Effekten af Bacillus megaterium-belagt foder på vækst, fordøjelsesenzymaktivitet og intestinal mikrobiel diversitet hos Songpu spejlkarpe Cyprinus specularis Songpu

Abstract

Denne undersøgelse blev gennemført for at evaluere effekten af et Bacillus megaterium-belagt foder på vækstpræstationer, fordøjelsesenzymer og tarmens mikrobielle diversitet hos Songpu-spejlkarper (Cyprinus specularis Songpu). Fiskene blev manuelt fodret med to diæter (en kontroldiæt og en B. megaterium-belagt diæt) tre gange dagligt indtil tilsyneladende mæthed i 56 dage. Sammenlignet med kontrolgruppen forbedrede tilskuddet med B. megaterium-belagt foder fiskens vækst og reducerede foderomsætningsforholdet betydeligt (). Aktiviteterne af amylase og lipase i forboende tarm i behandlingsgruppen var signifikant højere end i kontrolgruppen (). Aktiviteterne af proteaser i for-, mellem- og baggut i behandlingsgruppen var alle højere end i kontrolgruppen (). Resultaterne af sekventering af 16S rDNA-generne i mikrobiotaen ved hjælp af highthroughput-sekventering viste, at diversiteten og rigeligheden af tarmmikrofloraen steg sammen med Songpu-spejlkarpernes vækst. Songpu-spejlkarper, der blev fodret med en diæt belagt med B. megaterium, udviste øgede andele af Bacillus og Lactococcus i tarmene på slægtsniveau, og begge dele var signifikant højere end i kontrolgruppen (). Disse resultater tyder derfor på, at anvendelse af B. megaterium i foderet kan forbedre væksten og fordøjelsesenzymaktiviteten hos Songpu-spejlkarper og berige den gavnlige genussammensætning af dens vigtigste tarmmikroflora.

1. Indledning

Fisk, som en af de vigtigste kilder til animalsk protein i kosten, spiller en meget vigtig rolle i menneskets fødevarestruktur. I de seneste år er sikkerheden af akvatiske produkter imidlertid blevet en af de største faktorer, der hindrer udviklingen af akvatiske produkter på grund af bekymringer om sikkerheden af hormoner, antibiotika og overdrevne mikroorganismer . Med den hurtige udvikling af intensivt opdræt med høj tæthed forringes vandmiljøet i akvakultursektoren dagligt, hvilket resulterer i sygdomsudbrud og endog massedød blandt opdrættede dyr. Der er et presserende behov for at finde miljøvenlige og sikre alternativer for at sikre en sund vækst af opdrættede dyr .

Som et nyt fodertilsætningsstof efter antibiotikaæraen anses probiotika for at være vigtige substitutter for foderantibiotika . Undersøgelser har vist, at brugen af probiotika ikke blot kan fremme vanddyrs vækst og forbedre deres overlevelsesrate, men også kan reducere forekomsten af sygdomme hos vanddyr . Bacillus er en saprofytær gram-positiv bakterie, der almindeligvis findes i avlsmiljøet . Forskning i og anvendelse af Bacillus inden for akvakultur har tiltrukket sig stor opmærksomhed. Den første anvendelse af probiotika i akvakultur blev gennemført ved at afbalancere bakteriepopulationen i vandet, og der blev opnået gode resultater . Nogle undersøgelser har vist, at tilsætning af Bacillus subtilis til foder ikke blot kan fremme væksten af vanddyr og forbedre aktiviteterne af deres fordøjelsesenzymer og deres uspecifikke immunitet, men også kan forbedre strukturen af deres tarmmikroflora . I midten af det 20. århundrede begyndte kinesiske forskere at studere Bacillus megaterium, primært med fokus på screening af stammer, især deres evne til at nedbryde organisk materiale, deres kvælstofmetabolisme og deres anvendelse som probiotika i akvakultur spildevandsbehandling .

Den almindelige karpe (Cyprinus carpio) er den mest udbredte dyrkede ferskvandsfiskart i Kina, og produktionen af almindelig karpe var 2.962.218 t i 2018 . Songpu-spejlkarpe (Cyprinus specularis Songpu), en sort af almindelig karpe, tegner sig for en stadig større del af produktionen på grund af dens relativt hurtigere vækst, bedre sygdomsresistens, højere kødkonverteringsgrad og næsten fravær af skæl på kropsoverfladen . Med udvidelsen og fremme af opdræt med høj tæthed, stigende fodringshyppighed og vandforurening er problemerne med fødevaresikkerhed og -kvalitet imidlertid blevet mere og mere alvorlige.

