Efecto de las dietas recubiertas con Bacillus megaterium sobre el crecimiento, la actividad de las enzimas digestivas y la diversidad microbiana intestinal de la carpa espejo de Songpu Cyprinus specularis Songpu

Abstract

El presente estudio se realizó para evaluar el efecto de una dieta recubierta con Bacillus megaterium sobre el rendimiento del crecimiento, las enzimas digestivas y la diversidad microbiana intestinal en la carpa espejo Songpu (Cyprinus specularis Songpu). Los peces fueron alimentados manualmente con dos dietas (una de control y otra recubierta de B. megaterium) tres veces al día hasta la saciedad aparente durante 56 días. En comparación con el grupo de control, la suplementación con la dieta recubierta de B. megaterium mejoró el crecimiento de los peces y redujo significativamente el índice de conversión alimenticia (). Las actividades de la amilasa y la lipasa del intestino anterior en el grupo de tratamiento fueron significativamente mayores que las del grupo de control (). Las actividades de las proteasas del intestino anterior, medio y posterior en el grupo de tratamiento fueron superiores a las del grupo de control (). Los resultados de la secuenciación de los genes del ADNr 16S de la microbiota mediante la secuenciación de alto rendimiento mostraron que la diversidad y la abundancia de la microflora intestinal aumentaron junto con el crecimiento de la carpa espejo Songpu. Las carpas espejo Songpu alimentadas con una dieta recubierta de B. megaterium mostraron mayores proporciones de Bacillus y Lactococcus intestinales a nivel de género, y ambas fueron significativamente mayores que las del grupo de control (). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la aplicación de B. megaterium en la dieta puede mejorar el crecimiento y la actividad enzimática digestiva de la carpa espejo Songpu y enriquecer la composición de géneros beneficiosos de su microflora intestinal principal.

1. Introducción

El pescado, como una de las principales fuentes dietéticas de proteína animal, desempeña un papel muy importante en la estructura alimentaria humana. Sin embargo, en los últimos años, la seguridad de los productos acuáticos se ha convertido en uno de los mayores factores que obstaculizan el desarrollo de los productos acuáticos debido a la preocupación por la seguridad de las hormonas, los antibióticos y el exceso de microorganismos . Con el rápido desarrollo de la cría intensiva de alta densidad, el medio acuático de la acuicultura se deteriora a diario, lo que da lugar a brotes de enfermedades e incluso a la muerte masiva de animales de granja. Existe una necesidad urgente de encontrar alternativas seguras y respetuosas con el medio ambiente para garantizar el crecimiento saludable de los animales de granja.

Como nuevo aditivo para piensos tras la era de los antibióticos, los probióticos se consideran importantes sustitutos de los antibióticos para piensos. Los estudios han demostrado que el uso de probióticos no sólo puede promover el crecimiento de los animales acuáticos y mejorar su tasa de supervivencia, sino que también puede reducir la incidencia de las enfermedades de los animales acuáticos . Bacillus es una bacteria saprofita grampositiva que se encuentra comúnmente en el entorno de la cría . La investigación y la aplicación de los bacilos en el campo de la acuicultura han atraído mucha atención. La primera aplicación de los probióticos en la acuicultura se llevó a cabo mediante el equilibrio de la población bacteriana en el agua, y logró buenos resultados . Algunos estudios han demostrado que la adición de Bacillus subtilis a los piensos no sólo puede promover el crecimiento de los animales acuáticos y mejorar las actividades de sus enzimas digestivas y su inmunidad inespecífica, sino que también puede mejorar la estructura de su microflora intestinal . A mediados del siglo XX, los académicos chinos comenzaron a estudiar el Bacillus megaterium, centrándose principalmente en el cribado de cepas, en particular su capacidad para descomponer la materia orgánica, su metabolismo del nitrógeno y su aplicación como probióticos en el tratamiento de aguas residuales de la acuicultura .

