Jenseits von COX-1: Die Auswirkungen von Aspirin auf die Biologie der Blutplättchen und mögliche Mechanismen der Chemoprävention

Die Blutplättchen spielen eine entscheidende Rolle bei der Hämostase, der Thrombose und der Aufrechterhaltung der Integrität der Blutgefäße. Eine unzureichende Regulierung der Thrombozytenaktivität kann zu unangemessenen Blutungen führen, während eine übermäßige Aktivität zu Thrombose und akuten ischämischen Ereignissen führt. Der Gerinnungsprozess wird durch membranständige Glykoproteine und Rezeptoren reguliert, die die Gerinnungskaskade nach Bindung exogener Effektoren wie Adenosindiphosphat (ADP), Thromboxan A2 (TXA2), Serotonin, Kollagen, Thrombin und Epinephrin auslösen. Die grundlegende Abfolge der Thrombozytenaggregation erfolgt in drei Schritten: Initiation, Extension und Stabilisierung. In der Initiationsphase werden Thrombozyten an exponierte von Willebrand-Faktor (vWF)/Kollagen-Komplexe gebunden und verbleiben lange genug am Ort der Gefäßverletzung und der Reaktion, um eine weitere Aktivierung durch Kollagen auszulösen. Die Verstärkung ist durch eine zweite Welle der Sekretion und Aggregation gekennzeichnet und wird durch die von den Thrombozyten vermittelte Freisetzung von Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP) und Thromboxan A2 (TXA2) weiter verstärkt. Die zweite Welle markiert auch die Ausdehnungsphase, in der neu ankommende Thrombozyten an der ursprünglichen Thrombozyten-Monoschicht haften. Nach der Interaktion zwischen Proteinrezeptor und Effektor aggregieren die aktivierten Thrombozyten weiter und bilden Brücken zwischen Oberflächenglykoproteinen, Fibrinogen, Fibrin und vWF zu aktivierten Glykoproteinen. Diese Stabilisierungsphase umfasst nachfolgende Signalisierungsereignisse bei der Thrombozytenpfropfenbildung, die eine Konsolidierung des Thrombozytenaggregats ermöglicht, um seine Dispersion durch Scherkräfte im zirkulierenden Blut zu verhindern.

Die Signalgebung bei der Thrombozytenaggregation beginnt mit der Aktivierung der Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche durch Agonisten wie Kollagen, Thrombin, ADP, TXA2 und Epinephrin. Die Aktivierung dieser GPCR-Rezeptoren führt zur Aktivierung von Phospholipase A2, die Phosphotidylcholin und andere Membranphospholipide spaltet und dabei Arachidonat aus der C2-Position des Glycerin-Rückgrats freisetzt. Arachidonat kann in eine Vielzahl von Prostaglandinen (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α) umgewandelt werden, die die entzündungsfördernde Reaktion vermitteln. Darüber hinaus induzieren Thromboxane wie TXA2 die Freisetzung, Aggregation und Gerinnung von Blutplättchen und verstärken die Aktivierung der zirkulierenden Blutplättchen. Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase-1 (PGSH-1)/Cyclooxygenase-1 (COX-1) führt die anfänglichen Cyclooxygenase- und Peroxidase-Reaktionen durch, um Arachidonsäure in die Vorläufermetaboliten Prostaglandin G2 und Prostaglandin H2 umzuwandeln. Diese werden chemisch weiterverarbeitet, um andere Prostaglandine zu erzeugen, darunter TXA2, das den Großteil der von den Blutplättchen ausgelösten Reaktion vermittelt. Eine Zusammenfassung der Signalereignisse während der Thrombozytenaktivierung ist in Abb. 3 dargestellt.

Aspirin moduliert die Thrombozytenaktivität und -biologie – Hemmung der Cyclooxygenase

Aspirin hemmt die Thrombozytenaggregation und die Prostaglandinfreisetzung. Frühe Studien mit Aspirin, das am Acetatcarbonylkohlenstoff mit 14C radioaktiv markiert wurde, zeigten, dass <0,1 % des 14C-Radiolabels von den Thrombozyten aufgenommen wurde und dass die Aktivität vorwiegend mit drei Proteinen assoziiert war. Obwohl die Assoziation irreversibel war, was auf die Bildung einer kovalenten Bindung hindeutet, erwies sie sich bei biologisch relevanten Konzentrationen nur für ein einziges 85 kDa-Protein als sättigbar. Die beiden anderen löslichen Thrombozytenproteine zeigten eine nicht sättigbare Acetylierung, was darauf hindeutet, dass die Aspirin-abhängige Acetylierung in Thrombozyten sowohl spezifisch als auch unspezifisch ist. Das acetylierte 85 kDa-Enzym wurde später als Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase-1 (PTGS-1/COX-1) identifiziert. Die Hemmung von COX-1 in Blutplättchen durch Acetyltransfer ist irreversibel und wird während der gesamten 10-tägigen Lebensdauer des Blutplättchens aufrechterhalten.

