Naši klienti ve společnosti Biotage mají zajímavé a různorodé zkušenosti, od vysoce kvalifikovaných syntetických chemiků přes odborníky na chemii přírodních produktů až po ty, kteří s chemií teprve začínají. Za více než 40 let své kariéry v „umění“ chromatografie jsem zjistil, že u mnoha z těchto skvělých lidí chybí porozumění chromatografickým principům. Domnívám se, že tento nedostatek porozumění je způsoben pouze jejich základními studijními osnovami, kde se separační věda používá jako nástroj při laboratorních pracích, ale principy, proč se složky směsi oddělují (nebo neoddělují), možná nejsou účinně vysvětleny, pochopeny nebo studovány.
Existují čtyři základní typy chromatografie:
- Chromatografie plyn-kapalina (GC)
- Chromatografie kapalina-kapalina (LLC)
- Chromatografie kapalina-pevná látka (LSC)
- Chromatografie vylučující velikost/gelová permeace (SEC/GPC)
Pro tento příspěvek se zaměřím na chromatografii kapalina-pevná látka.
Chromatografie kapalina-pevná látka
Jedná se o nejoblíbenější z výše uvedených technik, protože je užitečná pro separace polotěkavých a netěkavých sloučenin. Protože k eluci sloučenin ze separační kolony není zapotřebí tepla (jako u GC), vyžaduje chromatografie kapalina-pevná látka použití rozpouštědla nebo směsi mísitelných rozpouštědel s různou polaritou, aby se chemické složky vzorku od sebe oddělily.
Při LSC se vzorek zavádí na pevný nosič nebo stacionární fázi. Složky vzorku se vážou na stacionární fázi, ale v různé míře. Míra interakce se stacionární fází řídí rychlost a účinnost separace. Čím větší je přitažlivost ke stacionární fázi, tím delší dobu potřebují sloučeniny k eluci. Aby se pomohlo eluci těchto silně vázaných sloučenin, musí se v průběhu času měnit poměr rozpouštědel (zvyšovat jejich sílu).
V rámci LSC existuje několik různých chromatografických technik…
- Papírová chromatografie (PC)
- Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
- Vysoce-performance liquid chromatography (HPLC)
- Flash chromatography (FC)
- Ion exchange chromatography (IX)
- Affinity chromatography (AC)
- Chiral chromatography (CC)
- Supercritical fluid chromatography (SFC)
V tomto příspěvku se zaměřím na flash chromatografii, jejíž principy jsou stejné jako u HPLC. Obě používají kolony naplněné stacionární fází, do které se vstřikuje vzorek a přes kterou se čerpá rozpouštědlo. Blesková chromatografie však používá větší kolony než HPLC, která je většinou analytickou separační technikou.
Blesková chromatografie je preparativní chromatografická technika, jejíž kolony jsou rovněž naplněny pevným nosičem nebo médiem, které má větší velikost částic než kolony HPLC. Tyto rozdíly ve velikosti nosiče a kolony umožňují flash kolonám purifikovat více sloučenin na gram nosiče než HPLC.
- Flash chromatografie používá 15 µm až 60 µm částice nosiče
- HPLC používá 1,7 µm až 10 µm částice nosiče
Co se děje uvnitř kolony
Většina flash chromatografie a HPLC se provádí buď metodikou normální nebo obrácené fáze. Rozdíly mezi těmito metodikami spočívají v chemickém složení stacionární fáze a rozpouštědlech používaných k separaci jednotlivých chemických složek směsi.
- Normální fáze používá pro mobilní fázi nepolární a středně rozpustná rozpouštědla (např. hexan a ethylacetát) a pro polární médium (např. ethylacetát).např. oxid křemičitý) jako stacionární fázi
- Obrácená fáze je přesně opačná, používá polární rozpouštědla a nepolární stacionární fázi
Protože jsou tyto metodiky navzájem „polárními“ protiklady (slovní hříčka), pořadí eluce většiny sloučenin je obrácené. Zde se odehrává chemie, která stojí za chromatografickými separacemi.
Zaměřme se nyní na normální fázi.
Chromatografie na normální fázi
Při chromatografii na normální fázi se chemické sloučeniny tvořící směs (např. reakční směs, extrakt přírodního produktu atd.) rozpustí ve vhodném rozpouštědle a vstříknou do kolony. Když se směs dostane do kontaktu s polární stacionární fází, řekněme oxidem křemičitým, sloučeniny směsi a rozpouštědlo jejich roztoku soutěží s mobilní fází o vazebná místa oxidu křemičitého. Čím polárnější je chemická látka, tím silněji je přitahována ke křemíku. Toto přitahování se nazývá adsorpce (liší se od absorpce).