La carpa común (Cyprinus carpio) es la especie de pez de agua dulce más cultivada en China, y la producción de carpa común fue de 2.962.218 t en 2018 . La carpa espejo Songpu (Cyprinus specularis Songpu), una variedad de la carpa común, representa una proporción cada vez mayor de la producción debido a su crecimiento relativamente más rápido, mejor resistencia a las enfermedades, mayor tasa de conversión de la carne y casi ausencia de escamas en la superficie del cuerpo . Sin embargo, con la expansión y el fomento de la cría de alta densidad, el aumento de la frecuencia de alimentación y la contaminación del agua, los problemas de seguridad y calidad de los alimentos son cada vez más graves.

Los nutrientes se encuentran entre los factores más importantes y fáciles de regular que afectan a la resistencia de los animales acuáticos. La microbiología alimentaria incluye microorganismos que tienen efectos tanto beneficiosos como perjudiciales para la calidad y seguridad de los alimentos y que, por tanto, pueden ser motivo de preocupación para la salud pública. En este estudio, nos propusimos evaluar el efecto de las dietas recubiertas con B. megaterium sobre el crecimiento, la actividad de las enzimas digestivas y la diversidad microbiana intestinal en la carpa espejo Songpu y proporcionar una base teórica para la práctica de una piscicultura sana y ecológica.

2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de la dieta

B. megaterium se preparó en nuestro laboratorio . El contenido de B. megaterium fue . El pienso comercial se compró a Zhejiang AIPHA Feed Co, Ltd., China. Los valores garantizados del análisis de la composición del producto alimenticio se muestran en la Tabla 1. El caldo de fermentación de B. megaterium se roció uniformemente sobre la superficie del material comercial a razón de 100 ml/kg, y a continuación, el pienso rociado se colocó en un lugar fresco durante 1 hora, tras lo cual se utilizó como pienso del grupo experimental. El grupo de control fue alimentado con el pienso comercial inalterado.

2.2. Experimento de alimentación

Las carpas espejo de Songpu (Cyprinus specularis Songpu) (peso corporal ) se obtuvieron en la Estación Experimental Hulan del Instituto de Investigación Pesquera del Río Heilongjiang en la provincia de Heilongjiang, China (45,97°N, 126,63°E). Los peces se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante 14 días y se adaptaron al pienso de control experimental antes del experimento. A continuación, se seleccionaron 90 carpas espejo Songpu sanas y se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (grupo de control y grupo experimental). Cada tratamiento se realizó por triplicado, y cada réplica tenía 15 peces. El grupo de control fue alimentado con pienso comercial. El grupo de tratamiento fue alimentado con pienso comercial recubierto de B. megaterium. La cantidad diaria de alimento fue del 3% del peso corporal de la carpa espejo Songpu, tres veces al día a las 08:00, 12:00 y 19:00 horas. El período experimental completo fue de 56 días. Durante el período experimental, el agua del laboratorio se sustituyó en 1/3 del volumen de agua por semana. La calidad del agua se midió (con YSI professional plus, Ohio State, EE.UU.) diariamente durante el período experimental, la temperatura del agua osciló entre 18 y 25°C, y se utilizó un compresor de aire para añadir oxígeno las 24 horas del día. Los peces se pesaron tanto al principio como al final del ensayo de alimentación.

2.3. Recogida de muestras

Antes del experimento de alimentación, se tomaron al azar diez peces del tanque de cultivo temporal y se midió su peso corporal inicial. A continuación, se recogió el tracto intestinal para la medición de la microflora intestinal inicial (grupo inicial). Al final del ensayo de alimentación de 56 días, aproximadamente 24 h después de la última alimentación, todos los peces fueron anestesiados con MS-222 diluido en el agua a una concentración de 75 mg/l. Estos peces se contaron y pesaron para determinar la tasa de aumento de peso (WGR), la tasa de crecimiento específico (SGR) y la tasa de conversión alimenticia (FCR, Tabla 2).

Tratamiento Control B. megaterium Peso corporal inicial (g) Peso corporal final peso corporal (g) Regreso de sangre (%) a b Regreso de sangre (% día-1) a b FCR a b

Nota: en la misma fila, los valores con superíndices de letras minúsculas diferentes significan una diferencia significativa (), mientras que los que tienen superíndices de letras iguales o no significan ninguna diferencia significativa (). .