COX-1 ist ein bifunktionelles Enzym, das in den meisten Geweben konstitutiv exprimiert wird und zwei verschiedene, aufeinanderfolgende Reaktionen an räumlich getrennten, aber mechanistisch gekoppelten aktiven Stellen ausführt. In normalen Zellen ist COX-1 membrangebunden und in der luminalen Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums sowie in der inneren und äußeren Oberfläche der Kernhülle eingebettet. Thrombozyten hingegen sind kernlose Zellfragmente und exprimieren COX-1-Proteine in einem dichten röhrenförmigen Membransystem, das während der Thrombozytenbiogenese aus dem demarkierten Membransystem hervorgeht. Dieses dichte röhrenförmige Membransystem spielt eine wichtige Rolle bei der Thrombozytenaktivierung und ist der wichtigste Ort für die Eicosanoidsynthese in Thrombozyten. Das 85 kDa große COX-1-Homodimer enthält 576 Reste und ist an verschiedenen Lysinseitenketten glykosyliert. Obwohl COX-1 eines der wenigen Proteine ist, das an seiner aktiven Stelle mit der Hemmung durch Aspirin in Verbindung gebracht wird, ist es wichtig zu wissen, dass die Glykosylierung von Lysinresten die Acetylierung anderer Reste, und in diesem Fall des Serins an der aktiven Stelle von COX-1, verstärkt. Jede strukturelle Untereinheit von COX-1 enthält drei Faltungsdomänen: eine Domäne des epidermalen Wachstumsfaktors, eine membranbindende Domäne und eine katalytische aktive Stelle. Die katalytische Domäne enthält eine Cyclooxygenase-Stelle, die die Dioxygenierung von Arachidonsäure zur Bildung des Hydroxyl-Endoperoxids Prostaglandin G2 (PGG2) durchführt, während die benachbarte aktive Peroxidase-Stelle die Reduktion von PGG2 zu PGH2 bewirkt. Gegenüber der membranaktiven Domäne befindet sich innerhalb der katalytischen Domäne die aktive Stelle der Peroxidase, an der ein Häm-Cofaktor in einem flachen Spalt gebunden ist. Die Hämgruppe ist für die Aktivierung eines Tyrosylradikals im aktiven Zentrum der Cyclooxygenase für die Lipidperoxidation von Arachidonsäure unerlässlich. Gegenüber der Häm-bindenden Peroxidase-Stelle am oberen Ende eines Tunnels, der von der membranbindenden Domäne ausgeht, befindet sich die aktive Cyclooxygenase-Stelle. Arachidonsäure bindet an dieser Stelle, was zu einer Umlagerung des Carboxylats des Substrats für die Di-Sauerstoffbildung führt. Strukturstudien an COX-1 vom Schaf, das mit 2-Bromacetoxybenzoesäure behandelt wurde, deuten darauf hin, dass die Bindung von Arachidonsäure an das Cyclooxygenase-Ende der aktiven Stelle und folglich die doppelte Oxygenierung von Arachidonsäure durch die Acetylierung von Serin 530 gehemmt wird.

Die irreversible Hemmung von COX-1 durch die Aspirin-Acetylierung des Serins der aktiven Stelle führt zu einer drastischen Verringerung der Prostaglandin-Biosynthese. In Thrombozyten kann COX-1 nicht schnell regeneriert werden, und folglich kann die COX-1-Aktivität nur durch eine neue Thrombozytenbiogenese wiederhergestellt werden. Die Synthese von Thromboxan A2, Prostaglandin E2 und Prostazyklin (PGI2) ist in mit Aspirin behandelten Thrombozyten am stärksten beeinträchtigt, was zu einer Beeinträchtigung des Gerinnungsmechanismus, einer verminderten Sekretion der Magenschleimhaut, einer verstärkten Reizung durch Magensäure sowie einer veränderten pathophysiologischen Gerinnung und Gefäßerweiterung/-verengung führt.

