Vliv diety s obsahem Bacillus megaterium na růst, aktivitu trávicích enzymů a střevní mikrobiální diverzitu zrcadlového kapra Songpu Cyprinus specularis Songpu

Abstrakt

Předkládaná studie byla provedena za účelem vyhodnocení vlivu diety s obsahem Bacillus megaterium na růstovou výkonnost, trávicí enzymy a střevní mikrobiální diverzitu u zrcadlového kapra Songpu (Cyprinus specularis Songpu). Ryby byly ručně krmeny dvěma dietami (kontrolní dietou a dietou obalenou B. megaterium) třikrát denně až do zjevného nasycení po dobu 56 dnů. V porovnání s kontrolní skupinou zlepšilo podávání diety obalené B. megaterium růst ryb a významně snížilo poměr konverze krmiva (). Aktivity amylázy a lipázy v předžaludcích byly u ošetřené skupiny významně vyšší než u kontrolní skupiny (). Aktivity proteáz předního, středního a zadního střeva byly v ošetřené skupině vyšší než v kontrolní skupině (). Výsledky sekvenování genů 16S rDNA mikrobioty pomocí vysokokapacitního sekvenování ukázaly, že rozmanitost a početnost střevní mikroflóry se zvýšila spolu s růstem zrcadlového kapra Songpu. Zrcadloví kapři Songpu krmeni dietou obalenou B. megaterium vykazovali zvýšené zastoupení střevních bakterií Bacillus a Lactococcus na úrovni rodu a obě tyto bakterie byly významně vyšší než u kontrolní skupiny (). Tyto výsledky tedy naznačují, že aplikace diety B. megaterium může zlepšit růst a aktivitu trávicích enzymů zrcadlového kapra Songpu a obohatit prospěšné druhové složení jeho hlavní střevní mikroflóry.

1. Úvod

Ryby jako jeden z hlavních zdrojů živočišných bílkovin hrají ve struktuře lidské potravy velmi důležitou roli. V posledních letech se však bezpečnost vodních produktů stala jedním z největších faktorů bránících rozvoji vodních produktů kvůli obavám o bezpečnost hormonů, antibiotik a nadměrného množství mikroorganismů . S rychlým rozvojem intenzivního chovu s vysokou hustotou se vodní prostředí v akvakultuře denně zhoršuje, což vede k propuknutí nemocí a dokonce k hromadným úhynům chovaných zvířat. Je naléhavě nutné najít ekologicky šetrné a bezpečné alternativy k zajištění zdravého růstu chovaných zvířat .

Jako nová přísada do krmiv po éře antibiotik jsou probiotika považována za důležitou náhradu krmných antibiotik . Studie ukázaly, že používání probiotik může nejen podpořit růst vodních živočichů a zlepšit míru jejich přežití, ale také snížit výskyt onemocnění vodních živočichů . Bacillus je saprofytická grampozitivní bakterie, která se běžně vyskytuje v chovatelském prostředí . Výzkum a použití bacilů v oblasti akvakultury přitahuje velkou pozornost. První aplikace probiotik v akvakultuře byla provedena vyrovnáváním bakteriální populace ve vodě a dosáhla dobrých výsledků . Některé studie ukázaly, že přidávání Bacillus subtilis do krmiva může nejen podpořit růst vodních živočichů a zlepšit aktivitu jejich trávicích enzymů a jejich nespecifickou imunitu, ale také zlepšit strukturu jejich střevní mikroflóry . V polovině 20. století se čínští vědci začali zabývat studiem Bacillus megaterium, přičemž se zaměřili především na screening kmenů, zejména na jejich schopnost rozkládat organické látky, jejich metabolismus dusíku a jejich využití jako probiotik při čištění odpadních vod z akvakultury .

Kapr obecný (Cyprinus carpio) je nejrozšířenějším druhem sladkovodních ryb v Číně a produkce kapra obecného v roce 2018 činila 2 962 218 t . Zrcadlový kapr Songpu (Cyprinus specularis Songpu), odrůda kapra obecného, tvoří stále větší podíl produkce díky svému relativně rychlejšímu růstu, lepší odolnosti vůči nemocem, vyšší míře přeměny masa a téměř nulovému výskytu šupin na povrchu těla . S rozšiřováním a podporou chovu s vysokou hustotou, zvyšující se frekvencí krmení a znečištěním vody jsou však problémy s bezpečností a kvalitou potravin stále závažnější.

