- Abstract
- 1. Introduction
- 2. Matériaux et méthodes
- 2.1. Préparation du régime alimentaire
- 2.2. Expérience d’alimentation
- 2.3. Collecte des échantillons
- 2.4. Détermination des enzymes digestives
- 2.5. Amplification du gène 16S rRNA et séquençage Illumina
- 2.6. Analyse statistique
- 3. Résultats
- 3.1. Effet du régime alimentaire enrobé de B. megaterium sur la croissance des poissons
- 3.2. Effet du régime enrobé de B. megaterium sur l’activité enzymatique digestive
- 3.3. Effet du régime enrobé de B. megaterium sur la diversité et la richesse microbiennes intestinales
- 3.4. Effet du régime alimentaire enrobé de B. megaterium sur la composition et les changements du microbiote principal dans l’intestin de la carpe miroir Songpu
- 4. Discussion
- Data Availability
- Conflits d’intérêts
- Remerciements
Abstract
La présente étude a été menée pour évaluer l’effet d’un régime alimentaire enrobé de Bacillus megaterium sur les performances de croissance, enzymes digestives, et la diversité microbienne intestinale chez la carpe miroir Songpu (Cyprinus specularis Songpu). Les poissons ont été nourris manuellement avec deux régimes (un régime de contrôle et un régime enrobé de B. megaterium) trois fois par jour jusqu’à satiété apparente pendant 56 jours. Par rapport au groupe témoin, la supplémentation avec le régime enrobé de B. megaterium a amélioré la croissance des poissons et réduit de manière significative le ratio de conversion alimentaire (). Les activités de l’amylase et de la lipase de l’intestin antérieur dans le groupe traité étaient significativement plus élevées que celles du groupe témoin (). Les activités des protéases de l’intestin antérieur, de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur dans le groupe traité étaient toutes supérieures à celles du groupe témoin (). Les résultats du séquençage des gènes de l’ADNr 16S du microbiote par séquençage à haut débit ont montré que la diversité et l’abondance de la microflore intestinale augmentaient avec la croissance de la carpe miroir Songpu. Les carpes miroir Songpu nourries avec un régime enrobé de B. megaterium présentaient des proportions accrues de Bacillus et de Lactococcus intestinaux au niveau du genre, et les deux étaient significativement plus élevées que celles du groupe témoin (). Ces résultats suggèrent donc que l’application alimentaire de B. megaterium peut améliorer la croissance et l’activité enzymatique digestive de la carpe miroir Songpu et enrichir la composition en genres bénéfiques de sa microflore intestinale principale.
1. Introduction
Le poisson, comme l’une des principales sources alimentaires de protéines animales, joue un rôle très important dans la structure alimentaire humaine. Cependant, ces dernières années, la sécurité des produits aquatiques est devenue l’un des plus grands facteurs entravant le développement des produits aquatiques en raison des préoccupations concernant la sécurité des hormones, des antibiotiques et des micro-organismes excessifs . Avec le développement rapide de l’élevage intensif à haute densité, l’environnement aquatique se détériore quotidiennement, ce qui entraîne des épidémies et même des décès massifs d’animaux d’élevage. Il est urgent de trouver des alternatives sûres et respectueuses de l’environnement pour assurer la croissance saine des animaux d’élevage .
En tant que nouvel additif alimentaire après l’ère des antibiotiques, les probiotiques sont considérés comme des substituts importants des antibiotiques alimentaires . Des études ont montré que l’utilisation de probiotiques peut non seulement favoriser la croissance des animaux aquatiques et améliorer leur taux de survie, mais aussi réduire l’incidence des maladies des animaux aquatiques . Le Bacillus est une bactérie gram-positive saprophyte que l’on trouve couramment dans l’environnement d’élevage. La recherche et l’application de Bacillus dans le domaine de l’aquaculture ont attiré beaucoup d’attention. La première application des probiotiques en aquaculture a été réalisée en équilibrant la population bactérienne dans l’eau, et elle a donné de bons résultats. Certaines études ont montré que l’ajout de Bacillus subtilis à la nourriture peut non seulement favoriser la croissance des animaux aquatiques et améliorer les activités de leurs enzymes digestives et leur immunité non spécifique, mais aussi améliorer la structure de leur microflore intestinale . Au milieu du 20e siècle, les universitaires chinois ont commencé à étudier Bacillus megaterium, en se concentrant principalement sur le dépistage des souches, en particulier leur capacité à décomposer la matière organique, leur métabolisme de l’azote et leur application comme probiotiques dans le traitement des eaux usées de l’aquaculture .
