Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) – Ein vernünftiger Laboransatz (hoffentlich)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Aufgerufen: 28. Januar 2020

Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) – Ein vernünftiger Laboransatz (hoffentlich)

Bereits 1980 wurde ich zum ersten Mal um eine Untersuchung bei einer Erkrankung gebeten, die ich noch nie erlebt hatte. Ein Hämatologe unserer Einrichtung kam mit der Bitte, zu prüfen, ob bei einem Patienten in unserer Einrichtung ein Fall von Heparin-induzierter Thrombozytopenie (HIT) vorliegen könnte. Zu diesem Zeitpunkt hatte ich noch nie von dieser Erkrankung gehört, so dass ich auf die alte Methode zurückgreifen musste, im Index Medicus (aktuelle Bücher) nachzuschlagen. Ich konnte damals in unserer Gegend keine Laborverfahren finden, also machte ich mich auf die Suche nach einer validierten Methode, um diesen Arzt bei der Behandlung dieses Themas unterstützen zu können. Später fand ich eine Methode, die Lichttransmissionsaggregometrie (LTA). Bei diesem Verfahren wurde normales plättchenreiches Spenderplasma (PRP) und Patientenserum mit verschiedenen UFH-Konzentrationen verwendet, um eine Aggregationsreaktion festzustellen. Dies wurde mit einem Zweikanal-LTA-Chronolog-Aggregometer durchgeführt. Ich kann Ihnen die Referenz nicht geben, da Pubmed nur bis 1983 zu diesem Thema zurückgeht.

Dann musste ich lernen, worum es bei HIT geht. HIT ist die Folge einer Immunreaktion, die ein Widerspruch in sich ist oder ein „Paradoxon“ von Reaktionen. Eine arzneimittelinduzierte Immunthrombozytopenie kann durch Medikamente wie Chinin und Vancomycin verursacht werden, die eine sofortige und drastische Thrombozytopenie (<20 x 109/L) hervorrufen, die schwere Blutungen verursacht. Eine Person mit einer echten HIT-Reaktion kann 50 % ihrer Thrombozyten ab dem Beginn der Heparineinnahme über einen Zeitraum von 5 Tagen oder mehr verlieren, aber anstelle von hämorrhagischen Problemen entwickeln sie thrombotische Probleme.

HIT ist eine Immunreaktion, die durch IgG-Antikörper verursacht wird. Die Antikörper entwickeln sich als Reaktion auf unfraktioniertes Heparin (UFH) und niedermolekulares Heparin (LMWH). Das Auftreten als Reaktion auf eine UFH-Therapie liegt bei 0,5-5 %. Bei einer LMWH-Therapie ist die Inzidenz von HIT ein Zehntel derjenigen, die bei UFH beobachtet wird.

HIT ist eine Erkrankung, bei der der Arzt schnelle Entscheidungen treffen muss, um katastrophale Folgen für den Patienten zu verhindern. Sie können den 4Ts-Score zusammen mit der Thrombozytenzahl als Richtschnur für die Anordnung von Labortestprotokollen verwenden: Der 4Ts-Score ist ein Pretest-Scoring-System für HIT, das in der klinischen Praxis weit verbreitet ist. Siehe die nachstehende Tabelle. Der Titel bezieht sich auf vier Merkmale von HIT:

• Thrombozytopenie
• Zeitpunkt der Thrombozytopenie im Verhältnis zur Heparinexposition
• Thrombose oder andere Folgeerscheinungen von HIT
• Wahrscheinlichkeit anderer Ursachen für Thrombozytopenie

Tabelle. 4Ts-Score

Feature	Score
	2 Punkte	1 Punkt	0 Punkte
Thrombozytopenie	>50% Abfall und Thrombozytennadir 20-100 × 109/L	30%-50% Abfall oder Thrombozytennadir 10-19× 109/L	< 30% Abfall oder Thrombozytennadir < 10×109/L
Zeitpunkt des Thrombozytenabfalls	Klarer Beginn an Tag 5-10, oder ≤1 Tag, wenn Heparin-Exposition innerhalb der letzten 30 Tage	Konsistent mit Abfall an Tag 5-10, aber nicht eindeutig (z. B. fehlende Thrombozytenzahlen); Beginn nach Tag 10; oder Abfall ≤1 Tag, wenn die Heparin-Exposition 30-100 Tage zurückliegt	Abfall der Thrombozytenzahl ≤4 Tage ohne kürzliche Heparin-Exposition
Thrombose oder andere Folgeerscheinungen	Neue Thrombose (bestätigt); Hautnekrose an Heparin-Injektionsstellen; anaphylaktoide Reaktion nach IV-Heparin-Bolus; Nebennierenblutung	Progressive oder rezidivierende Thrombose; erythematöse Hautveränderungen; Thrombose vermutet, aber nicht nachgewiesen	Keine
Andere Ursachen der Thrombozytopenie	Keine ersichtlich	Möglich	Unbestimmt