Absorpce je to, k čemu dochází při interakci houby nebo papírového ručníku s kapalinou. Adsorpce je kombinací fyzikálních a chemických interakcí, kdy polární povrch oxidu křemičitého chemicky váže chemické složky, s nimiž přichází do styku, většinou díky jevům známým jako vodíková vazba a van der Wallsovy síly.
Při interakci jakékoli chemické látky se suchým oxidem křemičitým (jak se používá u nové zábleskové kolony) dochází k adsorpci. Při této interakci se uvolňuje teplo, které může způsobit problémy se stabilitou sloučeniny a chromatografickými výsledky. Z tohoto důvodu se křemíkové kolony před zavedením vzorku obvykle ekvilibrují (předem smáčejí) rozpouštědlem s nízkou polaritou. Rozpouštědla s nízkou polaritou (např. hexan, heptan, cyklohexan) jsou slabá rozpouštědla a špatně se adsorbují na oxid křemičitý nebo jiná polární média.
Povrchová chemie oxidu křemičitého je směs hydroxylových skupin (silanolů) a silyletherů, Obrázek 1. Tyto funkční skupiny jsou polární, předpokládá se, že jsou záporně nabité, a adsorbují sloučeniny s nedostatkem elektronů. Pí-mračna aromatických sloučenin se mohou při adsorpci vodíkově vázat s hydroxylovými skupinami oxidu křemičitého.1
Obrázek 1. Chemické složení chromatografického oxidu křemičitého zahrnuje směs silanolů a silyletherových funkcí. Tyto molekuly se vážou s chemickými látkami prostřednictvím vodíkové vazby/adsorpce.
Pro zajištění dobré vazby složek vzorku (adsorpce) je třeba vzorek, který má být přečištěn, buď rozpustit a vložit do kolony ve slabém rozpouštědle (kapalná náplň), nebo rozpustit silnějším (polárním) rozpouštědlem, smíchat s inertním prostředím (např. oxid křemičitý, diatomitická zemina), vysušit a zabalit do jiné kolony umístěné v řadě s čisticí kolonou (suchá náplň). Suchá zátěž odstraňuje mnoho problémů, které se vyskytují při použití kapalné zátěže, zejména u vzorku rozpuštěného v polárním rozpouštědle.
Po zátěži vzorku se zavedou rozpouštědla mobilní fáze. Aby však bylo dosaženo separace, musí se složky vzorku desorbovat ze stacionární fáze různou rychlostí. Ačkoli toho lze dosáhnout použitím rozpouštědla s konstantní polaritou (izokratická eluce), lepšího čištění se obvykle dosáhne použitím mobilní fáze, která začíná s nízkou polaritou a postupem času se její polarita zvyšuje. To je známé jako gradientová eluce.
Při gradientu se sloučeniny s vyšší rozpustností v rozpouštědle s nízkou polaritou (sloučeniny s nižší polaritou) desorbují jako první a procházejí kolonou. S rostoucí polaritou rozpouštědla mobilní fáze se adsorbované sloučeniny desorbují z média různou rychlostí v závislosti na jejich rozpustnosti ve stále polárnější mobilní fázi, Obrázek 2.
Obrázek 2. Nahoře – Při izokratické eluci (konstantní polarita mobilní fáze) se sloučeniny desorbují pomaleji než při použití gradientu (dole). Gradientová eluce obvykle poskytuje lepší separaci/přečištění než izokratická eluce.
Zajímavou vlastností chromatografie s normální fází je, že jakmile se sloučenina desorbuje z média, už se nikdy neadsorbuje, protože na její místo se přednostně adsorbuje stále polárnější mobilní fáze.
Rozdíly v polaritě (vazebné síle) mezi sloučeninami mohou být tak nepatrné, jako je přidání jiné funkční skupiny, rozdíly v umístění funkčních skupin (Parida, 2006) jako na aromatickém kruhu, nebo tak výrazné, jako jsou sloučeniny se zcela odlišnou strukturou, Obrázek 3.
Obrázek 3: Rozdíly v polaritě sloučenin. Rozdělení sloučenin s rozdílnou polaritou na základě typu funkční skupiny a umístění na molekule. Podle pořadí eluce – naftalen (bez polární funkční skupiny), 1-nitronaftalen, o-nitroanilin, m-nitroanilin, p-nitroanilin. Nitroaniliny se liší pouze umístěním nitrofunkční skupiny vzhledem k aminu.
Shrneme-li tedy, chromatografické separace na normální fázi jsou založeny na rozdílech v polaritě sloučenin (zjevných i jemných), jejich přitažlivosti ke stacionární fázi a jejich rozpustnosti v mobilní fázi. Pro dosažení nejlepších výsledků purifikace se doporučuje průzkum rozpouštědel pomocí TLC.
Chcete-li se o zábleskové chromatografii dozvědět více, stáhněte si náš whitepaper – Úspěšná záblesková chromatografie.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