La carpe commune (Cyprinus carpio) est l’espèce de poisson d’eau douce la plus cultivée en Chine, et la production de carpe commune était de 2 962 218 t en 2018 . La carpe miroir Songpu (Cyprinus specularis Songpu), une variété de carpe commune, représente une proportion de plus en plus importante de la production en raison de sa croissance relativement plus rapide, de sa meilleure résistance aux maladies, de son taux de conversion en viande plus élevé et de la quasi-absence d’écailles à la surface du corps . Cependant, avec l’expansion et la promotion de l’élevage à haute densité, l’augmentation de la fréquence d’alimentation et la pollution de l’eau, les problèmes de sécurité et de qualité des aliments sont devenus de plus en plus graves.
Les nutriments sont parmi les facteurs les plus importants et les plus faciles à réguler qui affectent la résistance des animaux aquatiques. La microbiologie alimentaire comprend les micro-organismes qui ont des effets bénéfiques et délétères sur la qualité et la sécurité des aliments et peuvent donc être préoccupants pour la santé publique. Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer l’effet des régimes enrobés de B. megaterium sur la croissance, l’activité des enzymes digestives et la diversité microbienne intestinale de la carpe miroir Songpu et à fournir une base théorique pour la pratique d’une pisciculture saine et écologique.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Préparation du régime alimentaire
B. megaterium a été préparé dans notre laboratoire . La teneur en B. megaterium était . L’aliment commercial a été acheté auprès de Zhejiang AIPHA Feed Co, Ltd, Chine. Les valeurs garanties de l’analyse de la composition du produit alimentaire sont indiquées dans le tableau 1. Le bouillon de fermentation de B. megaterium a été pulvérisé uniformément sur la surface du matériau commercial à raison de 100 ml/kg, puis l’aliment pulvérisé a été placé dans un endroit frais pendant 1 heure, après quoi il a été utilisé comme aliment du groupe expérimental. Le groupe témoin a reçu l’aliment commercial non modifié.
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2.2. Expérience d’alimentation
Les carpes miroir Songpu (Cyprinus specularis Songpu) (poids corporel ) ont été obtenues de la station expérimentale Hulan de l’Institut de recherche sur la pêche du fleuve Heilongjiang dans la province du Heilongjiang, en Chine (45,97°N, 126,63°E). Les poissons ont été acclimatés aux conditions de laboratoire pendant 14 jours et adaptés à l’alimentation expérimentale de contrôle avant l’expérience. Ensuite, 90 carpes miroir Songpu en bonne santé ont été sélectionnées et réparties au hasard en deux groupes (groupe témoin et groupe expérimental). Chaque traitement a été effectué en trois exemplaires, et chaque réplique comptait 15 poissons. Le groupe témoin a été nourri avec des aliments commerciaux. Le groupe expérimental a été nourri avec des aliments commerciaux enrobés de B. megaterium. La quantité quotidienne de nourriture était de 3% du poids corporel de la carpe miroir Songpu, trois fois par jour à 08h00, 12h00 et 19h00. La période expérimentale totale a duré 56 jours. Pendant la période expérimentale, l’eau du laboratoire a été remplacée par 1/3 du volume d’eau par semaine. La qualité de l’eau a été mesurée (à l’aide de YSI professional plus, Ohio State, USA) quotidiennement pendant la période expérimentale, la température de l’eau était comprise entre 18 et 25°C, et un compresseur d’air a été utilisé pour ajouter de l’oxygène 24 heures par jour. Les poissons ont été pesés au début et à la fin de l’essai d’alimentation.
