Nuestra clientela en Biotage tiene antecedentes interesantes y diversos, desde químicos sintéticos altamente calificados, a expertos en química de productos naturales, hasta aquellos que recién comienzan su viaje con la química. Lo que he aprendido a lo largo de mis más de 40 años de carrera en el «arte» de la cromatografía es que para muchas de estas buenas personas hay una falta de comprensión de los principios cromatográficos. Esta falta de comprensión, creo, es sólo debido a su plan de estudios básico donde la ciencia de la separación se utiliza como una herramienta durante el trabajo de laboratorio, pero los principios detrás de por qué los componentes de una mezcla se separan (o no se separan) tal vez no son efectivamente explicados, entendidos o estudiados.
Hay cuatro tipos básicos de cromatografía que incluyen:
- Cromatografía gas-líquido (GC)
- Cromatografía líquido-líquido (LLC)
- Cromatografía líquido-sólido (LSC)
- Cromatografía de exclusión de tamaño/permeación en gel (SEC/GPC)
Para este post me centraré en la cromatografía líquido-sólido.
Cromatografía líquido-sólido
Esta es la más popular de las técnicas mencionadas anteriormente porque es útil para separaciones de compuestos semivolátiles y no volátiles. Dado que no se requiere calor para eluir los compuestos de una columna de separación (como ocurre con la GC), la cromatografía líquido-sólido requiere el uso de un disolvente o una mezcla de disolventes miscibles con diferente polaridad para conseguir que los componentes químicos de la muestra se separen unos de otros.
Con la LSC, la muestra se carga en un soporte sólido o fase estacionaria. Los componentes de la muestra se unen a la fase estacionaria, pero en distintos grados. La cantidad de interacción con la fase estacionaria controla la tasa de separación y la eficacia. Así, cuanta más atracción ejerza la fase estacionaria, más tiempo necesitarán los compuestos para eluir. Para ayudar a eluir esos compuestos fuertemente unidos, la proporción de disolvente tiene que cambiar (aumentando la fuerza) con el tiempo.
Dentro del ámbito de la LSC hay varias técnicas cromatográficas diferentes…
- Cromatografía en papel (PC)
- Cromatografía en capa fina (TLC)
- Cromatografía líquida de altacromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
- Cromatografía flash (FC)
- Cromatografía de intercambio iónico (IX)
- Cromatografía de afinidad (AC)
- Cromatografía quiral (CC)
- Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)
En este post me centraré en la cromatografía flash, cuyos principios son los mismos que los de la HPLC. Ambas utilizan columnas llenas de una fase estacionaria en la que se inyecta la muestra y a través de la cual se bombea el disolvente. Sin embargo, la cromatografía flash utiliza columnas más grandes que la HPLC, que es sobre todo una técnica de separación analítica.
La cromatografía flash es una técnica cromatográfica preparatoria cuyas columnas también se llenan con un soporte sólido o medio que tiene un tamaño de partícula mayor que las columnas de HPLC. Estas diferencias en el tamaño del medio y de la columna permiten que las columnas flash purifiquen más compuestos por gramo de medio que la HPLC.
- La cromatografía flash utiliza partículas de medio de entre 15 µm y 60 µm
- La HPLC utiliza partículas de medio de entre 1,7 µm y 10 µm
Lo que ocurre dentro de la columna
La mayor parte de la cromatografía flash y de la HPLC se realiza utilizando la metodología de fase normal o de fase inversa. Las diferencias entre estas metodologías radican en la química de la fase estacionaria y los disolventes utilizados para separar los componentes químicos individuales de una mezcla.
- La fase normal utiliza disolventes no polares y moderados (por ejemplo, hexano y acetato de etilo) para la fase móvil y un medio polar (por ejemplo, sílice) como fase móvil.p. ej., sílice) como fase estacionaria
- La fase inversa es justo lo contrario, ya que utiliza disolventes polares y una fase estacionaria no polar
Al ser estas metodologías «polares» opuestas entre sí (juego de palabras), el orden de elución de la mayoría de los compuestos se invierte. Aquí es donde se produce la química que hay detrás de las separaciones cromatográficas.
Centrémonos en la fase normal por ahora.
Cromatografía de fase normal
Con la cromatografía de fase normal, los compuestos químicos que componen una mezcla (por ejemplo, mezcla de reacción, extracto de producto natural, etc.) se disuelven en un disolvente adecuado y se inyectan en la columna. Cuando la mezcla entra en contacto con la fase estacionaria polar, digamos la sílice, los compuestos de la mezcla y su disolvente compiten con la fase móvil por los sitios de unión de la sílice. Cuanto más polar sea la sustancia química, más fuertemente será atraída por la sílice. Esta atracción se llama adsorción (diferente de la absorción).