COX-2 ist auf Aminosäureebene zu 60 % mit COX-1 identisch, und ihre dreidimensionalen Strukturen sind nahezu überlagerbar. COX-2 ist induzierbar, und seine Expression wird durch dieselben Prostaglandine verstärkt, die von COX-1 in Blutplättchen und Epithelzellen synthetisiert werden. COX-2 wird während der Megakaryozytopoese überexprimiert und wurde in Querschnittsproben des Knochenmarks von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie und Polycythemia vera nachgewiesen. In einer anderen Studie wurde die Expression von COX-2 in Blutplättchen im Verhältnis zu COX-1 durch direkte Messung der mRNA-Spiegel charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass Thrombozyten COX-2 in einem Ausmaß exprimieren, das mit dem einiger bösartiger Epithelzellen vergleichbar ist, wenn auch in deutlich geringerem Ausmaß als COX-1 in Thrombozyten. Die Acetylierung von COX-2 in Endothel- und Epithelzellen hemmt die Biosynthese von PGI2 und PGE2, die unterschiedliche Auswirkungen auf nachgeschaltete Prozesse wie Entzündungen haben. Obwohl die Aspirin-vermittelte Hemmung von COX-1 und COX-2 zu unterschiedlichen Profilen der Hemmung der Prostaglandin-Biosynthese führt, ist die Grundlage für die Hemmung in beiden Fällen die Blockade der Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase und die daraus folgende Verringerung der multifunktionalen Prostaglandin-H2-Spiegel. Die Rolle der COX-3 im Zusammenhang mit der Biologie der Blutplättchen ist nach wie vor unbekannt.

Die COX-hemmende Wirkung von Aspirin hängt von der verabreichten Dosis ab. Niedrige Dosen, die zwischen 75 und 300 mg liegen, führen zu einer selektiven Hemmung der TXA2-Produktion der Blutplättchen, ohne Prostazyklin (PGI2) zu unterdrücken, einen häufigen Antagonisten der Blutplättchen und Vasodilatator. Es wird erwartet, dass PGI2 hauptsächlich von der vaskulären COX-2 abgeleitet wird, was darauf hindeutet, dass die COX-2-Hemmung bei niedriger Dosierung minimal ist. Höhere Dosen (>1200 mg) haben analgetische und entzündungshemmende Eigenschaften, Eigenschaften, die mit der pathophysiologischen Hemmung von COX-1 und COX-2 in Zusammenhang stehen. Es ist wichtig zu wissen, dass COX-2 auch Arachidonsäure für die Synthese von Lipoxinen, insbesondere 15-Hydroxyeicosatetraensäure (15-HETE), nutzen kann. Es wird erwartet, dass dieser Biosyntheseweg auch nach der COX-2-Acetylierung intakt bleibt. Diese unterschiedliche Hemmung der COX-Aktivitäten lässt sich zum Teil durch die relative Hemmwirkung von Aspirin erklären. Obwohl Aspirin üblicherweise als unspezifischer COX-Hemmer angesehen wird, ist es hoch selektiv für COX-1 gegenüber COX-2. Wie in Blanco et al. zu sehen ist, liegt die IC50 von Aspirin für COX-1 bei etwa 3,5 μM, während die IC50 für COX-2 etwa 30 μM beträgt. Während die mit Aspirin reaktiven aktiven Stellen beider Enzyme homolog sind, führt die Acetylierung von Ser-516 von COX-2 nur zu einer teilweisen Hemmung der katalytischen Aktivität. Angesichts der erreichbaren Serumkonzentration im Niedrigdosisbereich (~7 μM) ist es unwahrscheinlich, dass die COX-2 zu mehr als 5 % acetyliert ist, während die aus Thrombozyten stammende COX-1 wahrscheinlich zu >70 % acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass regelmäßiges Aspirin in niedriger Dosierung die COX-1-Hemmung in den zirkulierenden Thrombozyten aufrechterhält und nur minimale Auswirkungen auf die Hemmung der peripheren COX-2 hat. Eine Zusammenfassung der Auswirkungen von niedrig dosiertem und hoch dosiertem Aspirin auf die COX-Aktivität im Blut und im Gewebe ist in Tabelle 1 dargestellt.

