heparinu
• Trombóza nebo jiné následky HIT
• Pravděpodobnost jiných příčin trombocytopenie

Tabulka. 4Ts skóre

.

Funkce	Skóre
	2 body	1 bod	0 bodů
Trombocytopenie	>50% pokles a nadir trombocytů 20-.100 × 109/l	30%-50% pokles nebo nadir krevních destiček 10-19× 109/L	< 30% pokles nebo nadir krevních destiček < 10× 109/L
Čas poklesu počtu krevních destiček	Jasný nástup 5-10. den, nebo ≤1 d, pokud došlo k expozici heparinu během posledních 30 d	Soulad s poklesem v den 5-10, ale není jasný (např. chybějící počet trombocytů); nástup po 10. dni; nebo pokles ≤1 den, pokud byla expozice heparinu před 30-100 dny	Pokles počtu trombocytů ≤4 d bez nedávné expozice heparinu
Trombóza nebo jiné následky	Nová trombóza (potvrzená); kožní nekróza v místech vpichu heparinu; anafylaktoidní reakce po IV bolusu heparinu; krvácení do nadledvin	Progresivní nebo recidivující trombóza; erytematózní kožní léze; podezření na trombózu, ale neprokázaná	žádná
Jiné příčiny trombocytopenie	žádná zjevná	možná	neurčitá

Maximální počet bodů je 8. Skóre 6-8 bodů svědčí o vysoké pravděpodobnosti HIT. Skóre 4-5 svědčí o střední pravděpodobnosti přítomnosti HIT a skóre 0-3 znamená nízkou pravděpodobnost přítomnosti HIT.3,4

Při podezření na HIT na základě zvýšeného skóre 4Ts laboratoř pomůže lékaři stanovit přesnou diagnózu. Toho lze dosáhnout pomocí řady testů. Obvykle se dělí do dvou tříd: imunologické a funkční. Následující informace pojednávají o testech, které se nejčastěji používají při laboratorním testování této poruchy.

Laboratorní diagnostické testy pro HIT

Imunologický test HIT: Testy k detekci protilátek proti PF4/heparinu

Enzymové imunoanalýzy (EIA) (detekují IgG)

EIA (detekují polyspecifické protilátky)

Tyto metody jsou obvykle závislé na PF4 s vysokou citlivostí. U osob s HIT budou testy v 97 % pozitivní při použití souprav na pevné fázi. Ty jsou běžně komerčně dostupné. Tyto metody jsou obvykle testovány dávkově vzhledem k délce trvání této metody. Slabě pozitivní výsledky však mohou mít nízkou specificitu. Směrnice pro pozitivitu by měly být stanoveny v každém laboratorním prostředí.

– IgG specifický chemiluminiscenční test (CLIA)

-Chemiluminiscenční imunoanalýza (CLIA) je rychlý automatizovaný postup, který detekuje protilátky proti PF4/heparinu pomocí magnetických částic potažených PF4/polyvinyl sulfonátem (PVS). Po inkubaci, magnetické separaci a promytí se přidá stopovací látka sestávající z protilátky proti lidskému IgG značené izoluminolem, která se váže na protilátky proti PF4/heparinu na částicích. Reakce se dokončí druhou inkubací, magnetickou separací a promytím. Získá se hodnota OD úměrná koncentraci měřených anti-PF4/heparinových protilátek. Testování se obvykle provádí na vyžádání s dobou reakce přibližně 30 minut. Ve studii srovnávající tuto metodu se zlatým standardem testu uvolňování serotoninu (SRA) byly korelace testů vynikající ve specifičnosti a citlivosti (98,8/97,0 %).6

– Latexový imunoturbidometrický test (LIA) na (HIT).