Tabla 2

Crecimiento de la carpa espejo Songpu (Cyprinus specularis Songpu) alimentada con dietas recubiertas de B. megaterium durante 56 días ().

Después de obtener el peso final de todos los peces, se seleccionaron al azar cinco peces de cada tanque y se colocaron en una placa de hielo para su rápida disección. Las muestras de tejido, incluyendo el intestino anterior, el intestino medio y el intestino posterior, se recogieron con tijeras asépticas, se lavaron con solución salina fisiológica aséptica, se pesaron y se prepararon en un homogeneizado con solución salina fisiológica aséptica (1 : 4). Todas las muestras se almacenaron inmediatamente a -80°C en un congelador para la determinación de las enzimas digestivas. También se tomaron muestras de otros cinco peces al azar de cada tanque. Las superficies de los peces se desinfectaron con alcohol al 75% antes de llevarlos a una sala de limpieza biológica. Tras una nueva desinfección, se abrió la cavidad abdominal, se limpió el exterior del intestino con alcohol al 75% y se lavó cuatro veces con agua estéril, y luego se recogió el tracto intestinal para evaluar la microflora intestinal final.

2.4. Determinación de enzimas digestivas

Antes de medir los índices de inmunidad, el intestino anterior, el intestino medio y el intestino posterior agrupados se homogeneizaron manualmente en un homogeneizador de vidrio con 0,86% de NaCl (/) para obtener un homogeneizado al 10%. Tras la centrifugación (4000 rpm, 10 min) a 4°C, se obtuvo el sobrenadante, compuesto principalmente por líquido enzimático crudo. Las actividades de amilasa, proteasa y lipasa en el intestino anterior, el intestino medio y el intestino posterior se analizaron espectrofotométricamente utilizando kits de reactivos de diagnóstico (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Amplificación del gen 16S rRNA y secuenciación Illumina

El ADN microbiano se extrajo de las muestras intestinales utilizando el kit E.Z.N.A.® Soil DNA (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La concentración final de ADN y la purificación se determinaron con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 UV-vis (Thermo Scientific, Wilmington, EE.UU.), y la calidad del ADN se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Las regiones hipervariables V4-V5 de los genes 16S rRNA bacterianos se amplificaron con los cebadores 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3) y 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) utilizando un sistema PCR termociclador (GeneAmp 9700, ABI, EEUU). Las PCR se realizaron utilizando el siguiente programa: 3 min de desnaturalización a 95°C, 27 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s de recocido a 55°C y 45 s de elongación a 72°C, y una extensión final a 72°C durante 10 min. Los productos resultantes de la PCR se extrajeron de un gel de agarosa al 2% y se purificaron posteriormente utilizando un kit de extracción de ADN en gel AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, EE.UU.) y se cuantificaron utilizando QuantiFluor™-ST (Promega, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los amplicones purificados se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron por pares () en una plataforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, EE.UU.) según los protocolos estándar de Majorbio Bio-Pharm Technology Co. (Shanghai, China).

2.6. Análisis estadístico

Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se agruparon con un corte de similitud del 97% utilizando UPARSE (versión 7.1, http://drive5.com/uparse/) con un novedoso algoritmo «codicioso» que realiza simultáneamente el filtrado de quimeras y la agrupación de OTU. La taxonomía de cada secuencia del gen 16S rRNA fue analizada por el algoritmo RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) contra la base de datos SILVA 16S rRNA utilizando un umbral de confianza del 70%. Los índices estimadores Chao y ACE fueron seleccionados para identificar la riqueza de la comunidad, y los índices Shannon y Simpson fueron utilizados para identificar la diversidad de la comunidad . Todos estos índices en nuestras muestras se calcularon con QIIME (versión 1.7.0) y se prepararon para su visualización con el software R (versión 2.15.3). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software estadístico SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Los datos se expresan como el de tres réplicas. Los datos se sometieron a un ANOVA de una vía, y cuando se encontraron diferencias, las medias se clasificaron mediante la prueba de comparación múltiple de Duncan. Las diferencias se consideraron significativas a los .