Aspirin-abhängige Acetylierung von mit Thrombozyten interagierenden Proteinen im Blut

Thrombozyten exprimieren eine Vielzahl von Oberflächenrezeptoren, die es ihnen ermöglichen, mit Plasma- und Blutproteinen, Pathogenen, pathogenen Produkten und dem entzündeten Endothel zu interagieren. Die Oberflächenrezeptoren sind entscheidend für die Adhäsion der Thrombozyten an das verletzte Gefäßsystem, die Bildung des Gerinnungsthrombus und die Aktivierung durch eine Reihe von Stoffwechseleffektoren. Die Interaktion zwischen Thrombozyten und anderen Blutproteinen im systemischen Kreislauf ist entscheidend für die Durchführung und Auflösung der Gerinnungsreaktion. Interessanterweise werden viele dieser Proteine auch durch Aspirin modifiziert.

Fibrinogen

Farr und Mitarbeiter identifizierten 1968 Fibrinogen als ein Ziel der Aspirin-Acetylierung. Fibrinogen kommt sowohl als lösliches Protein im Plasma als auch als intrazelluläres, membranassoziiertes Protein in Blutplättchen vor. Fibrinogen macht 3-10 % des gesamten Thrombozytenproteins aus (wobei fast 25 % in den α-Granula zu finden sind) und wird bei der Aktivierung der Thrombozyten freigesetzt. Es wurde berichtet, dass Fibrinogen in vitro und in vivo durch Aspirin unter Bildung von ε-N-Acetyl-Lysin-Derivaten acetyliert wird, wobei durchschnittlich drei Fibrinogenreste verändert werden. Acetyliertes Fibrinogen erhöht die Anfälligkeit von Fibringerinnseln für die Lyse.

Albumin

Die Modifikation von Albumin durch Aspirin-Acetylierung ist seit über einem halben Jahrhundert bekannt. Eine Reihe von Studien von Farr und Mitarbeitern haben die möglichen Konformationseffekte untersucht, die durch die Acetylgruppenaddition an Albumin ausgelöst werden. Die in der Literatur am häufigsten diskutierte Modifikation von Serumalbumin ist die Acetylierung von Lysinresten. Es wurde auch beobachtet, dass menschliches Serumalbumin die Mechanismen der Blutplättchenverklumpung durch Beeinflussung der Kalziumregulierung beeinflusst.

Hämoglobin

Der vielleicht wichtigste Bestandteil des Blut-Plasma-Milieus, das Hämoglobin, erfährt in vitro eine Aspirin-abhängige Acetylierung, und es wird vermutet, dass es bei hohen Aspirin-Dosen in vivo ähnliche Veränderungen erfährt. Studien zur Acetylierung von Hämoglobin durch Aspirin haben gezeigt, dass die Glykierung von Proteinen abnimmt, und in Gegenwart hoher Glukosekonzentrationen wird die Acetylierung von Hämoglobin durch Aspirin verstärkt, ein Effekt, der auch bei Serumalbumin beobachtet wurde. Aspirin ist in der Lage, eine Vielzahl von Lysinresten in den α- und β-Ketten des Hämoglobins zu acetylieren, ohne dessen strukturelle Konformation oder die Sauerstoffbindungs- und Transportfunktionen zu beeinträchtigen. Hämoglobin ist in der Lage, die Thrombozytenaggregation über Wechselwirkungen mit GP1βα auszulösen, einem der vielen Oberflächenrezeptorproteine der Thrombozyten. Relativ niedrige Konzentrationen von Hämoglobin sind ebenfalls in der Lage, die Thrombozytenaggregation auszulösen, obwohl die Auswirkungen der Acetylierung von Hämoglobin durch Aspirin auf die Wechselwirkungen zwischen Hämoglobin und Thrombozyten noch unbekannt sind .

Wirkung von Aspirin auf die Thrombozytenfreisetzung: Auswirkungen auf Krebs

Die Hemmung der Cyclooxygenase und die gleichzeitige Verringerung der Thromboxan-Biosynthese führen zu einer verminderten Thrombozytenaggregation, Expression von P-Selektin und einer abgeschwächten Gerinnungsfunktion. Neben seiner Rolle bei der Modulation der Thrombozytenaggregation hat Aspirin auch das Profil der exprimierten und sezernierten Proteine in den Thrombozyten verändert. Viele dieser Proteine sind an der Vermittlung der Gerinnungsreaktion und der Rekrutierung von Immunzellen an den Ort der Verletzung beteiligt. Viele Proteine, die sich im „Releasat“ der Blutplättchen befinden, können jedoch auch eine wichtige Rolle bei der Förderung der Angiogenese und des Tumorwachstums spielen.

