PMC

Hvis man ønsker at vide, om en patients tumor vil reagere på en bestemt terapeutisk behandling, skal man undersøge den humane tumors reaktion på behandlingen, ikke en musetumor

Der er blevet udviklet talrige murinmodeller til at studere human cancer. Disse modeller anvendes til at undersøge de faktorer, der er involveret i malign transformation, invasion og metastase, samt til at undersøge respons på terapi. En af de mest udbredte modeller er den humane xenograft-tumor. I denne model transplanteres humane tumorceller, enten under huden eller i den organtype, som tumoren stammer fra, til immunsupprimerede mus, som ikke afstøder humane celler. F.eks. vil xenotransplantatet let blive accepteret af athymiske nøgenmus, SCID-mus (severely compromised immunodeficient) eller andre immunsupprimerede mus (Morton og Houghton, 2007). Afhængigt af antallet af injicerede celler eller størrelsen af den transplanterede tumor vil tumoren udvikle sig i løbet af 1-8 uger (eller i nogle tilfælde 1-4 måneder eller længere), og responsen på passende terapeutiske regimer kan undersøges in vivo. En anden type dyremodel til undersøgelse af kræft hos mennesker er den genetisk manipulerede musemodel (GEM). Disse mus’ genetiske profil ændres således, at et eller flere gener, som menes at være involveret i transformation eller malignitet, muteres, slettes eller overeksprimeres; efterfølgende undersøges virkningen af ændringerne af disse gener over tid, og terapeutiske reaktioner på disse tumorer kan følges in vivo. Både athymiske nøgenmus og xenograftmodeller af mus, der anvender humane tumorcellelinjer, har i årtier været anvendt til at øge vores forståelse af faktorer, der påvirker tumorvækst; nyere oplysninger om tumormikromiljøets centrale indflydelse på tumorudvikling og -vækst har imidlertid ført til større afhængighed af GEM-tumormodeller, hvor der anvendes immunkompetente mus, samt anvendelse af primære humane tumor xenografts i humaniserede musemodeller. Faktisk anses xenograftmodellerne ofte for at være ringere end GEM-modellerne. I denne artikel håber jeg at vise, at hver model har sin anvendelse i kræftdiagnostik og i prækliniske terapeutiske modaliteter.

Flere kriterier er for nylig blevet foreslået for GEM-modeller af humane kræftformer: (1) mus skal bære den samme mutation, der forekommer i menneskelige tumorer; (2) mutationer skal være konstrueret inden for det endogene locus og ikke udtrykt som et transgen; (3) muterede gener skal være tavse under embryogenese og tidlig postnatal udvikling, undtagen i modeller af arvelige pædiatriske tumorer; (4) mutationer skal være inden for de specifikke målvæv i udvalgte celletyper; og (5) mutationer skal forekomme i et begrænset antal celler. Yderligere “ønskede egenskaber” er, at tumortypen og anatomopatologien skal være så ens som muligt med det, der observeres i menneskelige tumorer, og at tumorudviklingen skal foregå gennem de samme eller lignende “præneoplastiske” stadier (M. Barbacid, Keystone Symposium on Inflamation, Microenvironment and Cancer, 2008, og personlig kommunikation). Et andet vigtigt kriterium, som er vanskeligt at opnå i GEM-modeller, er, at værts-/tumormiljøet skal kunne reproduceres i modellen. Selv om musetumormodeller med GEM er meget nyttige til at evaluere virkningerne af specifik mutation, deletion eller genamplifikation af et eller to gener under tumorudvikling i musetumorer, kan de normalt ikke fuldt ud gengive den genetiske kompleksitet i humane tumorer. F.eks. udviser maligne melanomer og andre tumortyper med en lignende grad af genetisk heterogenitet hos mennesker en omfattende grad af aneuploidi, og den specifikke tilvækst eller tab af gener varierer enormt fra den ene celle til den anden inden for den samme tumor. Selv om der er betydelige styrker ved denne model, er der således medfødte svagheder, som kan påvirke brugen af disse mus til at forudsige en patients respons på en terapi betydeligt.

Hvis man ønsker at vide, om en patients tumor vil reagere på en bestemt terapeutisk behandling, må man undersøge den menneskelige tumors respons på behandlingen, og ikke en musetumors. Det er her, at xenograft af menneskelige tumorer på athymiske nøgenmus, SCID-mus eller humaniserede mus med ikke-obesdiabetisk (NOD)/SCID-humaniserede mus kan være nyttige (fig. 1). Selv om nogle komponenter af immunsystemet mangler, når man vælger nude- eller SCID-musemodeller, er B-celler, dendritiske celler og granulocytter i athymiske nude-mus alle relativt intakte, og der er en kompenserende stigning i både natural killer (NK)-celleaktivitet og tumoricidale makrofager i disse mus. Desuden kan man hævde, at når disse metastaserende læsioner fjernes kirurgisk eller biopsieres, er tumoren allerede undsluppet immunovervågning og celleaflivning fra immuncellerne. I denne leder vil jeg diskutere fordele og ulemper ved humane tumor xenografts sammenlignet med GEM-modeller som en metode til at analysere patienters tumors potentielle respons på terapi (Fig. 1).