Živiny patří mezi nejdůležitější a snadno regulovatelné faktory ovlivňující odolnost vodních živočichů. Potravinářská mikrobiologie zahrnuje mikroorganismy, které mají jak příznivé, tak škodlivé účinky na kvalitu a bezpečnost potravin, a mohou proto představovat riziko pro veřejné zdraví. V této studii jsme se zaměřili na vyhodnocení vlivu diety obalené B. megaterium na růst, aktivitu trávicích enzymů a diverzitu střevních mikroorganismů u zrcadlového kapra Songpu a na poskytnutí teoretického základu pro praxi zdravého a ekologického chovu ryb.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály a metody

2.2. Metody a metody chovu ryb Příprava potravy

B. megaterium bylo připraveno v naší laboratoři. Obsah B. megaterium byl . komerční krmivo bylo zakoupeno od společnosti Zhejiang AIPHA Feed Co, Ltd., Čína. Garantované hodnoty analýzy složení krmného produktu jsou uvedeny v tabulce 1. Fermentační bujón B. megaterium byl rovnoměrně nastříkán na povrch komerčního materiálu v množství 100 ml/kg a poté bylo nastříkané krmivo umístěno na 1 h na chladné místo, načež bylo použito jako krmivo pokusné skupiny. Kontrolní skupina byla krmena nezměněným komerčním krmivem.

2.2. Složení produktu. Krmný pokus

Zrcadlový kapr Songpu (Cyprinus specularis Songpu) (tělesná hmotnost ) byl získán z pokusné stanice Hulan Výzkumného ústavu rybářství na řece Heilongjiang v čínské provincii Heilongjiang (45,97° s. š., 126,63° v. d.). Ryby byly před pokusem 14 dní aklimatizovány v laboratorních podmínkách a adaptovány na kontrolní experimentální krmivo. Poté bylo vybráno 90 zdravých zrcadlových kaprů Songpu a náhodně rozděleno do dvou skupin (kontrolní skupina a experimentální skupina). Každé ošetření bylo provedeno ve třech opakováních a každé opakování mělo 15 ryb. Kontrolní skupina byla krmena komerčním krmivem. Pokusná skupina byla krmena komerčním krmivem obaleným B. megaterium. Denní množství krmiva činilo 3 % tělesné hmotnosti zrcadlového kapra Songpu, a to třikrát denně v 8:00, 12:00 a 19:00 hodin. Celé pokusné období trvalo 56 dní. Během experimentálního období byla laboratorní voda vyměňována o 1/3 objemu vody týdně. Během experimentálního období byla denně měřena kvalita vody (přístrojem YSI professional plus, Ohio State, USA), teplota vody se pohybovala v rozmezí 18 až 25 °C a k přidávání kyslíku byl 24 hodin denně používán vzduchový kompresor. Ryby byly váženy jak na začátku, tak na konci krmného pokusu.

2.3. Sběr vzorků

Před pokusem s krmením bylo z dočasné kultivační nádrže náhodně odebráno deset ryb a byla jim změřena počáteční tělesná hmotnost. Poté byl odebrán střevní trakt pro měření počáteční střevní mikroflóry (počáteční skupina). Na konci 56denního krmného pokusu, přibližně 24 hodin po posledním krmení, byly všechny ryby anestetizovány přípravkem MS-222 zředěným ve vodě v koncentraci 75 mg/l. Tyto ryby byly spočítány a zváženy za účelem stanovení míry přírůstku hmotnosti (WGR), specifické míry růstu (SGR) a míry konverze krmiva (FCR, tabulka 2) .

Po zjištění konečné hmotnosti všech ryb bylo náhodně vybráno pět ryb z každé nádrže a umístěno na ledovou desku pro rychlou pitvu. Vzorky tkání, včetně předního, středního a zadního střeva, byly odebrány aseptickými nůžkami, promyty aseptickým fyziologickým roztokem, zváženy a poté připraveny do homogenátu s aseptickým fyziologickým roztokem (1 : 4). Všechny vzorky byly okamžitě uloženy v mrazničce při teplotě -80 °C pro stanovení trávicích enzymů. Z každé nádrže bylo také náhodně odebráno dalších pět vzorků ryb. Než byly ryby převezeny do biočistírny, byl jejich povrch dezinfikován 75% alkoholem. Po další dezinfekci byla otevřena břišní dutina, vnější část střeva byla otřena 75 % alkoholem a čtyřikrát promyta sterilní vodou a poté byl odebrán střevní trakt pro konečné vyhodnocení střevní mikroflóry.