Næringsstoffer er blandt de vigtigste og let regulerbare faktorer, der påvirker vanddyrs modstandsdygtighed. Fødevaremikrobiologi omfatter mikroorganismer, der har både gavnlige og skadelige virkninger på fødevarekvalitet og -sikkerhed og derfor kan være af betydning for folkesundheden. I denne undersøgelse havde vi til formål at evaluere effekten af B. megaterium-belagte diæter på vækst, fordøjelsesenzymaktivitet og intestinal mikrobiel diversitet i Songpu-spejlkarper og at tilvejebringe et teoretisk grundlag for praksis for sundt og økologisk fiskeopdræt.

2. Materialer og metoder

2.1. Fremstilling af foder

B. megaterium blev fremstillet i vores laboratorium . Indholdet af B. megaterium var . Det kommercielle foder blev købt fra Zhejiang AIPHA Feed Co., Ltd., Kina. De garanterede værdier for analysen af foderproduktets sammensætning er vist i tabel 1. Gæringsbouillon af B. megaterium blev sprøjtet jævnt på overfladen af det kommercielle materiale i en mængde på 100 ml/kg, og derefter blev det sprøjtede foder anbragt på et køligt sted i 1 time, hvorefter det blev anvendt som forsøgsgruppens foder. Kontrolgruppen blev fodret med uforandret handelsfoder.

2.2. Fodringsforsøg

Songpu-spejlkarper (Cyprinus specularis Songpu) (kropsvægt ) blev indhentet fra Hulan Experimental Station of the Heilongjiang River Fisheries Research Institute i Heilongjiang-provinsen, Kina (45,97°N, 126,63°E). Fiskene blev akklimatiseret til laboratorieforholdene i 14 dage og vænnet til det eksperimentelle kontrolfoder før forsøget. Derefter blev 90 sunde Songpu-spejlkarper udvalgt og tilfældigt fordelt i to grupper (kontrolgruppe og forsøgsgruppe). Hver behandling blev udført i tre eksemplarer, og hver gentagelse bestod af 15 fisk. Kontrolgruppen blev fodret med kommercielt foder. Behandlingsgruppen blev fodret med kommercielt foder belagt med B. megaterium. Den daglige fodringsmængde var 3 % af Songpu-spejlkarpernes kropsvægt, tre gange om dagen kl. 08:00, 12:00 og 19:00. Hele forsøgsperioden var på 56 dage. I løbet af forsøgsperioden blev laboratorievandet udskiftet med 1/3 af vandmængden om ugen. Vandkvaliteten blev målt (ved hjælp af YSI professional plus, Ohio State, USA) dagligt i forsøgsperioden, vandtemperaturen lå mellem 18 og 25 °C, og der blev anvendt en luftkompressor til at tilføre ilt 24 timer om dagen. Fiskene blev vejet både ved starten og ved afslutningen af fodringsforsøget.

2.3. Prøveudtagning

Før fodringsforsøget blev der tilfældigt udtaget ti fisk fra det midlertidige kulturtank, og deres oprindelige kropsvægt blev målt. Derefter blev tarmkanalen indsamlet med henblik på måling af den oprindelige tarmmikroflora (initialgruppe). Ved afslutningen af det 56 dage lange fodringsforsøg, ca. 24 timer efter den sidste fodring, blev alle fisk bedøvet med MS-222 fortyndet i vandet i en koncentration på 75 mg/l. Disse fisk blev talt og vejet for at bestemme vægtøgningsraten (WGR), den specifikke vækstrate (SGR) og foderomsætningsgraden (FCR, tabel 2) .

Efter opnåelse af den endelige vægt af alle fisk blev fem fisk fra hvert akvarium tilfældigt udvalgt og anbragt i en isplade til hurtig dissektion. Vævsprøver, herunder for-, mellem- og baggut, blev indsamlet med en aseptisk saks, skyllet med aseptisk fysiologisk saltvand, vejet og derefter tilberedt til et homogenat med aseptisk fysiologisk saltvand (1 : 4). Alle prøver blev straks opbevaret ved -80 °C i en fryser med henblik på bestemmelse af fordøjelsesenzymer. Yderligere fem fisk blev også udtaget tilfældigt fra hvert akvarium. Fiskens overflader blev desinficeret med 75 % alkohol, inden fiskene blev bragt ind i et bioclean-rum. Efter yderligere desinfektion blev bughulen åbnet, tarmens yderside blev tørret af med 75 % alkohol og skyllet fire gange med sterilt vand, hvorefter tarmkanalen blev opsamlet med henblik på vurdering af den endelige tarmmikroflora.