Die maximale Punktzahl ist 8. Eine Punktzahl von 6-8 deutet auf eine hohe Wahrscheinlichkeit einer HIT hin. Ein Wert von 4-5 deutet auf das Vorhandensein einer HIT mit mittlerer Wahrscheinlichkeit hin, und ein Wert von 0-3 bedeutet eine geringe Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein einer HIT.3,4

Wenn ein erhöhter 4Ts-Wert den Verdacht auf HIT nahelegt, unterstützt das Labor den Arzt bei der Erstellung einer genauen Diagnose. Dies kann durch eine Reihe von Tests erreicht werden. Sie lassen sich in der Regel in zwei Klassen einteilen: immunologisch und funktionell. In den folgenden Informationen werden die Tests erörtert, die bei der Laboruntersuchung auf die Erkrankung am häufigsten verwendet werden.

Labordiagnostische Tests für HIT

HIT-Immunoassay: Tests zum Nachweis von Anti-PF4/Heparin-Antikörpern

Enzymimmunoassays (EIA) (Nachweis von IgG)

EIA (Nachweis polyspezifischer Antikörper)

Diese Methoden sind in der Regel PF4-abhängig und haben eine hohe Empfindlichkeit. HIT-Patienten werden mit Festphasen-Kits zu 97 % positiv getestet. Diese sind im Handel erhältlich. Die Methoden werden in der Regel im Batch-Verfahren getestet, da es sich um ein langwieriges Verfahren handelt. Schwach positive Ergebnisse können jedoch eine geringe Spezifität aufweisen. In jedem Labor sollten Richtlinien für die Positivität festgelegt werden.

– IgG-spezifischer Chemilumineszenz-Assay (CLIA)

Ein Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) ist ein schnelles automatisiertes Verfahren zum Nachweis von Anti-PF4/Heparin-Antikörpern unter Verwendung von mit PF4/Polyvinylsulfonat (PVS) beschichteten magnetischen Partikeln. Nach Inkubation, magnetischer Trennung und einem Waschschritt wird ein Tracer, bestehend aus einem Isoluminol-markierten Anti-IgG-Antikörper, zugegeben, der sich an die Anti-PF4/Heparin-Antikörper auf den Partikeln bindet. Eine zweite Inkubation, magnetische Trennung und Waschen schließen die Reaktion ab. Man erhält einen OD-Wert, der proportional zur gemessenen Konzentration der Anti-PF4/Heparin-Antikörper ist. Die Tests werden in der Regel bei Bedarf mit einer Bearbeitungszeit von etwa 30 Minuten durchgeführt. In einer Studie, in der diese Methode mit dem Goldstandard-Serotonin-Freisetzungs-Assay (SRA) verglichen wurde, waren die Testkorrelationen in Bezug auf Spezifität und Sensitivität hervorragend (98,8/97,0 %).6

– Immunoturbidometrischer Latex-Assay (LIA) für (HIT).

LIA ist als Immunoassay klassifiziert. Er unterscheidet sich von den meisten anderen Immunoassays, wie z. B. EIAs, dadurch, dass das Vorhandensein von PF4/Heparin-reaktiven Antikörpern im Patientenplasma zu einer Hemmung der Partikelagglutination durch Konkurrenz mit einem HIT-nachahmenden monoklonalen Antikörper führt. Dementsprechend wurde der LIA als „funktionalisierter Immunoassay“ bezeichnet, was theoretisch darauf hindeutet, dass er eine diagnostische Spezifität bieten könnte, die zwischen dem hochspezifischen funktionalen Assay, SRA, und den weniger spezifischen PF4-abhängigen EIA-Methoden liegt. Es handelt sich um ein leicht automatisierbares Verfahren mit einer Durchlaufzeit von etwa 20 Minuten. Studien haben eine Sensitivität von 97,4 % und eine Spezifität von 91,2 % ergeben.7

Lateral flow Assay (STiC):

Lateral flow immunoassays weisen IgG-Antikörper gegen PF4/Polyanion-Komplexe nach, die in einer Auswertekarte enthalten sind, in der die Ergebnisse visuell abgelesen werden. Mit einer 10-minütigen Inkubationszeit ist dies eine schnelle Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins einer HIT.