Der er flere vigtige fordele ved at bruge humane tumor xenografts til at undersøge terapeutiske responser på lægemidler: (1) man kan bruge det faktiske humane tumorvæv, der indeholder de komplekse genetiske og epigenetiske abnormiteter, der findes i den humane tumorpopulation; (2) humane tumor xenografts kan bruges til at hjælpe med udviklingen af individualiserede molekylære terapeutiske tilgange; (3) der kan opnås resultater i løbet af få uger fra en human tumorbiopsi med hensyn til respons på terapi, hvorimod GEM-modellerne ofte kræver op til et år at udvikle sig forud for lægemiddelbehandling; (4) flere terapier kan afprøves ud fra en enkelt tumorbiopsi; (5) data fra vævsmikroarrays og genetiske mikroarrays kan let indhentes fra den humane biopsi og xenograftvæv før og efter lægemiddelbehandling med henblik på omfattende analyser, før patienten udsættes for en behandling, der måske ikke virker; (6) ortotopiske xenografts kan placeres hensigtsmæssigt for at reproducere det organmiljø, som tumoren vokser i, således at tumorens virkning på dens mikromiljø kan moduleres, om end med undtagelse af visse T-cellepopulationer; (7) stroma fra det humane tumormikromiljø kan indgå i xenograftet for mere fuldstændigt at efterligne det humane tumormikromiljø; og (8) xenografts, der anvender NOD/SCID-mus, som er blevet “humaniseret” ved injektion af perifere blod- eller knoglemarvsceller, giver mulighed for en næsten fuldstændig rekonstruktion af immunresponset mod tumoren. Xenografts, der anvender humane cellelinjer til at afprøve lægemiddelrespons, korrelerer ofte ikke med klinisk aktivitet hos patienter (Kerbel, 2003). Når derimod primære tumorer anvendes som ortotopisk xenograft, er der en stærkere prædiktiv responsværdi, især når der anvendes en klinisk relevant lægemiddeldosis (Johnson et al., 2001; Kerbel, 2003; Scholz et al., 1990). Der er tre forskellige typer respons på terapi, som kan evalueres: effekt på tumorens væksthastighed, effekt på tumorskrumpning/regression og overlevelse. Effekten af et lægemiddel på tumorvæksthastigheden eller cytostase er ofte blevet rapporteret som værende mere forudsigende for et klinisk respons end tumorkrympning/regression (Kelland, 2004). Desuden er subkutane tumormodeller, som ikke er ortotoper og ikke repræsenterer passende steder for menneskelige tumorer, ikke forudsigelige, når de anvendes til at teste respons på lægemidler mod kræft (Killion et al., 1998). En udfordring ved ortotopiske modeller i forhold til subkutane modeller er vanskeligheden ved at følge tumorvæksten. Den nylige udvikling af nye teknikker til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og mikrobilleddannelse kan imidlertid minimere dette problem.

Der er flere andre ulemper og udfordringer ved at bruge xenograftmodellen med mus til at overvåge og/eller forudsige terapeutiske responser på kræft. Ortotopiske tumormodeller er tidskrævende, dyre og teknisk udfordrende. Hvis der anvendes athymiske nude- eller SCID-mus, går det lymfocytmedierede respons på tumoren desuden tabt, dvs. at nude-musene mister visse T-celle-responser, og SCID-musene mister både deres T- og B-celle-responser. Disse immunologiske mangler kan dog i princippet i vid udstrækning overvindes ved at transplantere humane tumorer på “humaniserede” NOD/SCID-mus. Dette reducerer i høj grad mange af ulemperne ved de ortotopiske humane tumor xenograftmodeller til undersøgelse af terapeutisk respons. Det er imidlertid ikke muligt at genoprette immunsystemet fuldstændigt i den “humaniserede mus”, da det fortsat er en udfordring at genoprette HLA klasse I- og klasse II-selekterende elementer i T-cellepopulationer (Bernard et al., 2008). Desuden skal de nyfødte mus bestråles for at kunne udføre disse forsøg og derefter podes med humane CD34+ hæmatopoietiske stamceller fra humant navlestrengsblod for at kunne udføre disse forsøg. Tidspunktet for fremskaffelse af navlestrengsblod, bestråling af nyfødte mus og verifikation af NOD/SCID-musenes humaniserede fænotype efter podning gør denne procedure ret besværlig, men meget værdifuld.

