Heparin-induceret trombocytopeni (HIT) – En fornuftig laboratorietilgang (forhåbentlig)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: January 28, 2020

Heparininduceret trombocytopeni (HIT) – en fornuftig laboratorietilgang (forhåbentlig)

Tilbage i 1980 blev jeg udsat for min første anmodning om en udredning af en lidelse, som jeg aldrig havde oplevet. En hæmatolog på vores institution kom ind med en anmodning om at se, om en patient på vores institution måske havde et tilfælde af heparininduceret trombocytopeni (HIT). Jeg havde aldrig hørt om sygdommen på det tidspunkt, så jeg måtte gå tilbage til den gamle måde at slå det op i Index Medicus (egentlige bøger) for at finde en reference. Jeg kunne ikke finde nogen laboratorieprocedurer på det tidspunkt i vores område, så jeg gik i gang med en mission for at få en metode valideret, så jeg kunne hjælpe denne læge med at behandle dette emne. Senere fandt jeg en metode ved hjælp af lystransmittansaggregometri (LTA). Ved denne procedure blev der anvendt normalt donorplade-rigt plasma (PRP) og patientdonorserum med flere koncentrationer af UFH for at kontrollere, om der var en aggregationsreaktion. Dette blev udført på et LTA Chronolog aggregometer med to kanaler. Jeg kan ikke give dig referencen, fordi Pubmed kun går tilbage til 1983 om emnet.

Derpå måtte jeg lære, hvad HIT var for noget. HIT er eftervirkningerne af et immunforsvar, der er en modsigelse eller et “paradoks” af reaktioner. Lægemiddelinduceret immuntrombocytopeni kan være forårsaget af medicin som kinin og vancomycin, der forårsager en øjeblikkelig og drastisk trombocytopeni (<20 x 109/L), som medfører alvorlige blødninger. En person med en ægte HIT-reaktion kan miste 50 % af sine blodplader begyndende efter starten af heparin efter en periode på 5 dage eller mere, men i stedet for hæmoragiske problemer udvikler vedkommende trombotiske problemer.

HIT er et immunreaktionsproblem forårsaget af IgG-antistoffer. Antistofferne udvikler sig som reaktion på ufraktioneret heparin (UFH) og heparin med lav molekylvægt (LMWH). Forekomsten som reaktion på UFH-behandling er 0,5-5 %. Ved LMWH-behandling er forekomsten af HIT en tiendedel af den, der observeres ved UFH.

HIT er en lidelse, der kræver, at lægen træffer hurtige beslutninger for at forhindre katastrofale konsekvenser for patienten. De kan bruge 4Ts-scoren sammen med blodpladetællinger til at vejlede dem om, hvorvidt de skal bestille laboratorieprøveprotokoller: 4Ts er et præ-test scoringssystem for HIT, som anvendes i vid udstrækning i klinisk praksis. Se nedenstående tabel. Titlen henviser til fire karakteristika ved HIT:

• Trombocytopeni
• Trombocytopeniens timing i forhold til heparineksponering
• Trombose eller andre følgesygdomme af HIT
• Sandsynlighed for andre årsager til trombocytopeni

Tabel. 4Ts-score

Funktion	Score
	2 point	1 point	0 point
Thrombocytopeni	>50% fald og plader nadir 20-100 × 109/L	30%-50% fald eller blodplader nadir 10-19× 109/L	< 30% fald eller plader nadir < 10×109/L
Tidspunkt for fald i antallet af blodplader	Klart debut på dag 5-10, eller ≤1 d, hvis heparineksponering inden for de seneste 30 d	Konsistent med faldet på dag 5-10, men ikke klart (f.eks. manglende trombocytetal); debut efter dag 10; eller fald ≤1 dag, hvis heparineksponering for 30-100 dage siden	Fald i antallet af blodplader ≤4 d uden nylig heparineksponering
Trombose eller andre følgevirkninger	Ny trombose (bekræftet); hudnekrose på heparininjektionssteder; anafylaktoid reaktion efter IV heparinbolus; binyrebarkblødning	Progressiv eller tilbagevendende trombose; erythematøse hudlæsioner; trombose mistænkt, men ikke påvist	Ingen
Andre årsager til trombocytopeni	Ingen åbenbar	Muligt	Ubestemt