Funktionelle HIT-Assays: Assays, die Antikörper nachweisen, die in der Lage sind, Thrombozyten zu binden und zu aktivieren

Serotonin-Freisetzungs-Assay (SRA) – Heparin-induzierter Thrombozyten-Aktivierungstest (HIPA) – Thrombozyten-Aggregationstest (PAT) – auf Durchflusszytometrie basierende Assays.

Serotonin-Freisetzungs-Assay (SRA): HIT-Bestätigungsassay

Mit dieser Methode werden Thrombozyten-aktivierende Antikörper nachgewiesen. Der SRA misst das von den Thrombozyten freigesetzte radioaktiv markierte Serotonin.9,10 Ein positives Ergebnis erfordert > 20 % Serotoninfreisetzung bei niedrig dosiertem UFH und < 20 % Freisetzung bei hohen UFH-Spiegeln. Diese Methode ist in der Vergangenheit allgemein als Goldstandard für Bestätigungstests anerkannt worden. Sie hat eine Sensitivität und Spezifität von 95 %. Der SRA erfasst den Nachweis von plättchenaktivierenden Antikörpern. Sie hat die höchste Sensitivität/Spezifität für klinische HIT. Die SRA hat auch eine weitaus höhere diagnostische Spezifität als der EIA. Die SRA sollte nicht ohne ein vorheriges positives EIA-Ergebnis als Screening-Test durchgeführt werden. Dies hilft, ein falsch positives SRA-Ergebnis auszuschließen. Wenn ein negativer EIA in einer Probe mit positivem SRA gefunden wird, sollte dies eine „rote Flagge“ sein, die darauf hinweist, dass die SRA-Methode evaluiert werden muss.

Die SRA kann auch Informationen darüber liefern, ob eine HIT-Serumprobe in Abwesenheit von Heparin eine starke Thrombozytenreaktion hervorrufen kann. Die heparinunabhängige Thrombozytenaktivierung ist ein Warnzeichen für das Vorliegen einer extrem schweren HIT. Dieser Befund könnte auf eine verzögert einsetzende HIT und eine stark positive HIT bei Vorliegen einer verbrauchenden Koagulopathie mit dem Risiko einer mikrovaskulären Thrombose hinweisen.

Der Test ist komplex, teuer und zeitaufwändig. Es werden normale Spenderthrombozyten benötigt (schwer zu standardisieren, da die Reaktionen der einzelnen Spender unterschiedlich sind). Daher handelt es sich um einen relativ unstandardisierten Test, der nicht weit verbreitet ist.9,10

Heparin-induzierter Thrombozyten-Aktivierungs-Assay (HIPA):

Dieses Verfahren ist ein gewaschener Thrombozyten-Aktivierungs-Assay, der normalerweise nur in Europa durchgeführt wird. Dieser Test wird durch Thrombozytenaggregation durchgeführt und visuell durch einen Endpunkt der Thrombozytenaktivierung bestimmt.10 Im Vergleich dazu wird der SRA durchgeführt, indem die Thrombozyten in einem Schüttler getestet werden und 60 Minuten lang reagieren. Die HIPA-Methode unterscheidet sich von der SRA dadurch, dass sie gerührte Thrombozyten verwendet und 45 Minuten lang in 5-Minuten-Intervallen visuell abgelesen wird.