3. Resultados

3.1. Efecto de la dieta recubierta con B. megaterium sobre el crecimiento de los peces

Como se muestra en la Tabla 2, la tasa de ganancia de peso y la tasa de crecimiento específica del grupo de tratamiento (71,03%, 0,42% día-1) aumentaron significativamente en comparación con las del grupo de control (52,75%, 0,33% día-1, ), y el índice de conversión alimenticia del grupo de tratamiento (1,28) fue significativamente menor que el del grupo de control (2,23, ). No se observó ninguna mortalidad durante los 56 días del ensayo de alimentación.

3.2. Efecto de la dieta recubierta de B. megaterium sobre la actividad de las enzimas digestivas

Los efectos de la dieta recubierta de B. megaterium sobre la actividad de las enzimas digestivas se muestran en la Tabla 3. La actividad de la amilasa del intestino anterior en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que la del grupo de control (). Las actividades de amilasa del intestino medio y del intestino posterior en el grupo de tratamiento fueron significativamente superiores a las del grupo de control, pero no hubo diferencias significativas (). Las actividades de la proteasa del intestino anterior, medio y posterior del grupo de tratamiento fueron mayores que las del grupo de control, pero no hubo diferencias significativas (). La actividad de la lipasa del intestino anterior en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que la del grupo de control (). Las actividades de la lipasa del intestino medio y del intestino posterior en el grupo de tratamiento fueron básicamente las mismas que las del grupo de control, y no hubo diferencias significativas ().

Proteasa Tratamiento Intestino medio Intestino posterior Control B. megaterium Control B. megaterium Control B. megaterium Amilasa a b Proteasa a b Lipasa a b

Nota: en la misma columna, los valores con superíndices de letras minúsculas diferentes significan diferencia significativa (), mientras que los que tienen superíndices iguales o sin letras significan sin diferencia significativa ().

Tabla 3

Actividades de las enzimas digestivas en el intestino (intestino anterior, medio y posterior) de la carpa espejo Songpu alimentada con dietas recubiertas de B. megaterium (U/g de proteína). Efecto de la dieta recubierta con B. megaterium en la diversidad y riqueza microbiana intestinal

La diversidad microbiana intestinal de la carpa espejo de Songpu se determinó mediante secuenciación de alto rendimiento. El número medio de OTUs detectadas a partir de la muestra inicial del grupo fue de 63. Después de 56 días, el número medio de OTUs detectados en los grupos de control y de tratamiento fue de 114 y 196, respectivamente. El índice de cobertura de todas las muestras fue superior a 0,97, lo que indica que hubo una alta tasa de detección. Como se muestra en la Tabla 4, los índices Chao y ACE, que reflejan la riqueza de la microflora intestinal de la carpa espejo de Songpu, fueron significativamente mayores en el grupo de tratamiento después de 56 días que en los grupos de control e inicial (). El índice de Shannon de la diversidad de la comunidad intestinal en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que en el grupo de control (). El índice de Simpson de la diversidad de la comunidad intestinal en el grupo de tratamiento fue significativamente inferior al del grupo de control (). No hubo diferencias significativas para los cuatro índices anteriores entre el grupo de control y el inicial ().

Grupos Índice de enriquecimiento Índice de diversidad Chao ACE Simpson Shannon Inicial a a a a Control a a a a B. megaterium b b b b

Nota: en la misma columna, los valores con superíndices de letras minúsculas diferentes significan diferencia significativa (), mientras que los que tienen los mismos superíndices o sin ellos significan sin diferencia significativa ().

Tabla 4

Efectos de las dietas recubiertas de B. megaterium sobre la abundancia y diversidad de la microflora intestinal de la carpa espejo de Songpu.