Den maksimale score er 8. En score på 6-8 er udtryk for en høj sandsynlighed for HIT. En score på 4-5 er tegn på en mellemliggende tilstedeværelse af HIT, og en score på 0-3 er en lav mulighed for tilstedeværelse af HIT.3,4

Hvis der er mistanke om HIT på grund af en forhøjet 4Ts-score, vil laboratoriet hjælpe lægen med at stille en præcis diagnose. Dette kan opnås ved hjælp af en række analyser. De falder normalt i to klasser: immunologiske og funktionelle. De følgende oplysninger vil diskutere de test, der oftest anvendes i laboratorieundersøgelser for sygdommen.

Laboratoriediagnostiske test for HIT

HIT Immunoassay: Test til påvisning af anti-PF4/heparin-antistoffer

Enzymimmunoassays (EIA’er) (påviser IgG)

EIA (påviser polyspecifikke antistoffer)

Disse metoder er normalt PF4-afhængige med høj følsomhed. HIT-emner vil blive testet 97 % positive med fastfasekits. Disse er bredt tilgængelige i handlen. Metoderne er normalt batch-testet på grund af den lange varighed af denne metode. Svagt positive resultater kan dog have lav specificitet. Der bør opstilles retningslinjer for positivitet i de enkelte laboratoriemiljøer.

– IgG-specifik kemiluminescensassay (CLIA)

-A chemiluminescent immunoassay (CLIA) er en hurtig automatiseret procedure, der påviser anti-PF4/heparin-antistoffer ved hjælp af magnetiske partikler belagt med PF4/polyvinylsulfonat (PVS). Efter inkubation, magnetisk separation og et vasketrin tilsættes en sporstof bestående af et isoluminol-mærket antihuman IgG-antistof, som binder sig til anti-PF4/heparin-antistofferne på partiklerne. Reaktionen afsluttes med endnu en inkubation, magnetisk separation og vask. Der opnås en OD-aflæsning, der er proportional med koncentrationen af de målte anti-PF4/heparin-antistoffer. Testen udføres normalt på anmodning med en ekspeditionstid på ca. 30 minutter. I en undersøgelse, der sammenlignede denne metode med guld-standarden serotonin release assay (SRA), var testkorrelationerne fremragende med hensyn til specificitet og sensitivitet (henholdsvis 98,8/97,0 %).6

– Latex immunoturbidometrisk assay (LIA) for (HIT).

LIA er klassificeret som et immunoassay. Den adskiller sig fra de fleste andre immunoassays, f.eks. EIA’er, idet tilstedeværelsen af PF4/heparin-reaktive antistoffer i patientplasma resulterer i en hæmning af partikelagglutination gennem konkurrence med et HIT-mimikerende monoklonalt antistof. Derfor er LIA blevet kaldt et “funktionaliseret immunoassay”, hvilket i teorien antyder, at det kan give en diagnostisk specificitet, der ligger mellem det højt specifikke funktionelle assay, SRA, og de mindre specifikke PF4-afhængige EIA-metoder. Det er en let automatiseret procedure med en gennemløbstid på ca. 20 minutter. Undersøgelser har vist en følsomhed på 97,4 % og en specificitet på 91,2 %.7

Lateral flow Assay (STiC):

Lateral flow immunoassays påviser IgG-antistoffer mod PF4/polyanionkomplekser, der er indeholdt i et evalueringskort, hvor resultaterne aflæses visuelt. Med en inkubationstid på 10 minutter er dette en hurtig metode til at bestemme tilstedeværelsen af en HIT.

