Delta-Delta Ct-metoden eller Livak-metoden er den mest foretrukne metode til analyse af qPCR-data. Den kan dog kun anvendes, når visse kriterier er opfyldt, og der henvises til forelæsningsnoterne for at sikre, at disse kriterier er opfyldt. Hvis ikke, anvendes en mere generaliseret metode kaldet Pfaffl-metoden. Læs venligst det supplerende læsemateriale for at få flere oplysninger om denne metode.
Her er trinene for Livak-metoden:
Excel-filen med alle beregningerne findes i mappen qPCR-analyse på Blackboard.
Du har rå Ct (antal cyklusser, der er nødvendige for at nå tærskelværdien) for normale og tumorceller (3 replikater for hver).
Normalisering¶
Først skal du beregne den relative forskel mellem genet af interesse (p53) og det husholdningsgen (GAPDH).
∆Ct = Ct (gen af interesse) – Ct (husholdningsgen)
Gennemsnit af kontrolprøverne (normale celler)¶
Som vi sammenligner vores tumor (behandling) med kontrol (normale celler), skal vi først beregne gennemsnittet af ∆Ct for de 3 kontrolprøver (normale celler).
Beregne ∆∆Ct i forhold til gennemsnittet af ∆Ct normal celler¶
∆∆Ct = ∆Ct (tumorprøve) – ∆Ct (normal gennemsnit)
Du kan også gøre dette med normale prøver. Brug $-tegn foran kolonnens nummer og rå bogstav (pile) for at fastgøre cellen.
Fold genekspression for hver prøve¶
Sørg for at hæve det negative ∆∆Ct til en potens af to.
Fold genekspression = 2^-(∆∆∆Ct)
Gennemsnitlig foldændring¶
Du kan beregne den gennemsnitlige foldændring for både tumor- og normalprøver. Forholdet mellem disse to er foldændringen mellem tumor- og normalprøver.
Logtransformation¶
For at udføre parametriske statistiske test såsom T-test anbefales det at transformere de endelige genekspressionsresultater til logværdier (en hvilken som helst logbase). Dette vil gøre datafordelingen symmetrisk.
Her har vi ændret 2^-(∆∆∆Ct) til log 10.
T-test¶
Det er nødvendigt at være forsigtig ved anvendelse af parametriske test, hvis data ikke er normalfordelte, da det vil føre til fejlagtige konklusioner.
Selekter log 10 af 2^-(∆∆Ct)-værdierne for normale og tumorprøver som angivet. Brug tohaletest (nummer 2) og antagelse om ulige varians (3).
Den resulterende P-værdi er mindre end 0,05, og derfor forkaster vi nulhypotesen, og to prøvegennemsnit er signifikant forskellige på 0,05-niveau.
