PMC

Pokud chceme zjistit, zda nádor pacienta bude reagovat na určitý léčebný režim, musíme zkoumat odpověď tohoto lidského nádoru, nikoliv myšího nádoru, na léčbu

Pro studium rakoviny u lidí bylo vyvinuto mnoho myších modelů. Tyto modely se používají ke zkoumání faktorů podílejících se na maligní transformaci, invazi a metastazování a také ke zkoumání odpovědi na terapii. Jedním z nejpoužívanějších modelů je lidský nádorový xenograft. V tomto modelu jsou lidské nádorové buňky transplantovány buď pod kůži, nebo do typu orgánu, ve kterém nádor vznikl, do imunokompromitovaných myší, které lidské buňky neodmítají. Například xenotransplantát snadno přijmou athymické nahé myši, myši s těžce oslabenou imunitou (SCID) nebo jiné imunokompromitované myši (Morton a Houghton, 2007). V závislosti na počtu injikovaných buněk nebo velikosti transplantovaného nádoru se nádor bude vyvíjet 1-8 týdnů (nebo v některých případech 1-4 měsíce či déle) a odpověď na vhodné léčebné režimy lze studovat in vivo. Dalším typem zvířecího modelu pro studium lidské rakoviny je model geneticky modifikované myši (GEM). Genetický profil těchto myší je změněn tak, že jeden nebo několik genů, o nichž se předpokládá, že se podílejí na transformaci nebo malignitě, jsou mutovány, odstraněny nebo nadměrně exprimovány; následně se studuje účinek změny těchto genů v průběhu času a lze sledovat terapeutickou odpověď na tyto nádory in vivo. Jak athymické nahé myši, tak myší xenografty, které využívají lidské nádorové buněčné linie, byly po desetiletí používány k lepšímu pochopení faktorů ovlivňujících růst nádorů; nicméně nedávné informace týkající se klíčového vlivu mikroprostředí nádoru na progresi a růst nádoru vedly k většímu spoléhání se na modely nádorů GEM využívající imunokompetentní myši, stejně jako na používání primárních lidských nádorových xenograftů v humanizovaných myších modelech. Ve skutečnosti jsou xenografty často považovány za horší než modely GEM. V tomto článku chci ukázat, že každý z těchto modelů má své využití v diagnostice nádorových onemocnění a v preklinických terapeutických modalitách.

V poslední době bylo navrženo několik kritérií pro GEM modely lidských nádorů: (1) myši musí nést stejnou mutaci, která se vyskytuje v lidských nádorech; (2) mutace by měly být vytvořeny v rámci endogenního lokusu a neměly by být exprimovány jako transgen; (3) mutované geny by měly být během embryogeneze a časného postnatálního vývoje němé, s výjimkou modelů dědičných dětských nádorů; (4) mutace by se měly vyskytovat ve specifických cílových tkáních ve vybraných typech buněk; a (5) mutace se musí vyskytovat v omezeném počtu buněk. Dalšími „požadovanými vlastnostmi“ je, že typ nádoru a anatomopatologie by měly být co nejpodobnější těm, které jsou pozorovány u lidských nádorů, a že vývoj nádoru by měl probíhat ve stejných nebo podobných „preneoplastických“ stadiích (M. Barbacid, Keystone Symposium on Inflamation, Microenvironment and Cancer, 2008, a osobní sdělení). Dalším důležitým kritériem, kterého je v modelech GEM obtížné dosáhnout, je to, že prostředí hostitele a nádoru by mělo být v modelu reprodukovatelné. Kromě toho, i když jsou myší modely nádorů využívající GEM velmi užitečné pro hodnocení účinků specifické mutace, delece nebo amplifikace jednoho či dvou genů během progrese myšího nádoru, obvykle nemohou plně reprodukovat genetickou složitost lidských nádorů. Například u lidí vykazují maligní melanomy a jiné typy nádorů s podobným stupněm genetické heterogenity rozsáhlou míru aneuploidie a specifický zisk nebo ztráta genů se u jednotlivých buněk téhož nádoru velmi liší. Ačkoli má tedy tento model významné přednosti, má i vrozené nedostatky, které mohou zásadně ovlivnit použití těchto myší pro předpověď odpovědi pacienta na léčbu.