Funktionelle HIT-assays: Assays, der påviser antistoffer, der er i stand til at binde og aktivere trombocytter

Serotonin release assay (SRA) – Heparin-induceret trombocytaktiveringstest (HIPA) – Trombocytaggregationstest (PAT) – Flow cytometri-baserede assays.

Serotonin release assay (SRA): HIT-konfirmatorisk assay

Denne metode påviser trombocytaktiverende antistoffer. SRA måler det radiomærkede serotonin, der frigives fra blodpladerne.9,10 Et positivt resultat kræver > 20 % frigivelse af serotonin ved lav dosis UFH og < 20 % frigivelse ved høje UFH-niveauer. Denne metode har tidligere været almindeligt anerkendt som guldstandard for konfirmationstest. Den har en sensitivitets- og specificitetsgrad på 95 %. SRA opfanger påvisning af trombocytaktiverende antistoffer. Den har den højeste sensitivitet/specificitet for klinisk HIT. SRA har også en langt større diagnostisk specificitet end EIA. SRA bør ikke udføres uden et tidligere positivt EIA-resultat som en screeningstest. Dette vil hjælpe med at udelukke problemet med et falsk positivt SRA-resultat. Hvis der findes en negativ EIA i en prøve fra en forsøgsperson med en positiv SRA, bør dette være en “advarsel med rødt flag” om, at SRA-metoden skal evalueres.

SRA kan også give oplysninger om, hvorvidt en HIT-serumprøve kan give et stærkt trombocytrespons i fravær af heparin. Den heparinuafhængige trombocytaktivering er en advarsel om en ekstremt alvorlig forekomst af HIT. Dette fund kan indikere forsinket HIT og stærkt positiv HIT med tilstedeværelse af konsumptiv koagulopati med risiko for mikrovaskulær trombose.

Testen er kompleks, dyr og tidskrævende. Der kræves normale donortrombocytter (vanskelig at standardisere på grund af individuelle normale donorreaktioner). Derfor er det en relativt ustandardiseret test, der ikke anvendes i vid udstrækning.9,10

Heparin-induceret trombocytaktiveringsassay (HIPA):

Denne metode er en vasket trombocytaktiveringsassay, der typisk kun udføres i Europa. Dette assay udføres ved trombocytaggregation og bestemmes visuelt ved et slutpunkt for trombocytaktivering.10 Til sammenligning udføres SRA ved at teste trombocytter i en shaker og reageres i 60 minutter. HIPA adskiller sig ved at anvende omrørte trombocytter og aflæses visuelt med intervaller på 5 minutter i 45 minutter.

Nogle investigatorer har observeret, at HIPA-metoden er mere følsom til påvisning af trombocytaktiverende antistoffer end SRA-proceduren. Dette resultat kan imidlertid opsamle ikke-patogene antistoffer, hvilket fører til en nedsat diagnosespecificitet.6

Platelet Aggregation Assays

(LTA: light transmittance aggregometry)/WB: whole blood aggregometry):

Light-transmittance aggregometry (LTA) aggregometry (LTA) var den første test, der blev anvendt til at bestemme et kvalitativt trombocytrespons på HIT-antistoffer. Den udføres ved at placere normal donor-PRP og patient-PRP i en kuvette, der omrøres. Der tilsættes heparin til blandingen i forskellige koncentrationer, og aggregationen overvåges i 15 minutter. Hvis en prøve viser aggregation, tilsættes en højere koncentration af heparin for at bestemme det punkt, hvor aggregationen hæmmes. Dette gives en positiv eller negativ kvalitativ resultatbestemmelse: negativ, svagt positiv eller stærkt positiv (0, 2, 3). Denne test anvendes ikke længere på grund af den arbejdsmæssige intensitet og den relativt lave følsomhed.11