LIA je klasifikován jako imunoanalýza. Od většiny ostatních imunoanalýz, jako je EIA, se liší tím, že přítomnost protilátek reagujících na PF4/heparin v plazmě pacienta vede k inhibici aglutinace částic prostřednictvím konkurence s monoklonální protilátkou napodobující HIT. V souladu s tím byla LIA nazvána „funkcionalizovanou imunoanalýzou“, což teoreticky naznačuje, že by mohla poskytnout diagnostickou specifičnost, která je prostřední mezi vysoce specifickou funkční analýzou, SRA, a méně specifickými metodami EIA závislými na PF4. Jedná se o snadno automatizovaný postup s dobou zpracování přibližně 20 minut. Studie prokázaly 97,4% citlivost a 91,2% specifičnost.7

Laterální průtokový test (STiC):

Laterální průtokové imunoanalýzy detekují IgG protilátky proti komplexům PF4/polyanion obsaženým ve vyhodnocovací kartě, ve které se výsledky vizuálně odečítají. Díky 10minutové inkubační době se jedná o rychlou metodu stanovení přítomnosti HIT.

Funkční testy HIT: Testy, které detekují protilátky schopné vázat a aktivovat krevní destičky

Test na uvolňování serotoninu (SRA) – Heparinem indukovaný test aktivace krevních destiček (HIPA) – Test agregace krevních destiček (PAT) – Testy založené na průtokové cytometrii.

Test na uvolňování serotoninu (SRA): potvrzující test HIT

Tato metoda detekuje protilátky aktivující krevní destičky. SRA měří radioaktivně značený serotonin uvolněný z krevních destiček.9,10 Pozitivní výsledek vyžaduje > 20% uvolnění serotoninu při nízké dávce UFH a < 20% uvolnění v přítomnosti vysoké hladiny UFH. Tato metoda byla v minulosti obecně uznávána jako zlatý standard pro konfirmační vyšetření. Má 95% míru senzitivity a specificity. SRA zachycuje detekci protilátek aktivujících krevní destičky. Má nejvyšší citlivost/specifičnost pro klinický HIT. SRA má také mnohem vyšší diagnostickou specificitu než EIA. SRA by se neměla provádět bez předchozího pozitivního výsledku EIA jako screeningový test. To pomůže vyloučit problém falešně pozitivního SRA. Pokud se u vzorku subjektu s pozitivním SRA zjistí negativní EIA, mělo by to být „varováním červenou vlajkou“, že je třeba vyhodnotit metodu SRA.

SRA může také poskytnout informace o tom, zda vzorek séra HIT může vyvolat silnou reakci trombocytů v nepřítomnosti heparinu. Aktivace destiček nezávislá na heparinu je varováním před extrémně závažnou přítomností HIT. Tento nález by mohl indikovat HIT s opožděným nástupem a silně pozitivní HIT s přítomností konsumpční koagulopatie s rizikem mikrovaskulární trombózy.

Test je složitý, nákladný a časově náročný. Jsou vyžadovány normální dárcovské trombocyty (obtížně standardizovatelné kvůli individuálním normálním reakcím dárců). Proto se jedná o relativně nestandardizovaný test, který není široce používán.9,10

Heparinem indukovaný test aktivace destiček (HIPA):

Tato metoda je test aktivace promytých destiček, který se obvykle provádí pouze v Evropě. Tento test se provádí agregací destiček a stanovuje se vizuálně pomocí koncového bodu aktivace destiček.10 Pro srovnání, SRA se provádí testováním destiček v třepačce a reaguje po dobu 60 minut. HIPA se liší tím, že používá míchané trombocyty a odečítá se vizuálně v intervalech 5 minut po dobu 45 minut.

Někteří vyšetřovatelé pozorovali, že metoda HIPA je citlivější pro detekci protilátek aktivujících trombocyty než postup SRA. Toto zjištění však může zachycovat nepatogenní protilátky, což vede ke snížení specifity diagnózy.6

Agregační testy trombocytů

(LTA: světelná transmisní agregometrie)/WB: agregometrie celé krve):

