Vores kunder hos Biotage har interessante og forskelligartede baggrunde, lige fra højt kvalificerede syntetiske kemikere til eksperter i naturproduktkemi og til dem, der lige er begyndt på deres rejse med kemi. Hvad jeg har lært i løbet af min mere end 40-årige karriere inden for kromatografiens “kunst” er, at der for mange af disse fine mennesker er en mangel på forståelse af kromatografiske principper. Jeg tror, at denne mangel på forståelse kun skyldes deres grundforløb, hvor separationsvidenskab bruges som et redskab under laboratoriearbejdet, men hvor principperne bag, hvorfor en blandings bestanddele adskilles (eller ikke adskilles), måske ikke forklares, forstås eller studeres effektivt.
Der findes fire grundlæggende typer af kromatografi, herunder:
- Gas-væske-kromatografi (GC)
- Væske-væske-kromatografi (LLC)
- Væske-fast-kromatografi (LSC)
- Size exclusion/gel permeationskromatografi (SEC/GPC)
I dette indlæg vil jeg fokusere på væske-fast-kromatografi.
Væske-fast-kromatografi
Dette er den mest populære af de ovenfor nævnte teknikker, fordi den er nyttig til separation af halvflygtige og ikke-flygtige forbindelser. Da der ikke kræves varme til at eluere forbindelser fra en separationskolonne (som ved GC), kræver væske-fast-kromatografi brug af et opløsningsmiddel eller en opløsningsmiddelblanding af blandbare opløsningsmidler med forskellig polaritet for at få prøvens kemiske komponenter til at adskille sig fra hinanden.
Med LSC indlæses prøven på et fast bærestof eller en stationær fase. Prøvens komponenter binder sig til den stationære fase, men i forskellig grad. Mængden af interaktion med den stationære fase styrer separationshastigheden og effektiviteten. Jo mere tiltrækning til den stationære fase, jo længere tid tager det for forbindelserne at eluere. For at hjælpe med at eluere de stærkt bundne forbindelser skal opløsningsmiddelforholdet ændres (stigende styrke) over tid.
Inden for LSC findes der flere forskellige kromatografiske teknikker …
- Papirkromatografi (PC)
- Tyndlagskromatografi (TLC)
- Høj-performance liquid chromatography (HPLC)
- Flash chromatography (FC)
- Ion exchange chromatography (IX)
- Affinity chromatography (AC)
- Chiral chromatography (CC)
- Supercritical fluid chromatography (SFC)
I dette indlæg vil jeg fokusere på flash chromatography, hvis principper er de samme som ved HPLC. Begge anvender kolonner fyldt med en stationær fase, som prøven sprøjtes ind i, og hvorigennem opløsningsmidlet pumpes. Flash-kromatografi anvender dog større kolonner end HPLC, som hovedsagelig er en analytisk separationsteknik.
Flash-kromatografi er en præparativ kromatografiteknik, hvis kolonner også er fyldt med en fast støtte eller et fast medie, der har en større partikelstørrelse end HPLC-kolonner. Disse forskelle i medie- og kolonnestørrelse gør det muligt for flash-kolonner at rense mere stof pr. gram medie end HPLC.
- Flash-kromatografi anvender mediepartikler på 15 µm til så højt som 60 µm
- HPLC anvender mediepartikler på 1,7 µm til 10 µm
Hvad sker der inde i kolonnen
De fleste flash-kromatografier og HPLC udføres ved hjælp af enten normalfase- eller reversed-phase-metode. Forskellene mellem disse metoder ligger i den stationære fasekemi og de opløsningsmidler, der anvendes til at adskille en blandings individuelle kemiske komponenter.
- Normalfase anvender ikke-polære og moderat opløsningsmidler (f.eks. hexan og ethylacetat) til den mobile fase og et polært medie (f.eks.f.eks. silica) som den stationære fase
- Omvendt fase er det stik modsatte, idet der anvendes polære opløsningsmidler og en upolær stationær fase
Med disse metoder, der er “polære” modsætninger af hinanden (ordspil tilsigtet), er elueringsrækkefølgen for de fleste forbindelser omvendt. Det er her, at kemien bag kromatografiske separationer sker.
Lad os fokusere på normalfasekromatografi indtil videre.
Normalfasekromatografi
Med normalfasekromatografi opløses de kemiske forbindelser, der indgår i en blanding (f.eks. reaktionsblanding, naturproduktekstrakt osv.), i et egnet opløsningsmiddel og injiceres i kolonnen. Når blandingen kommer i kontakt med den polære stationære fase, f.eks. silica, konkurrerer blandingens forbindelser og deres opløsningsmiddel med den mobile fase om silicaens bindingssteder. Jo mere polært kemikaliet er, desto stærkere tiltrækkes det af silicaen. Denne tiltrækning kaldes adsorption (forskellig fra absorption).