2.4. Bestemmelse af fordøjelsesenzymer

Forud for måling af immunitetsindeksene blev den samlede for-, mellem- og bagtarm manuelt homogeniseret i en glashomogenisator med 0,86% NaCl (/) for at opnå et 10% homogenat. Efter centrifugering (4000 rpm, 10 min) ved 4°C blev supernatanten, der primært bestod af rå enzymvæske, opnået. Aktiviteterne af amylase, protease og lipase i for-, mellem- og bagtarmen blev analyseret spektrofotometrisk ved hjælp af diagnostiske reagenssæt (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Kina).

2.5. 16S rRNA-genforstærkning og Illumina-sekventering

Mikrobiel DNA blev ekstraheret fra tarmprøverne ved hjælp af E.Z.N.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) i henhold til producentens protokoller. Den endelige DNA-koncentration og rensning blev bestemt med et NanoDrop 2000 UV-vis-spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA), og DNA-kvaliteten blev bestemt ved hjælp af 1 % agarosegelelektroforese. De hypervariable V4-V5-regioner af bakteriernes 16S rRNA-gener blev amplificeret med primerne 515F (5-GTGCCAGAGCMGCCGCCGCGG-3) og 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) ved hjælp af et termocycler-PCR-system (GeneAmp 9700, ABI, USA). PCR’erne blev udført ved hjælp af følgende program: Det blev udført med følgende program: 3 min. denaturering ved 95 °C, 27 cyklusser af 30 s ved 95 °C, 30 s til annealing ved 55 °C og 45 s til elongation ved 72 °C og en sidste forlængelse ved 72 °C i 10 minutter. De resulterende PCR-produkter blev ekstraheret fra en 2 % agarosegel og yderligere oprenset ved hjælp af et AxyPrep DNA-gelekstraktionssæt (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) og kvantificeret ved hjælp af QuantiFluor™-ST (Promega, USA) i henhold til producentens protokol. Rensede amplikoner blev samlet i ækvimolære mængder og sekventeret i parvise ender () på en Illumina MiSeq-platform (Illumina, San Diego, USA) i henhold til standardprotokollerne fra Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, Kina) .

2.6. Statistisk analyse

Operationelle taksonomiske enheder (OTU’er) blev grupperet med en 97 % lighedsgrænse ved hjælp af UPARSE (version 7.1, http://drive5.com/uparse/) med en ny “greedy”-algoritme, der samtidig udfører chimærfiltrering og OTU-gruppering. Taxonomien for hver 16S rRNA-gensekvens blev analyseret ved hjælp af RDP Classifier-algoritmen (http://rdp.cme.msu.edu/) i forhold til SILVA 16S rRNA-databasen ved hjælp af en tillidstærskel på 70 %. Chao- og ACE-estimatorindeksene blev valgt til at identificere samfundets rigdom, og Shannon- og Simpson-indeksene blev anvendt til at identificere samfundets diversitet . Alle disse indekser i vores prøver blev beregnet med QIIME (version 1.7.0) og forberedt til visning med R-software (version 2.15.3). De statistiske analyser blev udført med den statistiske softwarepakke SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Dataene er udtrykt som tre gentagelser. Dataene blev underkastet envejs ANOVA, og når der blev fundet forskelle, blev midlerne rangordnet ved hjælp af Duncan’s multiple sammenligningstest. Forskelle blev betragtet som signifikante ved .

3. Resultater

3.1. Effekten af B. megaterium-belagt foder på fiskenes vækst

Som det fremgår af tabel 2, var vægtøgningsraten og den specifikke vækstrate i behandlingsgruppen (71,03%, 0,42% dag-1, ) signifikant forøget sammenlignet med kontrolgruppens (52,75%, 0,33% dag-1, ), og foderomsætningsgraden i behandlingsgruppen (1,28) var signifikant lavere end i kontrolgruppen (2,23, ). Der blev ikke observeret nogen dødelighed i løbet af de 56 dage, som fodringsforsøget varede.

3.2. Effekten af det B. megaterium-belagte foder på fordøjelsesenzymaktivitet

Effekten af det B. megaterium-belagte foder på fordøjelsesenzymaktiviteten er vist i tabel 3. Forspyt-amylaseaktiviteten i behandlingsgruppen var signifikant højere end i kontrolgruppen (). Amylaseaktiviteterne i midgut og baggut i behandlingsgruppen var signifikant højere end i kontrolgruppen, men der var ingen signifikante forskelle (). Proteaseaktiviteterne i for-, mellem- og bagtarmen i behandlingsgruppen var højere end i kontrolgruppen, men der var ingen signifikante forskelle (). Lipaseaktiviteten i forgårdslæben i behandlingsgruppen var signifikant højere end i kontrolgruppen (). Behandlingsgruppens lipaseaktiviteter i mellem- og bagtarmen var stort set de samme som i kontrolgruppen, og der var ingen signifikante forskelle ().