Agregometrie světelnou transmisní agregometrií (LTA) byla prvním testem použitým ke stanovení kvalitativní odpovědi trombocytů na protilátky HIT. Provádí se vložením normální dárcovské PRP a PRP pacienta do kyvety, která se míchá. Do směsi se přidá heparin v různých koncentracích a po dobu 15 min se sleduje agregace. Pokud vzorek vykazuje agregaci, přidá se vyšší koncentrace heparinu, aby se určil bod, kdy je agregace inhibována. Tím je dáno pozitivní nebo negativní kvalitativní určení výsledku: negativní, slabě pozitivní nebo silně pozitivní (0, 2, 3). Tento test se již nepoužívá pro jeho pracnost a relativně nízkou citlivost.11

– Agregometrie trombocytů z plné krve (WB) používá směs normálních dárcovských trombocytů a plné krve nebo séra pacienta, v závislosti na použitém agregometru. Pokud tato informace není známa, dárce by měl mít krevní skupinu O. Dárce (dárci) plné krve by měl být předem kvalifikován (pomocí HIT pozitivního vzorku), aby bylo zajištěno, že vzorek reaguje na protilátku. V závislosti na metodě WB může být vzorek odebrán do běžné zkumavky s 3,2% citrátem sodným nebo do speciální zkumavky pro odběr hirudinu. Obě metody využívají formu impedanční agregometrie. U každé metody se vzorky krve s heparinem inkubují a agregace se sleduje pomocí impedanční agregometrie. Vzorky, které vykazují agregační odezvu, jsou poté podrobeny zkoušce s vyšší koncentrací heparinu, dokud není zjištěna žádná agregace. Agregometrie trombocytů WB se považuje za kvantitativní test a uvádí se jako hodnoty od 0 do 3 v závislosti na koncentraci heparinu potřebné ke snížení pozorované agregace.11

Průtoková cytometrie na přítomnost HIT

K hodnocení HIT pomocí průtokové cytometrie se používá test exprese destičkového P-selektinu (PEA). Jak jsme uvedli dříve, metoda SRA je „zlatým standardem“ pro konfirmační testování k rozpoznání protilátek, které mohou rozpoznat PF4 v kompexu s přítomností heparinu. U některých pacientů léčených heparinem bez přítomnosti HIT mohou být protilátky pozitivní. SRA je obvykle k dispozici pouze ve speciálních referenčních laboratořích. Metoda je časově náročná, technicky náročná a expanzivní. Rychlý čas obratu není možný, což dále oddaluje diagnózu přítomnosti HIT, která vyžaduje okamžitou léčbu, aby se předešlo možným život ohrožujícím problémům. Nedávná studie hodnotila metodu SRA ve srovnání s technikou PEA, která využívá systém průtokové cytometrie. Testy využívají PF4 závislý test exprese P-selektinu PEA. Retrospektivní studie byla provedena na skladovaných vzorcích séra od 91 subjektů. Všichni testovaní pacienti měli předchozí informace o HIT 4Ts, které zahrnovaly následující: trombocytopenii, dobu ztráty množství trombocytů, diagnózu trombózya jakýkoli jiný případ trombocytopenie. Všechny subjekty se středním skóre 4Ts a zvýšeným testem PF4 EIA s OD ≥2,0 nebo zvýšeným skóre 4Ts a nižším testem PF4 EIA s OK ≥1,0 byly klasifikovány jako HIT pozitivní; ostatní vzorky byly klasifikovány jako HIT negativní.

V této studii měla PEA vyšší diagnostický výsledek (plocha pod křivkou 0,92 vs 0,82;P-0,02) než SRA. Jedenáct ze 16 vzorků séra, které byly PEA pozitivní a SRA negativní, bylo HIT pozitivních. Autoři uvedli, že jiné studie využívající vzorky s podobnými destičkovými markery a vzorky, které byly sériově ředěny srom subjektů s potvrzenou diagnózou HIT, prokázaly, že PEA je citlivější než thSRA na protilátky aktivující destičky.