Absorption er det, der sker, når en svamp eller et papirhåndklæde interagerer med en væske. Adsorption er en kombination af fysiske og kemiske interaktioner, hvor silicaens polære overflade kemisk binder de kemiske komponenter, den kommer i kontakt med, hovedsagelig på grund af fænomener kendt som hydrogenbinding og van der Walls-kræfter.
Når et kemikalie interagerer med tørt silica (som det anvendes med en ny flashkolonne), sker der adsorption. Denne interaktion frigør varme, hvilket kan give problemer med stabiliteten af forbindelser og kromatografiske resultater. Af denne grund bliver silica-kolonner typisk equilibreret (forvædet) med et opløsningsmiddel med lav polaritet før prøveindføring. Opløsningsmidler med lav polaritet (f.eks. hexan, heptan, cyclohexan) er svage opløsningsmidler og adsorberes ikke godt af silica eller andre polære medier.
Silica’s overfladekemi er en blanding af hydroxylgrupper (silanoler) og silylethere, figur 1. Disse funktionelle grupper er polære, menes at være negativt ladede og adsorberer elektronmangelforbindelser. Aromatiske forbindelsers pi-skyer kan hydrogenbindes med silicaens hydroxylgrupper under adsorption.1
Figur 1. Kromatografisk silica’s kemi består af en blanding af silanoler og silyletherfunktionaliteter. Disse grupper binder sig til kemikalier gennem hydrogenbinding/adsorption.
For at sikre en god binding af prøvekomponenterne (adsorption) skal den prøve, der skal renses, enten opløses og fyldes i kolonnen i et svagt opløsningsmiddel (flydende fyldning) eller opløses i et stærkere (polært) opløsningsmiddel, blandes med et inert medie (f.eks. silica, kiselgur, diatoméjord), tørres og fyldes i en anden kolonne, der er placeret i linje med rensningskolonnen (tør fyldning). Tørbelastning eliminerer mange problemer, der opstår ved brug af flydende belastning, især med en prøve, der er opløst i et polært opløsningsmiddel.
Efter prøvebelastning indføres opløsningsmidlerne i den mobile fase. For at opnå en separation skal prøvekomponenterne imidlertid desorbere fra den stationære fase med forskellige hastigheder. Selv om dette kan opnås ved hjælp af et opløsningsmiddel med konstant polaritet (isokratisk eluering), opnås typisk en bedre oprensning ved hjælp af en mobil fase, der starter med lav polaritet og øger sin polaritet over tid. Dette er kendt som gradienteluering.
Med en gradient desorberes de forbindelser med større opløselighed i opløsningsmidlet med lav polaritet (forbindelser med lavere polaritet) først og passerer gennem kolonnen. Efterhånden som polariteten af opløsningsmidlet i den mobile fase øges, desorberes de adsorberede forbindelser fra mediet med forskellig hastighed baseret på deres opløselighed i den stadig mere polære mobile fase, figur 2.
Figur 2. Øverst – Ved isokratisk eluering (konstant polaritet af mobilfasen) desorberes stofferne langsommere end ved anvendelse af en gradient (nederst). Gradienteluering giver typisk en bedre separation/oprensning end isokratisk eluering.
En interessant egenskab ved normalfasekromatografi er, at når en forbindelse desorberes fra mediet, adsorberes den aldrig igen, fordi den stadig mere polære mobile fase fortrinsvis adsorberes i stedet for den.
Polaritetsforskelle (bindingsstyrke) mellem forbindelser kan være så subtile som tilføjelse af en anden funktionel gruppe, forskelle i placering af funktionelle grupper (Parida, 2006) som på en aromatisk ring, eller så tydelige som forbindelser med helt forskellige strukturer, figur 3.
Figur 3. Adskillelse af forbindelser med forskellige polariteter baseret på funktionel gruppetype og placering på molekylet. I elueringsrækkefølge – naphthalen (ingen polær funktionalitet), 1-nitronaphthalen, o-nitroanilin, m-nitroanilin, p-nitroanilin. Nitroanilinerne adskiller sig kun ved placeringen af den funktionelle nitrogruppe i forhold til aminen.
Så, for at opsummere, er normalfasekromatografiske separationer baseret på forskelle i forbindelsernes polaritet (både tydelige og subtile), deres tiltrækning til den stationære fase og deres opløselighed i den mobile fase. For at opnå de bedste rensningsresultater anbefales det at anvende TLC til solvent scouting.
Interesseret i at lære mere om flash-kromatografi kan du downloade vores whitepaper – Succesfuld flash-kromatografi.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