3.3. Effekten af diæt med B. megaterium-belagt foder på intestinal mikrobiel diversitet og rigdom

Den intestinale mikrobielle diversitet hos Songpu-spejlkarper blev bestemt ved hjælp af højtydende sekventering. Det gennemsnitlige antal OTU’er, der blev påvist fra den indledende gruppeprøve, var 63. Efter 56 dage var det gennemsnitlige antal OTU’er, der blev påvist i kontrol- og behandlingsgrupperne, henholdsvis 114 og 196. Dækningsindekset for alle prøver var over 0,97, hvilket indikerer, at der var en høj detektionsrate. Som det fremgår af tabel 4, var Chao- og ACE-indekset, som afspejler rigdommen af den intestinale mikroflora hos Songpu-spejlkarper, signifikant højere i behandlingsgruppen efter 56 dage end i kontrol- og initialgruppen (). Shannon-indekset for tarmsamfundets diversitet var signifikant højere i behandlingsgruppen end i kontrolgruppen (). Simpson-indekset for tarmsamfundets diversitet i behandlingsgruppen var signifikant lavere end i kontrolgruppen (). Der var ingen signifikante forskelle for de ovennævnte fire indekser mellem kontrol- og initialgruppen ().

3.4. Effekten af B. megaterium-belagt kost på sammensætningen og ændringer i hovedmikrobiotaen i tarmen hos Songpu-spejlkarper

En intestinal mikrobiel rigdom på mere end 1 % på phylumniveau blev taget som hovedmikrofloraen for de statistikker, der er præsenteret i figur 1. Det dominerende phylum i tarmen hos den oprindelige gruppe var overvejende Fusobakterier (86,36 %) og Bacteroidetes (8,60 %), før forsøget begyndte. Efter det 56-dages fodringsforsøg steg antallet af den vigtigste tarmmikroflora i hver gruppe. I kontrolgruppen var de dominerende fylaer Fusobacteria (86,36 %), Bacteroidetes (14,4 %), Firmicutes (2,42 %) og Proteobacteria (1,37 %). I behandlingsgruppen var de dominerende fylaer Firmicutes (69,15 %), Proteobacteria (23,8 %), Bacteroidetes (4,65 %) og Actinobacteria (1,43 %). En tarmmikrobiel rigdom på mere end 0,5 % på slægtsniveau blev taget som den vigtigste mikroflora til brug for de statistiske beregninger, der fremgår af tabel 5. Der var kun 5 slægter af de vigtigste tarmmikroorganismer i den oprindelige gruppe. Efter 56 dages fodringsforsøg steg de vigtigste tarmmikroorganismer til 11 slægter i behandlingsgruppen. Den hyppigst forekommende mikroorganisme i tarmen af Songpu-spejlkarper i den oprindelige gruppe var Cetobacterium. Efter 56 dages fodringsforsøg var den hyppigst forekommende mikroorganisme i kontrolgruppen stadig Cetobacterium. I kontrolgruppen var de 11 dominerende slægter Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified og Yersinia. Songpu-spejlkarper, der blev fodret med en diæt belagt med B. megaterium, udviste øgede andele af Bacillus og Lactococcus i tarmene på slægtsniveau, som begge var signifikant højere end i kontrolgruppen ().

4. Diskussion

Probiotika som f.eks. baciller er blevet anvendt i vid udstrækning i akvakultur. Nogle undersøgelser har vist, at tilsætning af forskellige stammer af Bacillus spp. til larvefoder har opnået gode resultater og har en god fremmende virkning på fiskelarvernes vækst . Tilsætning af bakterier (stamme CA2) som et kosttilskud til xeniske larvekulturer af østers Crassostrea gigas forbedrede konsekvent larvernes vækst på forskellige årstider . Manipulation af mikrobiotaen ved hjælp af probiotika er blevet rapporteret som en værdifuld praksis inden for akvakultur for at kontrollere eller hæmme patogene bakterier og forbedre vækstpræstationer og fordøjelsesenzymernes aktivitet . I sammenligning med den ubehandlede kontrolgruppe var slutvægten og vægtforøgelsen signifikant større hos rejer, der blev fodret med en blanding af to probiotiske stammefoder . I denne undersøgelse blev det konstateret, at en B. megaterium-belagt diæt øgede vægtforøgelsen og den specifikke væksthastighed og reducerede foderomsætningsforholdet, hvilket indikerer, at B. megaterium-belagte diæter kan fremme væksten af Songpu-spejlkarper. Lignende resultater blev fundet hos havkat Clarias sp., hvor tilsætning af B. megaterium PTB 1.4 til foderet forbedrede deres vækstrate betydeligt. Lignende resultater blev også fundet hos Penaeus monodon, hvor der blev opnået højere FCR- og SGR-værdier efter tilsætning af Bacillus cereus .