Dospěli proto k závěru, že PEA je jednodušší na provedení a výsledky vykazují přesnější výsledek při diagnostice existence HIT.13

Dalším testem založeným na průtokové cytometrii je HITAlert od společnosti IQ Products. Ve studii z roku 2013 byl vypracován protokol využívající metodu průtokové cytometrie HITAlert k detekci HIT v laboratorním prostředí nemocnice terciární péče. Porovnávali skóre 4Ts pro screening možné přítomnosti HIT u 37 subjektů. Sérum bylo analyzováno na přítomnost protilátek proti HIT metodou průtokové cytometrie HITAlert a poté porovnáno s antigenním testem. Srovnávacími metodami byly particle gel immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assay a dva funkční testy. Byly použity metody Multiplate WBA (v USA a Kanadě není k dispozici) a SRA. Jejich zjištění byla následující: Průtoková cytometrie prokázala pozitivitu HIT u 14 z 37 pacientů. U 4Ts skóre nízké (0 z 8) střední (5 0 z 19) a vysoké (9 z 10). Při srovnání se SRA měla průtoková metoda 100% specificitu a 81% senzitivitu pro identifikaci přítomnosti HIT. Funkční test WBIA měl při srovnání s průtokovou cytometrií rovněž 81% senzitivitu a 90% specificitu. Postup PaGIA však měl pouze 20% specificitu, ale 20% senzitivitu. Průtoková cytometrie měla lepší specifitu než antigenní postup. To bylo nejvýraznější u skupiny se středním rizikem 4T. To bylo patrné u všech 3 funkčních metod použitých v protokolu. Zkoušející dospěli k závěru, že metoda průtokové cytometrie HITAlert může zlepšit specificitu identifikace HIT bez ztráty citlivosti.12 Tento test je určen pouze pro výzkumné použití v USA a Kanadě a není k dispozici pro diagnostické postupy.

Shrnutí pro detekci HIT

Na závěr bych rád uvedl algoritmus, který je v referenci č. 14 od Cukera a kol. a který je doporučen pro diagnostiku HIT. Jedná se o diagnostický algoritmus středně vysokého/vysokého skóre 4Ts, po kterém následuje imunoanalýza a poté funkční vyšetření, jehož výsledkem je: –

Poznámka: Funkční test nemusí být nutný u pacientů ve skupině s vysokou pravděpodobností na základě jejich 4Ts skóre a velmi silně pozitivního imunoanalýzy (hodnota ELISA > 2).0 OD jednotek).

Výskyt přítomnosti HIT je nežádoucí lékovou interakcí moderovanou protilátkami aktivujícími krevní destičky, které se zaměřují na komplexy PF4/heparin. Je odpovědností laboratoře určit vhodné laboratorní testy ke zjištění přítomnosti nebo a funkční schopnosti tebou indukovaných heparinových protilátek aktivovat krevní destičky. Tyto testy je třeba provádět včas, aby pomohly lékařům v prevenci katastrofických trombotických situací.

1. Prince M, Wenham T. Heparinem indukovaná trombocytopenie. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Unfractionated heparin versus low molecular weight heparins for avoiding heparin-induced thrombocytopenia in postoperative patients. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Přehled. Aktualizováno v: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Prediktivní hodnota skórovacího systému 4Ts pro heparinem indukovanou trombocytopenii: systematický přehled a metaanalýza. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Evaluation of pretest clinical score (4 T’s) for diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia in two clinical settings. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Kvantitativní interpretace měření optické hustoty pomocí enzymových imunoanalýz závislých na PF4. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. Laboratorní diagnostika heparinem indukované trombocytopenie. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Improving clinical interpretation of the anti-platelet factor 4/heparin enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia through the use of receiver operating characteristic analysis, stratum-specific likelihood ratios, and Bayes theorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratory testing protocols for heparin-inducd thrombocytopenia (HIT) testing. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparinem indukovaná trombocytopenie, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. Test uvolňování serotoninu z krevních destiček. Am J Hematol. 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? Komplexní současné vyšetřování laboratorních testů na heparinem indukovanou trombocytopenii. Patologie. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital. Krevní koagulace a fibrinolýza. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. A Novel PF4-Dependent Platelet Activation Assay Identifies Patients Likely to Have Heparin-Induced Thrombocytopenia/Thrombosis. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).

.