Unsere Kunden bei Biotage haben interessante und unterschiedliche Hintergründe, von hochqualifizierten synthetischen Chemikern über Experten in der Naturstoffchemie bis hin zu denen, die gerade erst mit der Chemie beginnen. Was ich in meiner über 40-jährigen Karriere in der „Kunst“ der Chromatographie gelernt habe, ist, dass es vielen dieser feinen Leute an Verständnis für die chromatographischen Prinzipien mangelt. Dieses mangelnde Verständnis ist meiner Meinung nach nur auf den Lehrplan ihres Hauptstudiums zurückzuführen, in dem die Trennungswissenschaft als Werkzeug während der Laborarbeit verwendet wird, aber die Prinzipien, die dahinter stehen, warum sich die Komponenten eines Gemisches trennen (oder nicht trennen), vielleicht nicht effektiv erklärt, verstanden oder studiert werden.
Es gibt vier Grundtypen der Chromatographie, darunter:
- Gas-Flüssig-Chromatographie (GC)
- Flüssig-Flüssig-Chromatographie (LLC)
- Flüssig-Fest-Chromatographie (LSC)
- Größenausschluss/Gelpermeationschromatographie (SEC/GPC)
In diesem Beitrag werde ich mich auf die Flüssig-Fest-Chromatographie konzentrieren.
Flüssig-Fest-Chromatographie
Dies ist die beliebteste der oben genannten Techniken, da sie für die Trennung von halbflüchtigen und nichtflüchtigen Verbindungen geeignet ist. Da zum Eluieren von Verbindungen von einer Trennsäule keine Wärme erforderlich ist (wie bei der GC), erfordert die Flüssig-Fest-Chromatographie die Verwendung eines Lösungsmittels oder eines Gemischs aus mischbaren Lösungsmitteln mit unterschiedlicher Polarität, um die chemischen Komponenten der Probe voneinander zu trennen.
Bei der LSC wird die Probe auf einen festen Träger oder eine stationäre Phase geladen. Die Komponenten der Probe binden sich an die stationäre Phase, jedoch in unterschiedlichem Maße. Das Ausmaß der Wechselwirkung mit der stationären Phase steuert die Trennungsrate und -effizienz. Je stärker die Anziehungskraft auf die stationäre Phase ist, desto länger brauchen die Verbindungen, um zu eluieren. Um das Eluieren dieser stark gebundenen Verbindungen zu unterstützen, muss sich das Lösungsmittelverhältnis mit der Zeit ändern (zunehmende Stärke).
Im Bereich der LSC gibt es mehrere verschiedene chromatographische Techniken…
- Papierchromatographie (PC)
- Dünnschichtchromatographie (TLC)
- High-performance liquid chromatography (HPLC)
- Flash chromatography (FC)
- Ion exchange chromatography (IX)
- Affinity chromatography (AC)
- Chiral chromatography (CC)
- Supercritical fluid chromatography (SFC)
In diesem Beitrag werde ich mich auf die Flash-Chromatographie konzentrieren, Die Prinzipien sind die gleichen wie bei der HPLC. Beide verwenden Säulen, die mit einer stationären Phase gefüllt sind, in die die Probe eingespritzt wird und durch die das Lösungsmittel gepumpt wird. Bei der Flash-Chromatographie werden jedoch größere Säulen verwendet als bei der HPLC, bei der es sich hauptsächlich um eine analytische Trenntechnik handelt.
Die Flash-Chromatographie ist eine präparative Chromatographietechnik, deren Säulen ebenfalls mit einem festen Träger oder Medium gefüllt sind, das eine größere Partikelgröße hat als HPLC-Säulen. Diese Unterschiede in der Größe des Mediums und der Säule ermöglichen es den Flash-Säulen, mehr Verbindungen pro Gramm Medium zu reinigen als die HPLC.
- Die Flash-Chromatographie verwendet 15 µm bis zu 60 µm große Medienpartikel
- Die HPLC verwendet 1,7 µm bis 10 µm große Medienpartikel
Was passiert in der Säule
Die meisten Flash-Chromatographien und HPLC werden entweder mit Normalphasen- oder Umkehrphasenmethoden durchgeführt. Die Unterschiede zwischen diesen Methoden liegen in der Chemie der stationären Phase und in den Lösungsmitteln, die zur Trennung der einzelnen chemischen Komponenten eines Gemischs verwendet werden.
- Die Normalphasenmethode verwendet unpolare und mittelstarke Lösungsmittel (z. B. Hexan und Ethylacetat) für die mobile Phase und ein polares Medium (z.z. B. Siliziumdioxid) als stationäre Phase
- Die umgekehrte Phase verwendet polare Lösungsmittel und eine unpolare stationäre Phase
Da diese Methoden „polare“ Gegensätze sind (Wortspiel beabsichtigt), ist die Elutionsreihenfolge für die meisten Verbindungen umgekehrt. Hier spielt sich die Chemie hinter chromatographischen Trennungen ab.
Konzentrieren wir uns zunächst auf die Normalphasenchromatographie.
Normalphasenchromatographie
Bei der Normalphasenchromatographie werden die chemischen Verbindungen, aus denen ein Gemisch besteht (z. B. Reaktionsgemisch, Naturproduktextrakt usw.), in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und in die Säule injiziert. Wenn das Gemisch mit der polaren stationären Phase, z. B. Kieselsäure, in Berührung kommt, konkurrieren die Verbindungen des Gemischs und ihr Lösungsmittel mit der mobilen Phase um die Bindungsstellen der Kieselsäure. Je polarer die Chemikalie ist, desto stärker wird sie von dem Siliziumdioxid angezogen. Diese Anziehung wird als Adsorption bezeichnet (anders als Absorption).