Aspirin hemmt nachweislich die Freisetzung von Interleukin 7 (IL-7) durch Blutplättchen, die mit Thrombinrezeptor-aktivierendem Peptid (SFLLRN) stimuliert wurden. Gesunde Patienten, die Aspirin einnahmen, wiesen auch eine deutlich niedrigere IL-7-Freisetzung im Plasma auf. Dieses proinflammatorische Zytokin spielt nachweislich eine Schlüsselrolle bei der Reifung von B- und T-Zellen. IL-7 hat außerdem nachweislich sowohl pro- als auch antitumorale Wirkungen, wobei letztere hauptsächlich aus der Hemmung der Apoptose durch die Regulierung von BCL2 resultieren. Thrombozyten sind auch eine Quelle für pro-angiogene Faktoren wie VEGF und Angiopoetin-1, und es gibt einige Hinweise darauf, dass die regelmäßige Einnahme von Aspirin die Plasmakonzentration beider Faktoren verringert, obwohl unklar ist, ob dies ausschließlich auf die Freisetzung von Thrombozyten zurückzuführen ist. Dies wird durch eine klinische Studie untermauert, in der eine Aspirin-Therapie bei Frauen mit Brustkrebs, die Tamoxifen erhielten, ein insgesamt antiangiogenes Gleichgewicht zu begünstigen schien, was durch sinkende Plasma-VEGF-Spiegel und Thrombinrezeptor-vermittelte Freisetzung von TSP-1 und VEGF aus Thrombozyten bewertet wurde.

Coppinger et al. führten eine auf Massenspektrometrie basierende Proteomstudie durch, um die Zusammensetzung des Thrombozyten-Releasats in Abhängigkeit von der Aspirin-Behandlung weiter zu untersuchen. In dieser Studie führte die Behandlung menschlicher Thrombozyten mit niedrig dosiertem Aspirin (20 μM) nach Stimulierung durch Kollagen, SFLLRN oder ADP zu einem starken Rückgang der Proteinmenge im Freisetzungsprodukt, wobei das Ausmaß dieses Rückgangs vom verwendeten Agonisten abhing. Die Behandlung mit Aspirin führte auch zu einer Verringerung des wachstumsregulierenden Wachstumsfaktors (GRO), des aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktors (PDGF), von Angiogenin, RANTES und Oncostatin M (OSM) im Thrombozyten-Releasat, insbesondere nach Stimulation mit Kollagen. Während diese und andere aus Blutplättchen gewonnene Zytokine (z. B., CXCL4 und CTGF ) für die Regulierung der Gefäßreparatur von entscheidender Bedeutung sind, spielen sie auch eine Rolle bei der Tumorentstehung, Angiogenese und Metastasierung.

Definition des Aspirin-Acetyloms

Wie bereits erwähnt, ist bekannt, dass Aspirin eine Vielzahl von intrazellulären und extrazellulären Proteinzielen acetyliert, insbesondere an Seitenketten und N-terminalen Aminogruppen. Leider gibt es keine umfassenden proteomischen Studien, die sich speziell mit der Frage befassen, welche Thrombozytenproteine neben den COX-Enzymen durch Aspirin acetyliert werden oder welche biologische Rolle diese nicht-kanonischen Acetylierungen spielen. In diesem Abschnitt werden wir frühere Proteomstudien zur Identifizierung nicht-kanonischer Ziele der Aspirin-vermittelten Acetylierung betrachten und versuchen, sie mit dem aktuellen Stand der Thrombozytenproteomik in Beziehung zu setzen.