Einige Forscher haben festgestellt, dass die HIPA-Methode empfindlicher für den Nachweis thrombozytenaktivierender Antikörper ist als das SRA-Verfahren. Dabei werden jedoch möglicherweise nicht-pathogene Antikörper erfasst, was zu einer geringeren Diagnosespezifität führt.6

Plättchenaggregationsassays

(LTA: Lichttransmissionsaggregometrie)/WB: Vollblutaggregometrie):

Die Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) war der erste Assay, der zur Bestimmung einer qualitativen Thrombozytenantwort auf HIT-Antikörper verwendet wurde. Bei diesem Test werden normales Spender-PRP und Patienten-PRP in eine Küvette gegeben, die gerührt wird. Der Mischung wird Heparin in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, und die Aggregation wird 15 Minuten lang überwacht. Wenn eine Probe eine Aggregation aufweist, wird eine höhere Heparinkonzentration zugegeben, um den Punkt zu bestimmen, an dem die Aggregation gehemmt wird. Dies führt zu einer positiven oder negativen qualitativen Ergebnisbestimmung: negativ, schwach positiv oder stark positiv (0, 2, 3). Dieser Test wird aufgrund des hohen Arbeitsaufwands und der relativ geringen Empfindlichkeit nicht mehr verwendet.11

– Bei der Thrombozytenaggregometrie mit Vollblut (WB) wird eine Mischung aus normalen Spenderthrombozyten und Vollblut oder Serum des Patienten verwendet, je nach verwendetem Aggregometer. Wenn diese Information nicht bekannt ist, sollte der Spender die Blutgruppe O haben. Der/die Vollblutspender sollte(n) präqualifiziert werden (unter Verwendung einer HIT-positiven Probe), um sicherzustellen, dass die Probe auf den Antikörper reagiert. Je nach WB-Methode kann die Probe in einem normalen 3,2%igen Natriumcitrat-Röhrchen oder in einem speziellen Hirudin-Entnahmeröhrchen entnommen werden. Beide Methoden verwenden eine Form der Impedanzaggregometrie. Bei beiden Methoden werden Heparin und Blutproben inkubiert und die Aggregation mittels Impedanzaggregometrie beobachtet. Alle Proben, die eine Aggregationsreaktion zeigen, werden dann mit einer höheren Heparinkonzentration behandelt, bis keine Aggregation mehr festgestellt wird. Die WB-Thrombozytenaggregometrie gilt als quantitativer Test und wird mit Werten zwischen 0 und 3 angegeben, je nachdem, welche Heparinkonzentration erforderlich ist, um die beobachtete Aggregation zu verringern.11

Durchflusszytometrie für das Vorhandensein von HIT

Der Thrombozyten-P-Selektin-Expressions-Assay (PEA) wird zur Bewertung von HIT mittels Durchflusszytometrie verwendet. Wie bereits erwähnt, ist die SRA-Methode der „Goldstandard“ für Bestätigungstests zur Erkennung von Antikörpern, die PF4 in einem Kompex mit dem Vorhandensein von Heparin erkennen können. Bei einigen Patienten, die mit Heparin behandelt wurden, ohne dass eine HIT vorlag, können die Antikörper positiv sein. Der SRA ist in der Regel nur in speziellen Referenzlabors erhältlich. Die Methode ist zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und umfangreich. Eine schnelle Durchlaufzeit ist nicht möglich, was die Diagnose einer HIT weiter verzögert, die eine sofortige Behandlung erfordert, um mögliche lebensbedrohliche Probleme zu verhindern. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde die SRA-Methode mit der PEA-Technik verglichen, die ein Durchflusszytometriesystem verwendet. Der Assay verwendet den PF4-abhängigen P-Selektin-Expressionsassay der PEA. Eine retrospektive Studie wurde mit gelagerten Serumproben von 91 Probanden durchgeführt. Alle untersuchten Patienten verfügten über frühere HIT-4Ts-Informationen, die Folgendes umfassten: Thrombozytopenie, Zeitpunkt des Thrombozytenverlusts, eine Thrombosediagnose und jeden anderen Grund für eine Thrombozytopenie. Alle Probanden mit einem mittleren 4Ts-Score und einem erhöhten PF4-EIA-Test mit einem OD ≥2,0 oder einem erhöhten 4Ts-Score und einem niedrigeren PF4-EIA-Test mit einem OK von ≥1,0 wurden als HIT-positiv eingestuft; die anderen Proben wurden als HIT-negativ klassifiziert.