– Ved aggregometri af trombocytter med fuldblod (WB) anvendes en blanding af normale donortrombocytter og patientens fuldblod eller serum, afhængigt af det anvendte aggregometer. Hvis disse oplysninger ikke er kendt, bør donoren have blodtype O. Helbloddonor(er) bør prækvalificeres (ved hjælp af en HIT-positiv prøve) for at sikre, at prøven reagerer på antistoffet. Afhængigt af WB-metoden kan prøven udtages i et almindeligt 3,2 % natriumcitratrør eller i et særligt hirudinopsamlingsrør. Begge metoder anvender en form for impedansaggregometri.. Ved hver metode inkuberes heparin og blodprøver, og aggregationen observeres ved hjælp af impedansaggregometri. Prøver, der viser et aggregationsrespons, udfordres derefter med en højere koncentration af heparin, indtil der ikke konstateres nogen aggregation. WB-trombocytaggregometri betragtes som et kvantitativt assay og rapporteres som værdier fra 0-3, afhængigt af den heparinkoncentration, der kræves for at reducere den observerede aggregering.11

Flowcytometri for tilstedeværelse af HIT

Det trombocytære P-selectinekspressionsassay (PEA) anvendes til evaluering af HIT ved flowcytometri. Som vi diskuterede tidligere, er SRA-metoden den “guldstandard” for konfirmatorisk test for at genkende antistoffer, der kan genkende PF4 i en kompex med tilstedeværelse af heparin. Nogle patienter, der behandles med heparin uden tilstedeværelse af HIT, kan være positive for antistofferne. SRA er normalt kun tilgængelig på særlige referencelaboratorier. Metoden er tidskrævende, teknisk krævende og ekspansiv. Det er ikke muligt at opnå en hurtig ekspeditionstid, hvilket yderligere vil forsinke diagnosen for tilstedeværelsen af en HIT, som kræver øjeblikkelig behandling for at forhindre eventuelle livstruende problemer. I en nylig undersøgelse blev SRA-metoden evalueret i forhold til PEA-teknikken, som anvender et flowcytometriesystem. Testen anvender den PF4-afhængige P-selectin-ekspressionsanalyse PEA. Der blev foretaget en retrosoektuve undersøgelse af opbevarede serumprøver fra 91 personer. Alle de undersøgte patienter havde tidligere HIT 4Ts-informationer, som omfattede følgende: trombocytopeni, tidspunktet for tabet af trombocytmængden, en diagnose af trombose og enhver anden årsag til trombocytopeni. Alle forsøgspersoner med en mellemliggende 4Ts-score og en forhøjet PF4 EIA-test med en OD ≥2,0 eller en forhøjet 4Ts-score og en lavere PF4 EIA-test med en OK på ≥1,0 blev klassificeret som HIT-positive; andre prøver blev klassificeret som HIT-negative.

I denne undersøgelse havde PEA et højere diagnostisk resultat (areal under kurven på 0,92 vs 0,82;P-0,02) end SRA. Elleve ud af 16 serumprøver, der var PEA-positive og SRA-negative, var HIT-positive. Forfatterne anførte, at andre undersøgelser med prøver med lignende trombocytmarkører og prøver, der var serielt fortyndet s fra personer med bekræftede HIT-diagnoser, viste, at PEA er mere følsom end SRA for trombocytaktiverende antistoffer.

De konkluderede derfor, at PEA er enklere at udføre, og at resultaterne viste et mere præcist resultat ved diagnosticering af tilstedeværelsen af en HIT.13