Pokud chceme zjistit, zda nádor pacienta bude reagovat na určitý léčebný režim, musíme zkoumat odpověď tohoto lidského nádoru, nikoli myšího nádoru, na léčbu. Zde může být užitečný xenograft lidského nádoru na athymických nahých myších, SCID myších nebo humanizovaných myších s neobézním diabetem (NOD)/SCID (obr. 1). Ačkoli při volbě modelů nahých myší nebo SCID myší některé složky imunitního systému chybí, u athymických nahých myší jsou B buňky, dendritické buňky a granulocyty relativně neporušené a u těchto myší dochází ke kompenzačnímu zvýšení aktivity přirozených zabíječů (NK) i nádorových makrofágů. Navíc lze tvrdit, že v době, kdy jsou tyto metastatické léze chirurgicky odstraněny nebo provedena biopsie, nádor již unikl imunitnímu dohledu a usmrcení buněk imunitními buňkami. V tomto úvodníku se budu zabývat výhodami a nevýhodami lidských nádorových xenografů ve srovnání s modely GEM jako metodou analýzy potenciálních odpovědí nádorů pacientů na léčbu (obr. 1).

Používání lidských nádorových xenografů ke zkoumání terapeutických odpovědí na léčiva má několik klíčových výhod: (1) lze použít skutečnou lidskou nádorovou tkáň, která se vyznačuje komplexností genetických a epigenetických abnormalit, které se vyskytují v lidské nádorové populaci; (2) lidské nádorové xenografty lze použít jako pomůcku při vývoji individualizovaných molekulárních terapeutických přístupů; (3) výsledky z biopsie lidského nádoru týkající se odpovědi na léčbu lze získat během několika týdnů, zatímco modely GEM často vyžadují až rok, než se vyvinou před léčbou léky; (4) z jedné nádorové biopsie lze testovat více terapií; (5) z lidské biopsie a tkáně xenotransplantátu lze snadno získat údaje z tkáňových mikročipů a genetických mikročipů, a to před a po farmakoterapii, pro rozsáhlou analýzu předtím, než je pacient podroben terapii, která nemusí fungovat; (6) ortotopické xenografty lze vhodně umístit tak, aby reprodukovaly orgánové prostředí, v němž nádor roste, takže lze modulovat vliv nádoru na jeho mikroprostředí, i když s výjimkou určitých populací T-buněk; (7) do xenotransplantátu lze zahrnout stroma z mikroprostředí lidského nádoru, aby se dokonaleji napodobilo mikroprostředí lidského nádoru; a (8) xenotransplantáty využívající myši NOD/SCID, které byly „humanizovány“ injekcí buněk periferní krve nebo kostní dřeně, umožňují téměř úplnou rekonstrukci imunitní odpovědi na nádor. Xenografty využívající lidské buněčné linie k testování reakce na léky často nekorelují s klinickou aktivitou u pacientů (Kerbel, 2003). Naopak při použití primárních nádorů jako ortotopického xenograftu je prediktivní hodnota odpovědi silnější, zejména pokud je použita klinicky relevantní dávka léčiva (Johnson et al., 2001; Kerbel, 2003; Scholz et al., 1990). Existují tři různé typy odpovědi na léčbu, které lze hodnotit: vliv na rychlost růstu nádoru, vliv na zmenšení/regresi nádoru a přežití. Uvádí se, že účinek léku na rychlost růstu nádoru nebo na cytostázu často více předpovídá klinickou odpověď než zmenšení/regrese nádoru (Kelland, 2004). Navíc subkutánní modely nádorů, které nejsou ortotopické a nepředstavují vhodná místa pro lidské nádory, nejsou při testování odpovědi na protinádorová léčiva prediktivní (Killion et al., 1998). Problémem ortotopických modelů ve srovnání se subkutánními modely je obtížné sledování růstu nádoru. Nedávný vývoj nových technik zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) a mikrozobrazování však může tento problém minimalizovat.

Při používání myšího xenotransplantačního modelu ke sledování a/nebo předvídání léčebných odpovědí u nádorových onemocnění existuje několik dalších nevýhod a problémů. Ortotopické modely nádorů jsou časově náročné, drahé a technicky náročné. Pokud se navíc používají athymické nahé myši nebo SCID myši, dochází ke ztrátě odpovědi zprostředkované lymfocyty na nádor, tj. nahé myši ztrácejí určité odpovědi T-buněk a SCID myši ztrácejí odpovědi T- i B-buněk. Tyto imunologické nedostatky však lze v zásadě do značné míry překonat transplantací lidských nádorů „humanizovaným“ NOD/SCID myším. Tím se značně omezí mnohé nevýhody ortotopických modelů lidských nádorových xenograftů pro studium léčebné odpovědi. Úplné obnovení imunitního systému u „humanizované myši“ však není možné, protože obnovení selekčních prvků HLA I. a II. třídy v populacích T-buněk zůstává výzvou (Bernard et al., 2008). Pro provedení těchto pokusů je navíc nutné novorozené myši ozářit a poté jim vštípit lidské CD34+ krvetvorné kmenové buňky z lidské pupečníkové krve. Načasování získání pupečníkové krve, ozáření novorozených myší a ověření humanizovaného fenotypu NOD/SCID myší po přihojení činí tento postup poměrně těžkopádným, ale velmi cenným.