2.4. Střevní mikroflóra Stanovení trávicích enzymů

Před měřením indexů imunity byly sdružené přední, střední a zadní střevo ručně homogenizovány ve skleněném homogenizátoru s 0,86% NaCl (/), aby se získal 10% homogenát. Po odstředění (4000 ot./min., 10 min.) při 4 °C byl získán supernatant, který se skládal především ze surové enzymové tekutiny. Aktivity amylázy, proteázy a lipázy v předním střevě, středním střevě a zadním střevě byly analyzovány spektrofotometricky pomocí diagnostických reagenčních souprav (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Čína).

2.5 Analýza amylázy a lipázy v předním střevě, středním střevě a zadním střevě. Amplifikace genu 16S rRNA a sekvenování Illumina

Mikrobiální DNA byla extrahována ze střevních vzorků pomocí soupravy E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) podle protokolů výrobce. Konečná koncentrace a přečištění DNA byly stanoveny pomocí UV-vis spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA) a kvalita DNA byla stanovena elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Hypervariabilní oblasti V4-V5 bakteriálních genů 16S rRNA byly amplifikovány primery 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3) a 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) pomocí termocyklérového PCR systému (GeneAmp 9700, ABI, USA). PCR byla provedena pomocí následujícího programu: 3 minuty denaturace při 95 °C, 27 cyklů po 30 s při 95 °C, 30 s pro žíhání při 55 °C a 45 s pro elongaci při 72 °C a závěrečné prodloužení při 72 °C po dobu 10 minut. Výsledné produkty PCR byly extrahovány z 2% agarózového gelu a dále přečištěny pomocí soupravy pro extrakci DNA z gelu AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) a kvantifikovány pomocí QuantiFluor™-ST (Promega, USA) podle protokolu výrobce. Purifikované amplikony byly shromážděny v ekvimolárním množství a sekvenovány v párech () na platformě Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, USA) podle standardních protokolů společnosti Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Šanghaj, Čína) .

2.6. Statistická analýza

Operační taxonomické jednotky (OTU) byly shlukovány s mezní hodnotou podobnosti 97 % pomocí programu UPARSE (verze 7.1, http://drive5.com/uparse/) s novým „greedy“ algoritmem, který současně provádí filtrování chimér a shlukování OTU. Taxonomie každé sekvence genu 16S rRNA byla analyzována algoritmem RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) proti databázi SILVA 16S rRNA s použitím prahu spolehlivosti 70 %. K určení bohatosti společenstva byly zvoleny indexy Chao a ACE estimátoru a k určení diverzity společenstva byly použity indexy Shannon a Simpson . Všechny tyto indexy byly v našich vzorcích vypočteny pomocí QIIME (verze 1.7.0) a připraveny k zobrazení pomocí softwaru R (verze 2.15.3). Statistické analýzy byly provedeny pomocí statistického softwarového balíku SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Údaje jsou vyjádřeny jako podíl tří opakování. Data byla podrobena jednosměrné ANOVA, a pokud byly zjištěny rozdíly, byly průměry seřazeny pomocí Duncanova testu mnohonásobného porovnání. Rozdíly byly považovány za významné při hodnotě .

3. Výsledky

3.1. Vliv diety obalené B. megaterium na růst ryb

Jak ukazuje tabulka 2, míra přírůstku hmotnosti a specifická míra růstu u ošetřené skupiny (71,03 %, 0,42 % den-1, ) se významně zvýšily ve srovnání s kontrolní skupinou (52,75 %, 0,33 % den-1, ) a poměr konverze krmiva u ošetřené skupiny (1,28) byl významně nižší než u kontrolní skupiny (2,23, ). Během 56 dnů krmného pokusu nebyl pozorován žádný úhyn.

3.2. Vliv diety obalené B. megaterium na aktivitu trávicích enzymů

Vliv diety obalené B. megaterium na aktivitu trávicích enzymů je uveden v tabulce 3. Vliv diety obalené B. megaterium na aktivitu trávicích enzymů. Aktivita amylázy předního střeva v ošetřené skupině byla významně vyšší než v kontrolní skupině (). Aktivita amylázy středního a zadního střeva v ošetřené skupině byla významně vyšší než v kontrolní skupině, ale nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (). Aktivity proteázy předního, středního a zadního střeva v léčené skupině byly vyšší než v kontrolní skupině, ale nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (). Aktivita lipázy předního střeva u léčené skupiny byla významně vyšší než u kontrolní skupiny (). Aktivity lipázy středního a zadního střeva u léčené skupiny byly v podstatě stejné jako u kontrolní skupiny a nebyly mezi nimi žádné významné rozdíly ().