3.4. Efecto de la dieta recubierta de B. megaterium sobre la composición y los cambios de la microbiota principal en el intestino de la carpa espejo de Songpu

Se tomó como microflora principal una riqueza microbiana intestinal superior al 1% a nivel de phylum para las estadísticas presentadas en la figura 1. El phylum dominante en el intestino del grupo inicial era predominantemente Fusobacterias (86,36%) y Bacteroidetes (8,60%) antes de comenzar el experimento. Tras el ensayo de alimentación de 56 días, el número de la principal microflora intestinal aumentó en cada grupo. En el grupo de control, los filos dominantes eran Fusobacterias (86,36%), Bacteroidetes (14,4%), Firmicutes (2,42%) y Proteobacterias (1,37%). En el grupo de tratamiento, los filos dominantes fueron Firmicutes (69,15%), Proteobacterias (23,8%), Bacteroidetes (4,65%) y Actinobacterias (1,43%). Se tomó como microflora principal para los cálculos estadísticos una riqueza microbiana intestinal superior al 0,5% a nivel de género, que se muestra en la Tabla 5. Sólo había 5 géneros de los principales microorganismos intestinales en el grupo inicial. Después del ensayo de alimentación de 56 días, los principales microorganismos intestinales aumentaron a 11 géneros en el grupo de tratamiento. El microorganismo más abundante en el intestino de la carpa espejo Songpu en el grupo inicial era Cetobacterium. Tras el ensayo de alimentación de 56 días, el microorganismo más abundante en el grupo de control seguía siendo Cetobacterium. En el grupo de control, los 11 géneros dominantes fueron Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified y Yersinia. Las carpas espejo de Songpu alimentadas con una dieta recubierta de B. megaterium mostraron mayores proporciones de Bacillus y Lactococcus intestinales a nivel de género, siendo ambas significativamente mayores que las del grupo de control ().

Figura 1

Composición microbiana intestinal a nivel de filo en la carpa espejo Songpu alimentada con una dieta recubierta con B. megaterium durante 56 días.

Son los únicos que pueden ser clasificados. Género Tratamientos Inicial Control B. megaterium Cetobacterium – Lactococcus – – Bacillus – – Enterobacteriaceae_unclassified – – – Bacteroides – Comamonadaceae_unclassified – Yersinia – Pseudomonas – – Pseudoxanthomonas – – – Fusobacteriales_sin clasificar – Stenotrophomonas – Psicrobacter – – Leucobacter – – Brochothrix – – Myroides – Barnesiella – Rhodobacter – – Arenimonas – – Clostridium – – Arthrobacter – Flavobacterium – Otros

Notas: – significa que el porcentaje del género que representa el total de la microflora intestinal es inferior al 0,5%.

Tabla 5

Porcentajes de los principales géneros de la microflora intestinal en la carpa espejo Songpu alimentada con una dieta recubierta de B. megaterium durante 56 días.

4. Discusión

Los probióticos, como los bacilos, se han utilizado ampliamente en la acuicultura. Algunos estudios han demostrado que la adición de varias cepas de Bacillus spp. a los piensos para larvas ha logrado buenos resultados y tiene un buen efecto promotor del crecimiento de las larvas de peces . La adición de bacterias (cepa CA2) como suplemento alimenticio a los cultivos xénicos de larvas de la ostra Crassostrea gigas mejoró sistemáticamente el crecimiento de las larvas durante diferentes estaciones del año . La manipulación de la microbiota mediante el uso de probióticos se ha señalado como una práctica digna para la acuicultura con el fin de controlar o inhibir las bacterias patógenas y mejorar el rendimiento del crecimiento y la actividad de las enzimas digestivas . En comparación con el grupo de control no tratado, el peso final y el aumento de peso fueron significativamente mayores en los camarones alimentados con una mezcla de dietas de dos cepas probióticas . En este estudio, se comprobó que una dieta recubierta de B. megaterium aumentaba la tasa de ganancia de peso y la tasa de crecimiento específica y reducía el índice de conversión alimenticia, lo que indica que las dietas recubiertas de B. megaterium pueden promover el crecimiento de la carpa espejo Songpu. Se encontraron resultados similares en el bagre Clarias sp., donde la adición de B. megaterium PTB 1.4 a su dieta mejoró significativamente su tasa de crecimiento . También se encontraron resultados similares en Penaeus monodon, para el que se obtuvieron valores más altos de FCR y SGR tras la adición de Bacillus cereus.