Přes nevýhody xenotransplantačního modelu pro předpověď klinické odpovědi na léčbu existuje řada důležitých úspěchů. Například xenografty buněčných linií mnohočetného myelomu do syngenních myší reagují na inhibitor proteazomu, bortezomib/VELCADE®, který se ukázal jako významný příslib pro léčbu mnohočetného myelomu (LeBlanc et al., 2002; Moreau et al., 2008; Oyajobi a Mundy, 2003). Kombinace bortezomibu a melfalenu byla poprvé prokázána jako účinná pro léčbu mnohočetného myelomu v preklinických xenografických studiích, což vedlo k úspěchu v klinických studiích, po nichž byl doporučen nový standard klinické péče pro pacienty s mnohočetným myelomem starší 65 let (Mateos et al., 2006; Mitsiades et al., 2003). Bylo prokázáno, že herceptin zvyšuje protinádorovou aktivitu paklitaxelu a doxorubicinu proti xenografům lidského karcinomu prsu s nadměrnou expresí HER2/neu, což vedlo k následným úspěšným klinickým studiím (Baselga et al., 1998; Sporn a Bilgrami, 1999). Bylo prokázáno, že neutralizační protilátky zaměřené proti receptoru pro vaskulární endoteliální růstový faktor 2 (VEGFR2) v kombinaci s paklitaxelem jsou účinné při inhibici růstu nádoru a inhibici metastatického šíření v ortotopickém modelu xenograftu (Davis a kol., 2004). Na tento základ navázal vývoj bevacizumabu, humanizované monoklonální protilátky, která je zaměřena na vaskulární endoteliální růstový faktor A (VEGF-A). Bevacizumab byl účinný v klinických studiích fáze III u kolorektálního karcinomu a karcinomu ledviny a v roce 2004 byl schválen FDA (Hurwitz et al., 2004; Yang et al., 2003). Myší xenograftové modely jsou navíc užitečné pro předvídání toxicity cílených terapií a v jiných případech pro identifikaci možných prediktivních biomarkerů cílové modulace. Ačkoli se jedná pouze o několik příkladů úspěšného využití xenograftových studií, je zřejmé, že u mnoha typů lidských nádorů vedly informace získané z ortotopických myších xenograftových studií s použitím lidských nádorů k informacím, které se promítly do úspěšných klinických studií.

Výhody GEM jsou následující: (1) myši jsou imunokompetentní, takže nádorové mikroprostředí může být co nejvíce zrcadleno v myším modelu nádoru; (2) specifické genetické abnormality, které jsou přítomny v lidských nádorech, mohou být indukovatelným způsobem reprodukovány v určitém věku v typu tkáně původu; (3) fáze progrese nádoru mohou být studovány v čase; a (4) v různých fázích vývoje nádoru lze zkoumat několik terapeutických přístupů. Genetické modely jsou užitečné také u humanizovaných myší, kde jsou v myších exprimovány lidské geny, například geny cytochromu P450 nebo lidské nádorové antigeny, aby bylo možné sledovat metabolismus léčiv nebo imunologické reakce na nádor (Talmadge et al., 2007). Nevýhodou GEM je jednak to, že nelze spolehlivě napodobit složitost lidského nádoru, a jednak to, že myší nádory nejsou lidské nádory a často nepředpovídají, co se stane v lidském nádoru, pokud jde o léčebnou odpověď. Mnoho myších nádorů můžeme vyléčit, ale neexistuje přímá souvislost mezi odpovědí u myši a odpovědí v klinice.

Shrnem lze říci, že jak ortotopický xenograft lidského nádoru, tak modely GEM jsou užitečné pro zlepšení našeho chápání vývoje a léčby rakoviny. Každý z nich má své silné stránky a omezení, přičemž ortotopický lidský nádorový xenograft je vynikající pro předpovídání odpovědi na léčiva u lidských nádorů a model GEM je nejlepší pro zkoumání úlohy specifických genů ve vývoji a progresi nádoru. Ať už se k předpovědi klinické odpovědi u pacientů použije jakýkoli model, pro dosažení kvalifikované „odpovědi“ na léčbu je důležité dosáhnout alespoň 50% inhibice růstu nádoru a používat klinicky relevantní dávky léčebných látek a sledovat přežití. Kromě toho je důležité určit, zda se růst nádoru po přerušení léčby vrátí, a pokud ano, zda je opětovný růst rychlejší, když je léčba přerušena, než před zahájením léčby. Pokud tomu tak je, navzdory jakékoli odpovědi na léčbu lékem, rebound efekt nedoporučuje používat tento režim léčby lékem u typů nádorů vykazujících rebound efekt. Závěrem lze říci, že nemáme k dispozici ideální myší modely lidských nádorů, ale musíme se naučit interpretovat naše údaje v rámci omezení použitého testu

.