2.3. Collecte des échantillons
Avant l’expérience d’alimentation, dix poissons ont été prélevés au hasard dans le réservoir de culture temporaire, et leur poids corporel initial a été mesuré. Ensuite, le tractus intestinal a été prélevé pour la mesure de la microflore intestinale initiale (groupe initial). À la fin de l’essai d’alimentation de 56 jours, environ 24 h après la dernière alimentation, tous les poissons ont été anesthésiés avec du MS-222 dilué dans l’eau à une concentration de 75 mg/l. Ces poissons ont été comptés et pesés pour déterminer le taux de gain de poids (WGR), le taux de croissance spécifique (SGR) et l’indice de consommation (FCR, tableau 2) .
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Note : dans une même ligne, les valeurs dont l’exposant est une lettre minuscule différente signifient une différence significative (), tandis que celles dont l’exposant est identique ou sans lettre ne signifient pas de différence significative (). . .
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Après avoir obtenu le poids final de tous les poissons, cinq poissons de chaque réservoir ont été choisis au hasard et placés dans une plaque de glace pour une dissection rapide. Les échantillons de tissus, y compris l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur, ont été collectés avec des ciseaux aseptiques, lavés avec du sérum physiologique aseptique, pesés, puis préparés en un homogénat avec du sérum physiologique aseptique (1 : 4). Tous les échantillons ont été immédiatement stockés à -80°C dans un congélateur pour la détermination des enzymes digestives. Cinq autres poissons ont également été échantillonnés au hasard dans chaque réservoir. Les surfaces des poissons ont été désinfectées avec de l’alcool à 75% avant que les poissons ne soient emmenés dans une salle de bioclean. Après une désinfection supplémentaire, la cavité abdominale a été ouverte, l’extérieur de l’intestin a été essuyé avec de l’alcool à 75% et lavé quatre fois avec de l’eau stérile, puis le tractus intestinal a été collecté pour l’évaluation de la microflore intestinale finale.
2.4. Détermination des enzymes digestives
Avant de mesurer les indices d’immunité, l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur regroupés ont été homogénéisés manuellement dans un homogénéisateur en verre avec 0,86% de NaCl (/) pour obtenir un homogénat à 10%. Après centrifugation (4000 rpm, 10 min) à 4°C, le surnageant, constitué principalement de liquide enzymatique brut, a été obtenu. Les activités de l’amylase, de la protéase et de la lipase dans l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur ont été analysées par spectrophotométrie en utilisant des kits de réactifs de diagnostic (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Chine).
2.5. Amplification du gène 16S rRNA et séquençage Illumina
L’ADN microbien a été extrait des échantillons intestinaux à l’aide du kit E.Z.N.A.® Soil DNA (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) conformément aux protocoles du fabricant. La concentration finale d’ADN et la purification ont été déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA), et la qualité de l’ADN a été déterminée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%. Les régions hypervariables V4-V5 des gènes de l’ARNr 16S bactérien ont été amplifiées avec les amorces 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3) et 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) en utilisant un système de thermocyclage PCR (GeneAmp 9700, ABI, USA). Les PCR ont été réalisées en utilisant le programme suivant : 3 min de dénaturation à 95°C, 27 cycles de 30 s à 95°C, 30 s pour le recuit à 55°C, et 45 s pour l’élongation à 72°C, et une extension finale à 72°C pendant 10 min. Les produits PCR résultants ont été extraits d’un gel d’agarose à 2 %, puis purifiés à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN sur gel AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, États-Unis) et quantifiés à l’aide de QuantiFluor™-ST (Promega, États-Unis) conformément au protocole du fabricant. Les amplicons purifiés ont été regroupés en quantités équimolaires et séquencés en paires () sur une plateforme Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, États-Unis) selon les protocoles standard de Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine) .