Las bacterias probióticas son capaces de producir enzimas digestivas que ayudan a los peces a utilizar los nutrientes del pienso y a digerirlos. La adición de B. megaterium a las harinas de proteínas vegetales puede promover el desarrollo de la morfología intestinal y aumentar la actividad de las enzimas digestivas . El estudio de los probióticos para la carpa común Cyprinus carpio basado en el rendimiento del crecimiento y la actividad de las enzimas digestivas mostró que la media de las actividades de las enzimas digestivas de todos los grupos de tratamiento con probióticos era significativamente diferente de la del control . En el presente estudio, una dieta recubierta de B. megaterium tuvo un efecto positivo e importante sobre las actividades de las enzimas digestivas, especialmente las de amilasa y proteasa en el intestino anterior, medio y posterior. También se obtuvieron resultados similares en las tilapias, que mostraron una mejora en la digestión de los alimentos y en el crecimiento tras la adición de Bacillus NP5 a su alimentación. El mayor nivel de actividad enzimática obtenido con las dietas que contenían probióticos mejoró la digestión de las proteínas, el almidón, la grasa y la celulosa, lo que a su vez podría explicar el mejor crecimiento observado con las dietas suplementadas con probióticos . Las enzimas digestivas ayudan a los peces a descomponer y digerir los nutrientes del alimento, facilitando su absorción.

Los avances en la secuenciación de alto rendimiento han permitido disponer de un amplio catálogo de muestras metagenómicas, que permiten conocer la diversidad de las especies microbianas de una gran variedad de fuentes, como el océano, el suelo y el cuerpo humano. Estos estudios utilizan tanto la secuenciación del gen del ARNr 16S para determinar las relaciones filogenéticas como una secuenciación de escopeta más completa para predecir la composición detallada de las especies y los genes. El índice de riqueza y el índice de diversidad son índices importantes para detectar la diversidad y la complejidad de los microorganismos en las muestras . En este estudio, con el crecimiento de la carpa espejo Songpu, la diversidad y la riqueza microbiana intestinal aumentaron, y los índices Chao y ACE, que reflejan la riqueza de la microflora intestinal de la carpa espejo Songpu, fueron significativamente mayores en el grupo de tratamiento que en el grupo de control. Además, el índice de Shannon de la diversidad de la comunidad intestinal en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que en el grupo de control. Del mismo modo, los resultados también mostraron que la estructura de la microflora intestinal se modificó cuando los juveniles de dorada fueron alimentados con dietas suplementadas con diferentes niveles de Bacillus subtilis . La adición de probióticos a los piensos también puede cambiar el número y la estructura de la microflora original en el tracto intestinal de Litopenaeus vannamei y promover las complejas interacciones entre las comunidades microbianas en el tracto intestinal de Litopenaeus vannamei.

En este estudio, las carpas espejo de Songpu alimentadas con una dieta recubierta con B. megaterium mostraron mayores proporciones de Bacillus y Lactococcus intestinales a nivel de género, que fueron significativamente mayores que las del grupo de control. Los resultados también indicaron que la composición y las proporciones de la microbiota principal en el intestino de la carpa espejo Songpu pueden modificarse con dietas recubiertas de B. megaterium. En conclusión, el uso de dietas recubiertas con B. megaterium puede mejorar significativamente el crecimiento de los peces y reducir el índice de conversión alimenticia, mejorar las actividades de las enzimas digestivas y enriquecer la composición de géneros beneficiosos de la microflora intestinal principal.

Disponibilidad de datos

Todos los datos fueron proporcionados en el artículo, y no hay más datos que cargar.

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por los Fondos Especiales de los Institutos de Investigación Científica sin ánimo de lucro de nivel central (no. HSY202005M), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Heilongjiang (n.º QC2018038), el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público, la Academia China de Ciencias Pesqueras (n.º 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 y 2020TD56), el Programa Nacional Clave de I+D de China (n.º 2019YFD0900302). 2019YFD0900302), y el Laboratorio Clave de Biotecnología Acuática de Agua Dulce y Cría, Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales, Instituto de Investigación Pesquera de Heilongjiang, Academia China de Ciencias Pesqueras (nº FBB2017-04).