Et andet flowcytometri-baseret assay er HITAlert fra IQ Products. I en undersøgelse fra 2013 blev der udviklet en protokol ved hjælp af HITAlert-flowcytometrimetoden til påvisning af HIT’er i et tertiært hospitalslaboratorium på et tertiært hospital. De sammenlignede 4Ts-scoren med henblik på at screene den mulige tilstedeværelse af en HIT hos 37 forsøgspersoner. Serum blev analyseret for tilstedeværelsen af HIT-antistoffer ved hjælp af HITAlert-flowcytometrimetoden og derefter sammenlignet med en antigenisk test. De sammenlignende metoder var partikelgel-immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab-assay og to funktionelle test. De anvendte Multiplate WBA-metoden (ikke tilgængelig i USA og Canada) og SRA-metoden. Deres resultater var som følger: Flowcytometri viste HIT-positive resultater hos 14 af de 37 patienter. I 4Ts score af lav (0 ud af 8), intermediær (5 ud af 19) og høj (9 ud af 10). Ved sammenligning med SRA havde flowmetoden en specificitet på 100 % og en sensitivitet på 81 % til at identificere tilstedeværelsen af en HIT. WBIA-funktionstesten havde også en sensitivitet på 81 % og en specificitet på 90 %, når den sammenlignes med flowcytometrianalysen. PaGIA-proceduren havde imidlertid kun en specificitet på 20 %, men en følsomhed på 20 %. Flowcytometri havde forbedret specificitet i forhold til den antigeniske procedure. Dette var mest fremtrædende i 4T-gruppen med intermediær risiko. Dette var tydeligt i alle 3 funktionelle metoder, der blev anvendt i protokollen. Investigatorerne konkluderede, at HITAlert flowcytometrimetoden kunne forbedre specificiteten for identifikation af en HIT uden at miste følsomhed.12 Denne assay er kun til forskningsbrug i USA og Canada og er ikke tilgængelig til diagnostiske procedurer.

Summary for HIT detection

Jeg vil gerne slutte med en algoritme, der er i reference #14 af Cuker et al, som anbefales til diagnosticering af HIT. Det er en diagnostisk algoritme med intermediær/høj 4Ts-score, efterfulgt af immunoassay, efterfulgt af funktionel testning, der resulterer i: – Få falsk negative resultater (manglende HIT-diagnoser) og – Få eller ingen falsk positive resultater (ukorrekte diagnoser af HIT).

Bemærkning: En funktionel test er muligvis ikke nødvendig for patienter i gruppen med høj sandsynlighed baseret på deres 4Ts-score og en meget stærkt positiv immunoassay (ELISA-værdi på > 2.0 OD-enheder).

Forekomsten af HIT-tilstedeværelse er en uønsket lægemiddelinteraktion, der modereres af trombocytaktiverende antistoffer, der er rettet mod PF4/heparinkomplekserne. Det er laboratoriets ansvar at bestemme de rette laboratorieanalyser til at identificere tilstedeværelsen eller og den funktionelle evne af de thee heparininducerede antistoffer til at aktivere trombocytter. Disse analyser skal udføres rettidigt for at hjælpe lægerne med at forebygge katastrofale trombotiske situationer.

1. Prince M, Wenham T. Heparin-induceret trombocytopaenia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Unfractionated heparin versus low molecular weight heparins for avoiding heparin-induced thrombocytopenia in postoperative patients. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Review. Opdateret i: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Prædiktiv værdi af 4Ts-scoringsystemet for heparininduceret trombocytopeni: en systematisk gennemgang og metaanalyse. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Evaluation of pretest clinical score (4 T’s) for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia in two clinical settings. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Kvantitativ fortolkning af målinger af optisk tæthed ved hjælp af PF4-afhængige enzymimmunoassays. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. Laboratoriediagnose af heparininduceret trombocytopeni. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Forbedring af den kliniske fortolkning af antipladefaktor 4/heparin enzyme-linked immunosorbent assay til diagnosticering af heparininduceret trombocytopeni ved hjælp af receiver operating characteristic analysis, stratum-specifikke likelihood ratios og Bayes-teorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratory testing protocols for heparin-inducd thrombocytopenia (HIT) testing. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. Test af serotoninfrigivelse i blodpladerne. Am J Hematol. 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? En omfattende nutidig undersøgelse af laboratorieprøver for heparininduceret trombocytopeni. Pathology. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital… Blood Coagul and Fibrinolysis. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. En ny PF4-afhængig trombocytaktiveringsassay identificerer patienter, der sandsynligvis vil få heparininduceret trombocytopeni/trombose. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).