2.6. Analyse statistique
Les unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) ont été regroupées avec un seuil de similarité de 97% en utilisant UPARSE (version 7.1, http://drive5.com/uparse/) avec un nouvel algorithme « greedy » qui effectue simultanément le filtrage des chimères et le regroupement des OTUs. La taxonomie de chaque séquence du gène de l’ARNr 16S a été analysée par l’algorithme RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) par rapport à la base de données de l’ARNr 16S SILVA en utilisant un seuil de confiance de 70%. Les indices de Chao et de l’estimateur ACE ont été choisis pour identifier la richesse de la communauté, et les indices de Shannon et de Simpson ont été utilisés pour identifier la diversité de la communauté. Tous ces indices dans nos échantillons ont été calculés avec QIIME (version 1.7.0) et préparés pour être affichés avec le logiciel R (version 2.15.3). Les analyses statistiques ont été réalisées avec le progiciel statistique SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Les données sont exprimées par rapport à trois répétitions. Les données ont été soumises à une ANOVA à sens unique, et lorsque des différences ont été trouvées, les moyennes ont été classées en utilisant le test de comparaison multiple de Duncan. Les différences ont été considérées comme significatives à .
3. Résultats
3.1. Effet du régime alimentaire enrobé de B. megaterium sur la croissance des poissons
Comme le montre le tableau 2, le taux de gain de poids et le taux de croissance spécifique du groupe de traitement (71,03%, 0,42% jour-1) ont été significativement augmentés par rapport à ceux du groupe témoin (52,75%, 0,33% jour-1, ), et le ratio de conversion alimentaire du groupe de traitement (1,28) était significativement plus bas que celui du groupe témoin (2,23, ). Aucune mortalité n’a été observée pendant les 56 jours de l’essai d’alimentation.
3.2. Effet du régime enrobé de B. megaterium sur l’activité enzymatique digestive
Les effets du régime enrobé de B. megaterium sur l’activité enzymatique digestive sont présentés dans le tableau 3. L’activité amylasique de l’intestin antérieur dans le groupe traité était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (). Les activités amylasiques de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur du groupe traité étaient significativement plus élevées que celles du groupe témoin, mais il n’y avait pas de différences significatives (). Les activités protéasiques de l’intestin antérieur, de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur du groupe traité étaient supérieures à celles du groupe témoin, mais il n’y avait pas de différence significative (). L’activité lipasique de l’intestin antérieur du groupe traité était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (). Les activités lipasiques de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur dans le groupe de traitement étaient fondamentalement les mêmes que celles du groupe témoin, et il n’y avait pas de différences significatives ().
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Note : dans la même colonne, les valeurs avec des superscripts différents en petites lettres signifient une différence significative (), tandis que celles avec des superscripts identiques ou sans lettre ne signifient pas de différence significative ().
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3.3. Effet du régime enrobé de B. megaterium sur la diversité et la richesse microbiennes intestinales
La diversité microbienne intestinale de la carpe miroir Songpu a été déterminée par séquençage à haut débit. Le nombre moyen d’OTUs détectés à partir de l’échantillon collectif initial était de 63. Après 56 jours, le nombre moyen d’OTUs détectés dans les groupes de contrôle et de traitement était de 114 et 196, respectivement. L’indice de couverture de tous les échantillons était supérieur à 0,97, ce qui indique que le taux de détection était élevé. Comme le montre le tableau 4, les indices Chao et ACE, qui reflètent la richesse de la microflore intestinale de la carpe miroir de Songpu, étaient significativement plus élevés dans le groupe traité après 56 jours que dans les groupes témoin et initial (). L’indice de Shannon de la diversité de la communauté intestinale dans le groupe traité était significativement plus élevé que celui du groupe témoin (). L’indice de Simpson de la diversité de la communauté intestinale dans le groupe traité était significativement inférieur à celui du groupe témoin (). Il n’y avait pas de différences significatives pour les quatre indices ci-dessus entre le groupe témoin et le groupe initial ().
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Note : dans une même colonne, les valeurs avec des exposants différents en petites lettres signifient une différence significative (), tandis que celles avec des exposants identiques ou sans lettre ne signifient pas de différence significative ().