Probiotiske bakterier er i stand til at producere fordøjelsesenzymer, der hjælper fiskene med at udnytte foderets næringsstoffer og fordøje dem . Tilsætning af B. megaterium til planteproteinmåltider kan fremme tarmmorfologisk udvikling og øge fordøjelsesenzymaktiviteten . Undersøgelsen af probiotika til den almindelige karpe Cyprinus carpio baseret på vækstpræstationer og fordøjelsesenzymaktiviteter viste, at de gennemsnitlige fordøjelsesenzymaktiviteter for alle probiotiske behandlingsgrupper var signifikant forskellige fra kontrolgrupperne . I den foreliggende undersøgelse havde en B. megaterium-belagt diæt en positiv og vigtig virkning på fordøjelsesenzymaktiviteterne, især amylase- og proteaseaktiviteterne i for-, mellem- og bagtarmen. Lignende resultater blev også fundet hos tilapia, som viste en forbedring af fordøjelsen og væksten efter tilsætning af Bacillus NP5 til deres foder . Et højere niveau af enzymaktivitet opnået med diæter, der indeholdt probiotika, forbedrede fordøjelsen af protein, stivelse, fedt og cellulose, hvilket igen kan forklare den bedre vækst, der blev observeret med de probiotika-tilskudte diæter . Fordøjelsesenzymer hjælper fisk med at nedbryde og fordøje næringsstoffer i foderet, hvilket gør det lettere for fiskene at optage næringsstofferne i foderet .

Fremskridt inden for high-throughput sekventering har muliggjort et omfattende katalog af metagenomiske prøver, hvilket giver indsigt i diversiteten af mikrobielle arter fra en lang række kilder, herunder havet, jord og menneskekroppen. Disse undersøgelser bruger både 16S rRNA-gen-sekventering til at bestemme fylogenetiske relationer og mere omfattende shotgun-sekventering til at forudsige den detaljerede arts- og gensammensætning . Rigdomsindekset og diversitetsindekset er vigtige indekser til at påvise mikroorganismernes diversitet og kompleksitet i prøverne . I denne undersøgelse blev den intestinale mikrobielle diversitet og rigdom forøget med væksten af Songpu-spejlkarper, og Chao- og ACE-indekset, som afspejler rigdommen af den intestinale mikroflora hos Songpu-spejlkarper, var signifikant højere i behandlingsgruppen end i kontrolgruppen. Desuden var Shannon-indekset for tarmsamfundets diversitet i behandlingsgruppen signifikant højere end i kontrolgruppen. På samme måde viste resultaterne også, at tarmmikrofloraens struktur blev ændret, når unge stumpnæbbet brasen blev fodret med diæt suppleret med forskellige niveauer af Bacillus subtilis . Tilsætning af probiotika til foderet kan også ændre antallet og strukturen af den oprindelige mikroflora i tarmkanalen hos Litopenaeus vannamei og fremme de komplekse interaktioner mellem de mikrobielle samfund i tarmkanalen hos Litopenaeus vannamei .

I denne undersøgelse viste Songpu-spejlkarperne, der blev fodret med en diæt belagt med B. megaterium, øgede andele af intestinal Bacillus og Lactococcus på genusniveau, som begge var signifikant højere end i kontrolgruppen. Resultaterne viste også, at sammensætningen og proportionerne af de vigtigste mikrobiota i Songpu-spejlkarpernes tarm kan ændres med B. megaterium-coatede diæter. Konklusionen er, at brugen af B. megaterium-coatede diæter kan forbedre fiskens vækst betydeligt og reducere foderomsætningsforholdet, forbedre aktiviteterne af fordøjelsesenzymer og berige den gavnlige genussammensætning af den vigtigste tarmmikroflora.

Data tilgængelighed

Alle data blev leveret i artiklen, og der er ikke flere data, der skal uploades.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at oplyse.

Akkreditering

Denne undersøgelse blev finansieret af Central-Level Non-Profit Scientific Research Institutes Special Funds (no. HSY202005M), Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (nr. QC2018038), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (nr. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502, og 2020TD56), National Key R&D Program of China (nr. 2019YFD0900302) og Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (no. FBB2017-04).