På trods af ulemperne ved xenograftmodellen med hensyn til forudsigelse af klinisk respons på terapi er der en række vigtige succeser. F.eks. reagerer xenografts af multiple myelomcellelinjer i syngene mus på proteasomhæmmeren bortezomib/VELCADE®, som har vist sig at være meget lovende til behandling af multipel myelom (LeBlanc et al., 2002; Moreau et al., 2008; Oyajobi og Mundy, 2003). Kombinationen af bortezomib og melphalen blev først vist som effektiv til behandling af multipel myelom i prækliniske xenograftforsøg, og dette førte til succes i kliniske forsøg, der blev efterfulgt af en anbefalet ny standard for klinisk behandling af patienter med multipel myelom over 65 år (Mateos et al., 2006; Mitsiades et al., 2003). Herceptin viste sig at øge anti-tumoraktiviteten af paclitaxel og doxorubicin mod HER2/neu-overudtrykkende humane brystkræft-xenografts, og dette førte til efterfølgende vellykkede kliniske forsøg (Baselga et al., 1998; Sporn og Bilgrami, 1999). Neutraliserende antistoffer, der er rettet mod vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) i kombination med paclitaxel, viste sig at være effektive til at hæmme tumorvækst og hæmme metastatisk spredning i en ortotopisk xenograft-model (Davis et al., 2004). Dette grundarbejde blev fulgt op af udviklingen af bevacizumab, et humaniseret monoklonalt antistof, der er rettet mod vaskulær endothelial vækstfaktor A (VEGF-A). Bevacizumab var effektivt i kliniske fase III-forsøg for kolorektal- og nyrekarcinom og blev godkendt af FDA i 2004 (Hurwitz et al., 2004; Yang et al., 2003). Desuden er xenograftmodeller af mus nyttige til at foregribe toksicitet fra målrettede terapier og i andre tilfælde til at identificere mulige prædiktive biomarkører for målmodulation. Selv om dette kun er nogle få eksempler på den vellykkede anvendelse af xenograftundersøgelser, er det klart, at for mange typer humane tumorer har de oplysninger, der er indhentet fra ortotopiske xenograftundersøgelser med mus med humane tumorer, ført til oplysninger, som er blevet omsat til vellykkede kliniske forsøg.

Fordelene ved GEM er, at: (1) musene er immunkompetente, således at tumormikromiljøet kan afspejles så meget som muligt i en murin tumormodel; (2) specifikke genetiske abnormiteter, der findes i humane tumorer, kan reproduceres på en inducerbar måde i specifikke aldre i den oprindelige vævstype; (3) stadierne af tumorudvikling kan studeres over tid; og (4) flere terapeutiske tilgange kan undersøges på forskellige stadier af tumorudviklingen. Genetiske modeller er også nyttige i humaniserede mus, hvor humane gener, f.eks. cytokrom P450-gener eller humane tumorantigener, udtrykkes i mus for at følge lægemiddelmetabolismen eller immunologiske reaktioner på tumoren (Talmadge et al., 2007). Ulemperne ved GEM er for det første, at den menneskelige tumors kompleksitet ikke kan efterlignes pålideligt, og for det andet er musetumorer ikke menneskelige tumorer, og de forudsiger ofte ikke, hvad der vil ske i den menneskelige tumor med hensyn til terapeutisk respons. Vi kan kurere mange musetumorer, men der er ikke en direkte korrelation mellem respons i musen og respons i klinikken.

Sammenfattende er både den ortotopiske xenograftmodel for menneskelige tumorer og GEM-modellerne nyttige til at øge vores forståelse af kræftudvikling og -behandling. Hver model har sine styrker og begrænsninger, idet den ortotopiske humane tumor xenograft er fremragende til at forudsige lægemiddelrespons i humane tumorer, og GEM-modellen er bedst til at undersøge specifikke geners rolle i tumorudvikling og -fremskridt. Uanset hvilken model der anvendes til at forudsige det kliniske respons hos patienterne, er det vigtigt at opnå mindst 50 % hæmning af tumorvæksten for at opnå et kvalificeret “respons” på behandlingen, og at anvende klinisk relevante doser af terapeutiske midler og overvåge overlevelsen. Desuden er det vigtigt at afgøre, om tumorvæksten vender tilbage, når lægemidlet afbrydes, og i givet fald om genvæksten sker hurtigere, når behandlingen sættes på pause sammenlignet med før behandlingen blev indledt. Hvis dette er tilfældet på trods af et eventuelt respons på lægemiddelbehandlingen, fraråder rebound-effekten brugen af den pågældende lægemiddelbehandlingsordning til tumortyper, der udviser en rebound-effekt. Konklusionen er, at vi ikke har ideelle murinmodeller af menneskelige tumorer, men må lære at fortolke vores data inden for rammerne af begrænsningerne i det anvendte assay.