Es gab zahlreiche Proteomstudien, die versucht haben, die Gruppe der Proteine zu definieren, die durch physiologische Konzentrationen von Aspirin in verschiedenen Zelllinien acetyliert werden. Bhat und Mitarbeiter identifizierten 33 zelluläre Proteine, die nach Anreicherung mit einem Anti-Acetyl-Lysin-Antikörper durch Aspirin acetyliert wurden. Bei der anschließenden massenspektrometrischen Analyse wurde das Vorhandensein von acetylierten Zytoskelett- und Stoffwechselenzymen festgestellt, darunter Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD), Laktatdehydrogenase, Enolase, Pyruvatkinase und Transketolase, obwohl nur G6PD durch die Aspirin-vermittelte Acetylierung in vitro signifikant gehemmt wurde. Dies deutet darauf hin, dass Aspirin den Fluss durch den Pentose-Phosphat-Weg blockieren könnte, obwohl weitere Studien erforderlich sind, um dies zu bestätigen. Diese Gruppe zeigte auch, dass Aspirin p53 acetyliert, was zu einer verstärkten DNA-Bindung, Expression von p21Cip und einer Verstärkung des apoptotischen Zelltods in Gegenwart von Camptothecin führt. Diese Wirkungen wurden zwar bei mehreren Tumorzelllinien nachgewiesen, aber das Fehlen von p53 im Proteom der Blutplättchen sowie das Fehlen eines funktionellen Genoms in den Blutplättchen lässt vermuten, dass die Acetylierung von p53 nur minimale Auswirkungen auf die Biologie der Blutplättchen hat.

Neuere Fortschritte in der Hochdurchsatz-Proteomik in Verbindung mit aktivitätsbasierten Sonden haben zur Identifizierung von Hunderten von mutmaßlichen Aspirin-vermittelten Acetylierungen geführt. Bei einem Ansatz wurde die Acetylgruppe von Aspirin durch Pentynsäure ersetzt, um ein Alkin-haltiges Aspirinderivat (AspAlk) zu erzeugen. Im Gegensatz zu Aspirin führt die Acetylübertragung durch AspAlk zum Einbau eines azidreaktiven Alkins an Stellen, die normalerweise von Aspirin acetyliert werden. Nach Inkubation von AspAlk mit lebenden kolorektalen HCT-15-Zellen wurden Proteine, die durch AspAlk acetyliert wurden, über die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) mit Biotin markiert und durch Streptavidin-Pulldown isoliert. Nach einer LC-MS-Analyse konnten die Autoren 120 Proteine mit einer signifikanten Anreicherung der AspAlk-Acetylierung im Vergleich zu DMSO-Kontrollen identifizieren. Die am stärksten angereicherten Proteinklassen in dieser Studie waren diejenigen, die an der Proteinsynthese und -faltung beteiligt sind, Proteine des Zytoskeletts und Stoffwechselenzyme. Auch eine Histon-Acetylierung wurde beobachtet und biochemisch bestätigt. Diese Arbeit wurde in einem kürzlich erschienenen Manuskript von Shen, Lin und Mitarbeitern erweitert, die ein säurelabiles Biotin-Azid verwendeten, um das Auffinden von AspAlk-modifizierten Proteinen nach Biotin-Konjugation und Streptavidin-Pulldown zu erleichtern. Diese Strategie führte zur Identifizierung von über 500 acetylierten Proteinen. Eine Analyse der Zielproteine ergab, dass eine signifikante Acetylierung innerhalb des mTOR-Signalwegs stattfindet, der viele wichtige Zellfunktionen wie Proteinsynthese und Autophagie steuert. Die Autoren bestätigten die ersten proteomischen Beobachtungen, indem sie zeigten, dass eine Aspirin-Behandlung sowohl von HCT116-Kolorektalzellen als auch von embryonalen Fibroblasten der Maus die De-novo-Proteinsynthese verringerte und die Autophagie auslöste. Die Induktion der Autophagie durch Aspirin ist von besonderem Interesse angesichts einer kürzlich durchgeführten Studie, die zeigt, dass die Autophagie für die normale Funktion der Blutplättchen unerlässlich ist und während der Stimulation der Blutplättchen hochreguliert wird. Darüber hinaus ist eine funktionierende Autophagie-Maschinerie für die gerinnungshemmende Wirkung von Blutplättchen unerlässlich, wie Mausmodelle zeigen, bei denen Atg7 ausgeschaltet ist. Während die funktionelle Beziehung zwischen der Aspirin-vermittelten Acetylierung und der Induktion der Thrombozyten-Autophagie unklar bleibt, könnte die Hemmung des Pentosephosphatwegs (PPP) durch G6PD-Blockade oder die Störung der mitochondrialen Atmung durch Acetylierung der Malat-Dehydrogenase und/oder Isocitrat-Dehydrogenase die intrazelluläre oxidative Belastung erhöhen, ein bekannter Auslöser für die Autophagie. Alternativ gibt es zahlreiche Belege für eine Aspirin-vermittelte Acetylierung von Chaperonen, insbesondere von Hitzeschockproteinen und Peptidyl-Prolyl-Isomerasen, die die ordnungsgemäße Proteinfaltung beeinträchtigen und die autophagische Beseitigung fehlgefalteter Proteine auslösen können.