3.3. Aktivity trávicích enzymů ve střevě (přední střevo, střední střevo a zadní střevo). Vliv diety obalené B. megaterium na diverzitu a bohatost střevních mikrobů

Střevní mikrobiální diverzita zrcadlového kapra Songpu byla stanovena pomocí vysokokapacitního sekvenování. Průměrný počet OTU zjištěných z počátečního skupinového vzorku byl 63. Po 56 dnech byl průměrný počet OTU zjištěných v kontrolní a ošetřované skupině 114, resp. 196 OTU. Index pokrytí všech vzorků byl vyšší než 0,97, což svědčí o vysoké míře detekce. Jak ukazuje tabulka 4, indexy Chao a ACE, které odrážejí bohatost střevní mikroflóry zrcadlového kapra Songpu, byly po 56 dnech v ošetřované skupině významně vyšší než v kontrolní a původní skupině (). Shannonův index diverzity střevního společenstva byl v ošetřované skupině významně vyšší než v kontrolní skupině (). Simpsonův index diverzity střevního společenstva v ošetřované skupině byl významně nižší než v kontrolní skupině (). U výše uvedených čtyř indexů nebyly mezi kontrolní a výchozí skupinou zjištěny žádné významné rozdíly ().

3.4. Vliv stravy obalené B. megaterium na početnost a diverzitu střevní mikroflóry zrcadlového kapra Songpu. Vliv diety obalené B. megaterium na složení a změny hlavní mikroflóry ve střevě zrcadlového kapra Songpu

Pro statistiku uvedenou na obrázku 1 byla za hlavní mikroflóru považována střevní mikrobiální bohatost vyšší než 1 % na úrovni fyla. Dominantním fylem ve střevě původní skupiny byly před zahájením pokusu převážně Fusobacteria (86,36 %) a Bacteroidetes (8,60 %). Po 56denním krmném pokusu se počet hlavní střevní mikroflóry v každé skupině zvýšil. V kontrolní skupině byly dominantními fyly Fusobacteria (86,36 %), Bacteroidetes (14,4 %), Firmicutes (2,42 %) a Proteobacteria (1,37 %). V ošetřované skupině byly dominantními fyly Firmicutes (69,15 %), Proteobacteria (23,8 %), Bacteroidetes (4,65 %) a Actinobacteria (1,43 %). Pro statistické výpočty byla za hlavní mikroflóru považována střevní mikrobiální bohatost vyšší než 0,5 % na úrovni rodů, která je uvedena v tabulce 5. Ve výchozí skupině bylo pouze 5 rodů hlavních střevních mikroorganismů. Po 56denním krmném pokusu se počet hlavních střevních mikroorganismů v ošetřované skupině zvýšil na 11 rodů. Nejhojnějším mikroorganismem ve střevě zrcadlového kapra Songpu v počáteční skupině byla Cetobacterium. Po 56denním krmném pokusu byl nejhojnějším mikroorganismem v kontrolní skupině stále Cetobacterium. V kontrolní skupině bylo 11 dominantních rodů: Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified a Yersinia. Zrcadloví kapři Songpu krmeni dietou obalenou B. megaterium vykazovali zvýšené podíly střevních bakterií Bacillus a Lactococcus na úrovni rodů, které byly v obou případech významně vyšší než u kontrolní skupiny ().

Obrázek 1

Střevní mikrobiální složení na úrovni fylu u zrcadlového kapra Songpu krmeného dietou obalenou B. megaterium po dobu 56 dnů.

4. Diskuse

Probiotika, jako jsou bacily, se v akvakultuře široce používají. Některé studie ukázaly, že přídavek různých kmenů Bacillus spp. do krmiva pro larvy dosáhl dobrých výsledků a má dobrý podpůrný účinek na růst rybích larev . Přídavek bakterií (kmen CA2) jako doplňku krmiva ke xenickým larválním kulturám ústřice Crassostrea gigas trvale zlepšoval růst larev v různých ročních obdobích . Manipulace s mikrobiotou pomocí probiotik je uváděna jako záslužný postup v akvakultuře pro kontrolu nebo potlačení patogenních bakterií a pro zlepšení růstové výkonnosti a aktivity trávicích enzymů . Ve srovnání s neošetřenou kontrolní skupinou byla konečná hmotnost a přírůstek hmotnosti výrazně vyšší u krevet krmených směsí dvou probiotických kmenů . V této studii bylo zjištěno, že dieta obalená kmenem B. megaterium zvýšila hmotnostní přírůstky a specifickou rychlost růstu a snížila poměr konverze krmiva, což naznačuje, že dieta obalená kmenem B. megaterium může podpořit růst zrcadlového kapra Songpu. Podobné výsledky byly zjištěny u sumců Clarias sp., u kterých přídavek B. megaterium PTB 1.4 do krmiva výrazně zlepšil jejich růstovou rychlost . Podobné výsledky byly zjištěny také u Penaeus monodon, u něhož bylo po přídavku Bacillus cereus dosaženo vyšších hodnot FCR a SGR .