La adsorción es lo que ocurre cuando una esponja o una toalla de papel interactúan con un líquido. La adsorción es una combinación de interacciones físicas y químicas en las que la superficie polar de la sílice une químicamente los componentes químicos con los que entra en contacto, sobre todo debido a fenómenos conocidos como los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Walls.
Cuando cualquier sustancia química interactúa con la sílice seca (como la que se utiliza con una nueva columna flash), se produce la adsorción. Esta interacción libera calor, lo que puede causar problemas con la estabilidad del compuesto y los resultados cromatográficos. Por este motivo, las columnas de sílice suelen equilibrarse (humedecerse previamente) con un disolvente de baja polaridad antes de introducir la muestra. Los disolventes de baja polaridad (por ejemplo, hexano, heptano, ciclohexano) son disolventes débiles y no son bien adsorbidos por la sílice u otros medios polares.
La química de la superficie de la sílice es una mezcla de grupos hidroxilos (silanoles) y éteres de sililo, Figura 1. Estos grupos funcionales son polares, se cree que están cargados negativamente y adsorben compuestos deficientes en electrones. Las nubes pi de los compuestos aromáticos pueden establecer enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilos de la sílice durante la adsorción.1
Figura 1. La química de la sílice cromatográfica comprende una mezcla de silanoles y funcionalidades de éter de sililo. Estas moléculas se unen a las sustancias químicas mediante enlaces de hidrógeno/adsorción.
Para garantizar una buena unión de los componentes de la muestra (adsorción), la muestra que se va a purificar debe disolverse y cargarse en la columna en un disolvente débil (carga líquida) o bien disolverse con un disolvente más fuerte (polar), mezclarse con un medio inerte (por ejemplo, sílice, tierra de diatomeas), secarse y empaquetarse en una columna diferente colocada en línea con la columna de purificación (carga seca). La carga en seco elimina muchos de los problemas que se presentan cuando se utiliza una carga líquida, especialmente con una muestra disuelta en un disolvente polar.
Después de la carga de la muestra, se introducen los disolventes de la fase móvil. Sin embargo, para lograr una separación, los componentes de la muestra deben desorberse de la fase estacionaria a diferentes velocidades. Aunque esto se puede conseguir utilizando un disolvente de polaridad constante (elución isocrática), normalmente se consigue una mejor purificación utilizando una fase móvil que comienza con una polaridad baja y aumenta su polaridad con el tiempo. Esto se conoce como elución en gradiente.
Con un gradiente, aquellos compuestos con mayor solubilidad en el disolvente de baja polaridad (compuestos de menor polaridad) se desorben primero y pasan a través de la columna. A medida que aumenta la polaridad del disolvente de la fase móvil, los compuestos adsorbidos se desorben del medio a diferentes velocidades en función de su solubilidad en la fase móvil cada vez más polar, Figura 2.
Figura 2. Arriba – Con la elución isocrática (polaridad constante de la fase móvil), los compuestos se desorben más lentamente que cuando se utiliza un gradiente (abajo). La elución en gradiente suele proporcionar una mejor separación/purificación, que la elución isocrática.
Una característica interesante de la cromatografía en fase normal es que una vez que un compuesto se desorbe del medio, no vuelve a adsorberse porque la fase móvil cada vez más polar se adsorbe preferentemente en su lugar.
Las diferencias de polaridad (fuerza de unión) entre compuestos pueden ser tan sutiles como la adición de un grupo funcional diferente, diferencias de localización de grupos funcionales (Parida, 2006) como en un anillo aromático, o tan distintas como compuestos con estructuras totalmente diferentes, Figura 3.
Figura 3. Separación de compuestos de distinta polaridad en función del tipo de grupo funcional y de su ubicación en la molécula. Por orden de elución: naftaleno (sin funcionalidad polar), 1-naftaleno, o-nitroanilina, m-nitroanilina, p-nitroanilina. Las nitroanilinas sólo difieren en la ubicación del grupo funcional nitro con respecto a la amina.
Así que, para resumir, las separaciones por cromatografía en fase normal se basan en las diferencias de polaridad de los compuestos (tanto evidentes como sutiles), su atracción por la fase estacionaria y su solubilidad en la fase móvil. Para obtener los mejores resultados de purificación se recomienda la exploración de disolventes mediante TLC.
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1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