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3.4. Effet du régime alimentaire enrobé de B. megaterium sur la composition et les changements du microbiote principal dans l’intestin de la carpe miroir Songpu
Une richesse microbienne intestinale de plus de 1% au niveau du phylum a été prise comme microflore principale pour les statistiques présentées dans la figure 1. Le phylum dominant dans l’intestin du groupe initial était principalement constitué de Fusobactéries (86,36%) et de Bacteroidetes (8,60%) avant le début de l’expérience. Après l’essai d’alimentation de 56 jours, le nombre des principales microflores intestinales a augmenté dans chaque groupe. Dans le groupe témoin, les phyla dominants étaient les Fusobactéries (86,36 %), les Bactéroïdètes (14,4 %), les Firmicutes (2,42 %) et les Protéobactéries (1,37 %). Dans le groupe traité, les phyla dominants étaient les Firmicutes (69,15 %), les Proteobacteria (23,8 %), les Bacteroidetes (4,65 %) et les Actinobacteria (1,43 %). Une richesse microbienne intestinale de plus de 0,5 % au niveau du genre a été considérée comme la microflore principale pour les calculs statistiques, présentés dans le tableau 5. Il n’y avait que 5 genres des principaux microorganismes intestinaux dans le groupe initial. Après l’essai d’alimentation de 56 jours, les principaux microorganismes intestinaux sont passés à 11 genres dans le groupe de traitement. Le micro-organisme le plus abondant dans l’intestin de la carpe miroir Songpu du groupe initial était Cetobacterium. Après l’essai d’alimentation de 56 jours, le microorganisme le plus abondant dans le groupe témoin était toujours Cetobacterium. Dans le groupe témoin, les 11 genres dominants étaient Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified, et Yersinia. La carpe miroir Songpu nourrie avec un régime enrobé de B. megaterium a présenté des proportions accrues de Bacillus et Lactococcus intestinaux au niveau du genre, qui étaient tous deux significativement plus élevés que ceux du groupe témoin ().
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Notes : – signifie que le pourcentage du genre représentant la microflore intestinale totale est inférieur à 0,5%.
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4. Discussion
Les probiotiques tels que les Bacilles ont été largement utilisés en aquaculture. Certaines études ont montré que l’ajout de diverses souches de Bacillus spp à l’alimentation des larves a obtenu de bons résultats et a un bon effet promoteur sur la croissance des larves de poissons . L’ajout de bactéries (souche CA2) comme complément alimentaire à des cultures larvaires xéniques de l’huître Crassostrea gigas a amélioré de façon constante la croissance des larves pendant différentes saisons de l’année. La manipulation du microbiote à l’aide de probiotiques a été signalée comme une pratique valable pour l’aquaculture afin de contrôler ou d’inhiber les bactéries pathogènes et d’améliorer les performances de croissance et l’activité des enzymes digestives. Par rapport au groupe témoin non traité, le poids final et le gain de poids étaient significativement plus élevés chez les crevettes nourries avec un mélange de deux régimes à base de souches probiotiques . Dans cette étude, il a été constaté qu’un régime enrobé de B. megaterium augmentait le taux de gain de poids et le taux de croissance spécifique et réduisait le ratio de conversion alimentaire, ce qui indique que les régimes enrobés de B. megaterium peuvent favoriser la croissance de la carpe miroir Songpu. Des résultats similaires ont été trouvés chez le poisson-chat Clarias sp. où l’ajout de B. megaterium PTB 1.4 à leur alimentation a significativement amélioré leur taux de croissance. Des résultats similaires ont également été trouvés chez Penaeus monodon, pour lequel des valeurs plus élevées de FCR et de SGR ont été obtenues après l’ajout de Bacillus cereus .