Absorption ist das, was passiert, wenn ein Schwamm oder ein Papiertuch mit einer Flüssigkeit interagiert. Adsorption ist eine Kombination physikalischer und chemischer Wechselwirkungen, bei der die polare Oberfläche des Siliziumdioxids die chemischen Komponenten, mit denen es in Kontakt kommt, chemisch bindet, meist aufgrund von Phänomenen, die als Wasserstoffbrückenbindungen und van-der-Walls-Kräfte bekannt sind.
Wenn eine Chemikalie mit trockenem Siliziumdioxid (wie bei einer neuen Flash-Säule) in Wechselwirkung tritt, kommt es zur Adsorption. Bei dieser Wechselwirkung wird Wärme freigesetzt, die Probleme mit der Stabilität der Verbindung und den chromatographischen Ergebnissen verursachen kann. Aus diesem Grund werden Kieselgelsäulen in der Regel vor dem Einbringen der Probe mit einem Lösungsmittel geringer Polarität äquilibriert (vorbefeuchtet). Lösungsmittel mit geringer Polarität (z. B. Hexan, Heptan, Cyclohexan) sind schwache Lösungsmittel und werden von Silika oder anderen polaren Medien nicht gut adsorbiert.
Die Oberflächenchemie von Silika ist eine Mischung aus Hydroxylgruppen (Silanolen) und Silylethern, Abbildung 1. Diese funktionellen Gruppen sind polar, gelten als negativ geladen und adsorbieren Verbindungen mit Elektronenmangel. Die pi-Wolken der aromatischen Verbindungen können während der Adsorption Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hydroxylgruppen des Silicas eingehen.1
Abbildung 1. Chromatographisches Siliziumdioxid besteht aus einer Mischung von Silanolen und Silyletherfunktionen. Diese Anteile binden sich mit Chemikalien durch Wasserstoffbrückenbindung/Adsorption.
Um eine gute Bindung der Probenkomponenten (Adsorption) zu gewährleisten, muss die zu reinigende Probe entweder in einem schwachen Lösungsmittel gelöst und in die Säule geladen werden (Flüssigladung) oder in einem stärkeren (polaren) Lösungsmittel gelöst, mit einem inerten Medium (z. B. Kieselerde, Kieselgur) gemischt, getrocknet und in eine andere Säule gepackt werden, die in Reihe mit der Reinigungssäule angeordnet ist (Trockenladung). Die Trockenbeladung beseitigt viele Probleme, die bei der Verwendung einer flüssigen Beladung auftreten, insbesondere bei einer in einem polaren Lösungsmittel gelösten Probe.
Nach der Probenbeladung werden die Lösungsmittel der mobilen Phase zugeführt. Um eine Trennung zu erreichen, müssen die Probenbestandteile jedoch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten von der stationären Phase desorbiert werden. Obwohl dies mit einem Lösungsmittel konstanter Polarität (isokratische Elution) möglich ist, wird eine bessere Reinigung in der Regel mit einer mobilen Phase erzielt, die mit geringer Polarität beginnt und deren Polarität mit der Zeit zunimmt. Dies wird als Gradientenelution bezeichnet.
Bei einem Gradienten werden die Verbindungen mit höherer Löslichkeit in dem Lösungsmittel mit geringer Polarität (Verbindungen mit geringerer Polarität) zuerst desorbiert und durch die Säule geleitet. Mit zunehmender Polarität der mobilen Phase des Lösungsmittels werden die adsorbierten Verbindungen je nach ihrer Löslichkeit in der zunehmend polaren mobilen Phase unterschiedlich schnell vom Medium desorbiert, Abbildung 2.
Abbildung 2. Oben – Bei isokratischer Elution (konstante Polarität der mobilen Phase) desorbieren die Verbindungen langsamer als bei Verwendung eines Gradienten (unten). Die Gradientenelution führt in der Regel zu einer besseren Trennung/Reinigung als die isokratische Elution.
Ein interessantes Merkmal der Normalphasenchromatographie ist, dass eine Verbindung, die einmal vom Medium desorbiert wurde, nie wieder adsorbiert wird, da die zunehmend polare mobile Phase bevorzugt an ihrer Stelle adsorbiert.
Polaritätsunterschiede (Bindungsstärke) zwischen Verbindungen können so subtil sein wie die Hinzufügung einer anderen funktionellen Gruppe, Unterschiede in der Position der funktionellen Gruppe (Parida, 2006) wie an einem aromatischen Ring oder so deutlich wie Verbindungen mit völlig unterschiedlichen Strukturen, Abbildung 3.
Abbildung 3. Trennung von Verbindungen mit unterschiedlichen Polaritäten auf der Grundlage des Typs der funktionellen Gruppe und der Position auf dem Molekül. In der Reihenfolge der Elution – Naphthalin (keine polare Funktionalität), 1-Nitronaphthalin, o-Nitroanilin, m-Nitroanilin, p-Nitroanilin. Die Nitroaniline unterscheiden sich nur durch die Position der Nitrofunktion im Verhältnis zum Amin.
Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass die Trennungen in der Normalphasenchromatographie auf Unterschieden in der Polarität der Verbindungen (sowohl offensichtlich als auch subtil), ihrer Anziehungskraft auf die stationäre Phase und ihrer Löslichkeit in der mobilen Phase beruhen. Um die besten Reinigungsergebnisse zu erzielen, wird ein Lösungsmittel-Scouting mittels TLC empfohlen.
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1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