In dieser Studie hatte die PEA ein höheres diagnostisches Ergebnis (Fläche unter der Kurve von 0,92 gegenüber 0,82; P-0,02) als die SRA. Elf von 16 Serumproben, die PEA-positiv und SRA-negativ waren, waren HIT-positiv. Die Autoren erklärten, dass andere Studien, in denen Proben mit ähnlichen Thrombozytenmarkern und seriell verdünnte Proben von Probanden mit bestätigter HIT-Diagnose verwendet wurden, gezeigt haben, dass der PEA empfindlicher als der SRA für plättchenaktivierende Antikörper ist.

Sie kamen daher zu dem Schluss, dass der PEA einfacher durchzuführen ist und die Ergebnisse ein genaueres Ergebnis bei der Diagnose des Vorhandenseins einer HIT zeigen.13

Ein weiterer auf Durchflusszytometrie basierender Assay ist der HITAlert von IQ Products. In einer Studie aus dem Jahr 2013 wurde ein Protokoll entwickelt, das die HITAlert-Durchflusszytometrie-Methode zum Nachweis von HITs in einem Krankenhauslabor der Tertiärversorgung verwendet. Sie verglichen den 4Ts-Score, um das mögliche Vorhandensein einer HIT bei 37 Probanden zu überprüfen. Das Serum wurde mit der HITAlert-Durchflusszytometrie-Methode auf das Vorhandensein von HIT-Antikörpern untersucht und anschließend mit einem Antigen-Assay verglichen. Bei den Vergleichsmethoden handelte es sich um den Partikelgel-Immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab Assay und zwei funktionelle Tests. Sie verwendeten den Multiplate WBA (in den USA und Kanada nicht erhältlich) und die SRA-Methode. Ihre Ergebnisse waren wie folgt: Die Durchflusszytometrie zeigte bei 14 der 37 Patienten positive HIT-Ergebnisse. Bei den 4Ts waren die Werte niedrig (0 von 8), mittel (5 von 19) und hoch (9 von 10). Im Vergleich zur SRA wies die Durchflussmethode eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 81 % für das Vorliegen einer HIT auf. Der WBIA-Funktionstest hatte im Vergleich zur Durchflusszytometrie-Analyse ebenfalls eine Sensitivität von 81 % und eine Spezifität von 90 %. Das PaGIA-Verfahren hatte jedoch nur eine Spezifität von 20 %, aber eine Sensitivität von 20 %. Die Durchflusszytometrie wies eine höhere Spezifität als das Antigenverfahren auf. Am deutlichsten war dies bei der 4T-Gruppe mit mittlerem Risiko. Dies war bei allen 3 im Protokoll verwendeten funktionellen Methoden zu beobachten. Die Forscher kamen zu dem Schluss, dass die HITAlert-Durchflusszytometrie-Methode die Spezifität der Identifizierung einer HIT verbessern kann, ohne an Sensitivität zu verlieren.12 Dieser Test ist nur für Forschungszwecke in den USA und Kanada bestimmt und steht nicht für diagnostische Verfahren zur Verfügung.

Zusammenfassung für die HIT-Erkennung

Ich möchte mit einem Algorithmus schließen, der in der Referenz #14 von Cuker et al. enthalten ist und für die Diagnose von HIT empfohlen wird. Es handelt sich um einen diagnostischen Algorithmus mit einem mittleren/hohen 4Ts-Score, gefolgt von einem Immunoassay, gefolgt von einem Funktionstest, der zu folgenden Ergebnissen führt: – Wenige falsch-negative Ergebnisse (verpasste HIT-Diagnosen) und – Wenige oder keine falsch-positiven Ergebnisse (falsche HIT-Diagnosen).

Hinweis: Ein Funktionstest ist bei Patienten in der Gruppe mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund ihres 4Ts-Scores und eines sehr stark positiven Immunoassays (ELISA-Wert von > 2.0 OD-Einheiten).

Das Auftreten von HIT ist eine unerwünschte Arzneimittelinteraktion, die durch plättchenaktivierende Antikörper, die auf die Komplexe von PF4/Heparin abzielen, moderiert wird. Es liegt in der Verantwortung des Labors, die geeigneten Labortests zu bestimmen, um das Vorhandensein und die funktionelle Fähigkeit der Heparin-induzierten Antikörper zur Aktivierung von Blutplättchen festzustellen. Diese Tests müssen rechtzeitig durchgeführt werden, um Ärzte bei der Vermeidung katastrophaler thrombotischer Situationen zu unterstützen.

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