Les bactéries probiotiques sont capables de produire des enzymes digestives qui aident les poissons à utiliser les nutriments de l’alimentation et à les digérer . L’ajout de B. megaterium aux repas de protéines végétales peut favoriser le développement de la morphologie intestinale et augmenter l’activité des enzymes digestives . L’étude des probiotiques pour la carpe commune Cyprinus carpio basée sur la performance de croissance et les activités des enzymes digestives a montré que les activités moyennes des enzymes digestives de tous les groupes de traitement probiotique étaient significativement différentes de celles du contrôle . Dans la présente étude, un régime alimentaire enrobé de B. megaterium a eu un effet positif et important sur les activités des enzymes digestives, en particulier celles de l’amylase et de la protéase dans l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur. Des résultats similaires ont également été trouvés chez les tilapias, qui ont montré une amélioration de la digestion des aliments et de la croissance après l’ajout de Bacillus NP5 à leur alimentation . Un niveau plus élevé d’activité enzymatique obtenu avec les régimes contenant des probiotiques a amélioré la digestion des protéines, de l’amidon, des graisses et de la cellulose, ce qui pourrait, à son tour, expliquer la meilleure croissance observée avec les régimes supplémentés en probiotiques. Les enzymes digestives aident les poissons à décomposer et à digérer les nutriments contenus dans les aliments, ce qui facilite l’absorption de ces nutriments par le poisson.
Les progrès du séquençage à haut débit ont permis la création d’un vaste catalogue d’échantillons métagénomiques, donnant un aperçu de la diversité des espèces microbiennes provenant d’une grande variété de sources, notamment l’océan, le sol et le corps humain. Ces études utilisent à la fois le séquençage du gène de l’ARNr 16S pour déterminer les relations phylogénétiques et un séquençage shotgun plus complet pour prédire la composition détaillée des espèces et des gènes. L’indice de richesse et l’indice de diversité sont des indices importants pour détecter la diversité et la complexité des micro-organismes dans les échantillons. Dans cette étude, avec la croissance de la carpe miroir Songpu, la diversité et la richesse microbienne intestinale ont augmenté, et les indices Chao et ACE, qui reflètent la richesse de la microflore intestinale de la carpe miroir Songpu, étaient significativement plus élevés dans le groupe de traitement que dans le groupe de contrôle. En outre, l’indice de Shannon de la diversité de la communauté intestinale dans le groupe traité était significativement plus élevé que dans le groupe témoin. De même, les résultats ont également montré que la structure de la microflore intestinale était modifiée lorsque les jeunes daurades à museau émoussé étaient nourries avec des régimes complétés par différents niveaux de Bacillus subtilis . L’ajout de probiotiques à l’alimentation peut également modifier le nombre et la structure de la microflore originale dans le tractus intestinal de Litopenaeus vannamei et promouvoir les interactions complexes entre les communautés microbiennes dans le tractus intestinal de Litopenaeus vannamei .
Dans cette étude, la carpe miroir Songpu nourrie avec un régime enrobé de B. megaterium a affiché des proportions accrues de Bacillus et de Lactococcus intestinaux au niveau du genre, qui étaient tous deux significativement plus élevés que ceux du groupe témoin. Les résultats indiquent également que la composition et les proportions du microbiote principal dans l’intestin de la carpe miroir Songpu peuvent être modifiées avec des régimes enrobés de B. megaterium. En conclusion, l’utilisation de régimes alimentaires enrobés de B. megaterium peut considérablement améliorer la croissance des poissons et réduire le ratio de conversion alimentaire, améliorer les activités des enzymes digestives et enrichir la composition des genres bénéfiques de la microflore intestinale principale.
Data Availability
Toutes les données ont été fournies dans l’article, et il n’y a pas d’autres données à télécharger.
Conflits d’intérêts
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été financée par les fonds spéciaux des instituts de recherche scientifique sans but lucratif de niveau central (no. HSY202005M), la Fondation des sciences naturelles de la province de Heilongjiang (no. QC2018038), le Fonds de recherche de base des institutions scientifiques d’intérêt public central, Académie chinoise des sciences de la pêche (nos. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502, et 2020TD56), le Programme national clé R&D de Chine (no. 2019YFD0900302), et le Laboratoire clé de biotechnologie et d’élevage aquatique d’eau douce, ministère de l’Agriculture et des Affaires rurales, Institut de recherche sur la pêche du Heilongjiang, Académie chinoise des sciences de la pêche (n° FBB2017-04).