In einer weiteren kürzlich durchgeführten Proteomstudie von Tatham und Mitarbeitern wurde 3H-markiertes Aspirin verwendet, um die Stellen der Aspirin-vermittelten Acetylierung in HeLa-Zellen durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Bei diesem Ansatz führt die Verwendung von tritiiertem Aspirin zu einer Massenverschiebung von +3 Da im Vergleich zu normalem Acetat und ermöglicht eine genauere Unterscheidung zwischen Aspirin-vermittelter Acetylierung und endogener Acetylierung. Mit diesem Ansatz wurden über 12.000 durch Aspirin vermittelte Acetylierungen in über 3700 einzigartigen Proteinen nachgewiesen. Interessanterweise wurden viele der Proteine, die durch Aspirin acetyliert wurden, auch in Abwesenheit von Aspirin acetyliert, was darauf hindeutet, dass Aspirin vorhandene Proteinacetylierungsstellen „verstärkt“. Die Autoren dieser Studie stellten außerdem fest, dass in den meisten Fällen <1 % der gesamten für die Acetylierung verfügbaren Stellen eines bestimmten Proteins durch Aspirin acetyliert wurden, was darauf hindeutet, dass die Stöchiometrie der unspezifischen, durch Aspirin vermittelten Acetylierung möglicherweise nicht ausreicht, um ohne pharmakologische Blockade der endogenen Deacetylase-Aktivitäten signifikante biologische Wirkungen zu erzielen.

Diese Studie zeigte auch eine signifikante Acetylierung von Histonproteinen, wobei der Großteil der Aspirin-vermittelten Acetylierung im Histonkern und nicht in den N-terminalen Schwänzen auftrat. Die Acetylierung von Histonen wurde in mehreren Proteomstudien beobachtet und ist angesichts des hohen Anteils an nukleophilen Lysinresten in Histonen, die eine wichtige Rolle bei der elektrostatischen DNA-Bindung spielen, wenig überraschend. Die Histonacetylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der DNA-Bindung und ist ein bekannter epigenetischer Mechanismus zur Regulierung der Genexpression. Obwohl Blutplättchen kernlos sind, wurden in früheren Transkriptomstudien histonspezifische Transkripte in Blutplättchen identifiziert, insbesondere H2A, H2B, H3 und H4. Obwohl die Acetylierung von Histon durch Aspirin überzeugend nachgewiesen wurde, ist es wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Histonexpression in Blutplättchen nicht bestätigt wurde. Stattdessen wurde postuliert, dass das Vorhandensein von Histon-Transkripten in Blutplättchen ein Artefakt des abnormen Zellzyklus in Megakaryozyten ist, aus denen Blutplättchen entstehen. Noch wichtiger ist, dass die Rolle der Histone bei der Kontrolle der Expression auf DNA-Ebene in anukleierten Thrombozyten fehlt.

Auswirkungen von Aspirin auf den Thrombozytenstoffwechsel

Der Stoffwechsel der Thrombozyten ist in erster Linie oxidativ, im Gegensatz zu den Neutrophilen, die in erster Linie glykolytisch sind. Die Blockade der anaeroben Glykolyse verringert weder das ATP noch hemmt sie die Thrombozytenfunktion. Es hat sich gezeigt, dass die Acetylierung von Enzymen des Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus) und von Komponenten der Elektronentransportkette (ETC) eine gängige Methode der Regulierung ist, insbesondere für Enzyme, die am Stoffwechsel beteiligt sind, wie die Malatdehydrogenase im Kohlenstoffstoffwechsel, die Regulierung des Lipidstoffwechsels und im Harnstoffzyklus zur Ammoniakentgiftung. Daraus folgt, dass die Acetylierung der Enzyme des TCA-Zyklus und der ETC-Komponenten einen erheblichen Einfluss auf die Bioenergetik der Blutplättchen haben kann. Proteomische Untersuchungen der Aspirin-Acetylierung haben durchweg eine Aspirin-vermittelte Acetylierung der Malat-Dehydrogenase, die den Wechsel zwischen Kohlenhydrat- und Fettsäuresynthese reguliert, und der Isocitrat-Dehydrogenase ergeben, die in den Mitochondrien durch Deacetylierung über Sirtuin-Proteine (Sirt3 und Sirt5) reguliert wird. Die Sirtuin-Desacetylase-Aktivität ist mit einer Reihe von TCA-Enzymen in der mitochondrialen Matrix verbunden und reguliert vermutlich die Regeneration von Antioxidantien, die Regulierung des TCA-Flusses und die Anapleurose . Obwohl uns zum Zeitpunkt der Erstellung und des Drucks dieser Übersichtsarbeit keine Studien bekannt sind, die sich direkt mit dem Ausmaß der Aspirin-vermittelten Acetylierung von Stoffwechselenzymen oder der Wirkung von Aspirin auf den Stoffwechselfluss befassen, deuten die proteomischen Hinweise darauf hin, dass dies eine wichtige nicht-kanonische Wirkung von Aspirin auf die Biochemie der Blutplättchen sein könnte.