Probiotické bakterie jsou schopny produkovat trávicí enzymy, které pomáhají rybám využívat živiny v krmivu a trávit je . Přídavek B. megaterium k rostlinným proteinovým krmivům může podpořit vývoj střevní morfologie a zvýšit aktivitu trávicích enzymů . Studie probiotik pro kapra obecného Cyprinus carpio na základě růstové výkonnosti a aktivity trávicích enzymů ukázala, že průměrná aktivita trávicích enzymů všech skupin ošetřených probiotiky se významně lišila od kontrolní skupiny . V této studii měla dieta obalená B. megaterium pozitivní a významný vliv na aktivity trávicích enzymů, zejména amylázy a proteázy v předním, středním a zadním střevě. Podobné výsledky byly zjištěny také u tilapií, u kterých se po přidání Bacillus NP5 do jejich krmiva zlepšilo trávení a růst . Vyšší hladina enzymové aktivity získaná u diet s obsahem probiotik zlepšila trávení bílkovin, škrobu, tuku a celulózy, což by zase mohlo vysvětlovat lepší růst pozorovaný u diet s přídavkem probiotik . Trávicí enzymy pomáhají rybám rozkládat a trávit živiny v krmivu, což rybám usnadňuje vstřebávání živin v krmivu .

Pokroky ve vysoce výkonném sekvenování umožnily vytvořit rozsáhlý katalog metagenomických vzorků, který poskytuje přehled o rozmanitosti mikrobiálních druhů z nejrůznějších zdrojů, včetně oceánu, půdy a lidského těla. Tyto studie využívají jak sekvenování genu 16S rRNA k určení fylogenetických vztahů, tak komplexnější shotgun sekvenování k předpovědi podrobného druhového a genového složení . Index bohatosti a index diverzity jsou důležité indexy pro zjišťování rozmanitosti a složitosti mikroorganismů ve vzorcích . V této studii se s růstem zrcadlového kapra Songpu zvýšila diverzita a bohatost střevních mikroorganismů a indexy Chao a ACE, které odrážejí bohatost střevní mikroflóry zrcadlového kapra Songpu, byly v ošetřované skupině významně vyšší než v kontrolní skupině. Kromě toho byl Shannonův index diverzity střevního společenstva v ošetřované skupině významně vyšší než v kontrolní skupině. Podobně výsledky také ukázaly, že struktura střevní mikroflóry se změnila, když byli juvenilní tuponosí cejni krmeni dietou doplněnou různým množstvím Bacillus subtilis . Přídavek probiotik do krmiva může také změnit počet a strukturu původní mikroflóry ve střevním traktu Litopenaeus vannamei a podpořit komplexní interakce mezi mikrobiálními společenstvy ve střevním traktu Litopenaeus vannamei .

V této studii vykazovali zrcadloví kapři Songpu krmeni dietou obalenou B. megaterium zvýšený podíl střevních bakterií Bacillus a Lactococcus na úrovni rodu, které byly obě významně vyšší než u kontrolní skupiny. Výsledky také ukázaly, že složení a poměry hlavní mikrobioty ve střevě zrcadlového kapra Songpu lze změnit pomocí diety obalené B. megaterium. In conclusion, the use of B. megaterium-coated diets can significantly enhance fish growth and reduce feed conversion ratio, improve the activities of digestive enzymes, and enrich the beneficial genus composition of the main intestinal microflora.

Data Availability

Všechny údaje byly uvedeny v článku a další údaje již nejsou k dispozici.

Konflikty zájmů

Autoři prohlašují, že nemají žádné střety zájmů, které by museli zveřejnit.

Poděkování

Tato studie byla financována z účelových prostředků neziskových vědeckých výzkumných ústavů centrální úrovně (čj. HSY202005M), Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (č. QC2018038), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (č. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 a 2020TD56), National Key R&D Program of China (č. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 a 2020TD56), National Key R&D Program of China (č. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 a 2020TD56), Chinese Academy of Fishery Sciences (č. 2019YFD0900302) a Klíčová laboratoř sladkovodních vodních biotechnologií a chovu, Ministerstvo zemědělství a venkova, Výzkumný ústav rybářství v Heilongjiangu, Čínská akademie rybářských věd (č. FBB2017-04).