Auswirkungen von Aspirin auf die Thrombozytenlokalisierung in Tumoren

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Thrombozyten selbst eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung und insbesondere bei der Entwicklung von Metastasen spielen können. In metastatischen Mausmodellen, bei denen Tumorzellen direkt in den Blutkreislauf injiziert werden, haben sich Strategien zur Verringerung der zirkulierenden Thrombozytenzahl als wirksam erwiesen, um die Tumorlast zu reduzieren. Andere Studien an Metastasierungsmodellen, bei denen lösliches Fibrin und Tumorzellen gemeinsam injiziert wurden, um die Gerinnungswirkung zu verstärken, zeigten eine erhöhte Inzidenz von Metastasen in vivo. Diese Studien wurden durch In-vitro-Experimente unterstützt, bei denen lösliches Fibrin die Interaktionen zwischen Thrombozyten und Tumorzellen unter Kulturbedingungen verstärkte. Diese Studien stützen die Hypothese, dass die Aktivierung der Thrombozytenaggregation zusätzlich zu dem erwarteten Anstieg von Fibrin die Adhäsion von Thrombozyten an Tumorzellen erhöht und die Ausbreitung von Metastasen erleichtert. Neben Fibrin haben weitere Studien die Rolle von Thrombin, PAR-1 und Gerinnungsfaktor VII (FVII) und deren Zusammenhang mit der Verbesserung der Lebensfähigkeit von Krebszellen, dem Krebswachstum und der Ausbreitung, der erhöhten Bösartigkeit von Tumoren und der Unterstützung von Metastasen untersucht.

Neben der Modulation der Biologie von Tumorzellen im systemischen Kreislauf haben Thrombozyten auch eine wichtige Rolle beim Wachstum von Tumorzellen gespielt. In einer Studie wurde gezeigt, dass Aspirin das Ausmaß der Zellproliferation von Eierstockkrebs sowohl in vitro als auch in vivo deutlich verringert. In derselben Studie wurde auch festgestellt, dass die Aktivierung von Blutplättchen die Proliferation und das Wachstum von Tumorzellen nach Ko-Inkubation von Tumorzellen und Blutplättchen steigern kann. Die Hemmung von Thrombozytenadhäsionsrezeptoren, einschließlich GPIβα, GPIIβIIIα und P-Selektin, verringerte jedoch nicht die proliferativen Effekte von Thrombozyten. Dies deutet darauf hin, dass von Blutplättchen ausgeschiedene Proteine und andere Faktoren eine Rolle bei der Regulierung des Tumorzellwachstums spielen könnten. So wurde beispielsweise beobachtet, dass die Verringerung von TGF-β1 in den Blutplättchen die Proliferation von Eierstockkrebszellen, die Blutplättchen ausgesetzt waren, verringerte. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Aspirin die Metastasierung von Darmkrebs durch einen COX-1-Mechanismus verhindert, an dem TXA2 und PGE2 beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass aktivierte Blutplättchen die Metastasierung durch die COX-1-abhängige Prostaglandinproduktion unterstützen können. Schließlich hat sich gezeigt, dass ein neuartiges Aspirin-Phosphotidylcholin-Konjugat (Aspirin-PC) die durch Thrombozyten-Tumorzellen induzierte epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durch die Freisetzung von VEGF und Thromboxan stört. Außerdem wurde festgestellt, dass diese Formulierung die Zellproliferation und Angiogenese hemmt und gleichzeitig die Apoptose in Zellmodellen für Eierstock- und Darmkrebs erhöht.