Notre clientèle à Biotage a des antécédents intéressants et diversifiés, allant de chimistes de synthèse hautement qualifiés, à des experts en chimie des produits naturels, à ceux qui commencent tout juste leur voyage avec la chimie. Ce que j’ai appris au cours de ma carrière de plus de 40 ans dans l' »art » de la chromatographie, c’est que pour beaucoup de ces personnes, il y a un manque de compréhension des principes chromatographiques. Ce manque de compréhension, je crois, est seulement dû à leur programme d’études de base où la science de la séparation est utilisée comme un outil pendant les travaux de laboratoire, mais les principes derrière pourquoi les composants d’un mélange se séparent (ou ne se séparent pas) peut-être ne sont pas efficacement expliqués, compris ou étudiés.
Il existe quatre types de base de chromatographie, notamment :
- Chromatographie gaz-liquide (GC)
- Chromatographie liquide-liquide (LLC)
- Chromatographie liquide-solide (LSC)
- Chromatographie d’exclusion de taille/perméation sur gel (SEC/GPC)
Pour ce post, je vais me concentrer sur la chromatographie liquide-solide.
Chromatographie liquide-solide
C’est la plus populaire des techniques mentionnées ci-dessus car elle est utile pour les séparations de composés semi-volatils et non-volatils. Comme la chaleur n’est pas nécessaire pour éluer les composés d’une colonne de séparation (comme avec la GC), la chromatographie liquide-solide nécessite l’utilisation d’un solvant ou d’un mélange de solvants miscibles de polarité différente pour obtenir la séparation des composants chimiques de l’échantillon.
Avec la CVL, l’échantillon est chargé sur un support solide ou une phase stationnaire. Les composants de l’échantillon se lient à la phase stationnaire, mais à des degrés divers. La quantité d’interaction avec la phase stationnaire contrôle la vitesse et l’efficacité de la séparation. Ainsi, plus l’attraction vers la phase stationnaire est forte, plus les composés ont besoin de temps pour éluer. Pour aider à éluer ces composés fortement liés, le rapport de solvant doit changer (augmentation de la force) au fil du temps.
Dans le domaine du LSC, il existe plusieurs techniques chromatographiques différentes….
- Chromatographie sur papier (PC)
- Chromatographie en couche mince (CCM)
- Chromatographie liquide à haute…performance (HPLC)
- Chromatographie flash (FC)
- Chromatographie d’échange d’ions (IX)
- Chromatographie d’affinité (AC)
- Chromatographie chirale (CC)
- Chromatographie à fluide supercritique (SFC)
Dans ce post, je vais me concentrer sur la chromatographie flash, dont les principes sont les mêmes que ceux de la HPLC. Les deux utilisent des colonnes remplies d’une phase stationnaire dans lesquelles l’échantillon est injecté et à travers lesquelles le solvant est pompé. Cependant, la chromatographie flash utilise des colonnes plus grandes que l’HPLC, qui est surtout une technique de séparation analytique.
La chromatographie flash est une technique chromatographique préparative dont les colonnes sont également remplies d’un support solide ou média qui a une taille de particule plus grande que les colonnes HPLC. Ces différences de taille de support et de colonne permettent aux colonnes flash de purifier plus de composés par gramme de support que la CLHP.
- La chromatographie flash utilise des particules de support de 15 µm à aussi haut que 60 µm
- La CLHP utilise des particules de support de 1,7 µm à 10 µm
Ce qui se passe à l’intérieur de la colonne
La plupart des chromatographies flash et CLHP sont réalisées en utilisant une méthodologie en phase normale ou en phase inverse. Les différences entre ces méthodologies résident dans la chimie de la phase stationnaire et les solvants utilisés pour séparer les composants chimiques individuels d’un mélange.
- La phase normale utilise des solvants non polaires et modérés (par exemple, l’hexane et l’acétate d’éthyle) pour la phase mobile et un milieu polaire (par exemple, la silice).g. silice) comme phase stationnaire
- La phase inversée est juste l’opposé, utilisant des solvants polaires et une phase stationnaire non polaire
Ces méthodologies étant les opposés « polaires » l’une de l’autre (jeu de mots), l’ordre d’élution de la plupart des composés est inversé. C’est là que se produit la chimie derrière les séparations chromatographiques.
Focalisons-nous sur la phase normale pour le moment.
Chromatographie en phase normale
Avec la chromatographie en phase normale, les composés chimiques composant un mélange (par exemple, un mélange réactionnel, un extrait de produit naturel, etc.) sont dissous dans un solvant approprié et injectés dans la colonne. Lorsque le mélange entre en contact avec la phase stationnaire polaire, par exemple la silice, les composés du mélange et leur solvant de dissolution entrent en compétition avec la phase mobile pour les sites de liaison de la silice. Plus le produit chimique est polaire, plus il est fortement attiré par la silice. Cette attraction est appelée adsorption (différente de l’absorption).
L’adsorption est ce qui se produit lorsqu’une éponge ou une serviette en papier interagit avec un liquide. L’adsorption est une combinaison d’interactions physiques et chimiques où la surface polaire de la silice lie chimiquement les composants chimiques qu’elle contacte, principalement en raison de phénomènes connus sous le nom de liaison hydrogène et de forces de van der Walls.
Lorsqu’un produit chimique interagit avec la silice sèche (telle qu’utilisée avec une nouvelle colonne de flash), une adsorption se produit. Cette interaction libère de la chaleur, ce qui peut entraîner des problèmes de stabilité des composés et des résultats chromatographiques. Pour cette raison, les colonnes de silice sont généralement équilibrées (pré-mouillées) avec un solvant de faible polarité avant l’introduction de l’échantillon. Les solvants de faible polarité (par exemple, l’hexane, l’heptane, le cyclohexane) sont des solvants faibles et ne sont pas bien adsorbés par la silice ou d’autres milieux polaires.
La chimie de surface de la silice est un mélange de groupes hydroxyle (silanols) et d’éthers silyliques, figure 1. Ces groupes fonctionnels sont polaires, pensés pour être chargés négativement, et adsorbent les composés déficients en électrons. Les pi-clouds des composés aromatiques peuvent se lier par hydrogène aux groupes hydroxyle de la silice pendant l’adsorption.1
Figure 1. La chimie de la silice chromatographique comprend un mélange de silanols et de fonctionnalités d’éthers silyliques. Ces motifs se lient aux produits chimiques par liaison hydrogène/adsorption.
Pour assurer une bonne liaison des composants de l’échantillon (adsorption), l’échantillon à purifier doit être soit dissous et chargé dans la colonne dans un solvant faible (chargement liquide), soit, dissous avec un solvant plus fort (polaire), mélangé avec un milieu inerte (par exemple, silice, terre de diatomées), séché et tassé dans une colonne différente placée en ligne avec la colonne de purification (chargement sec). Le chargement à sec élimine de nombreux problèmes rencontrés lors de l’utilisation d’une charge liquide, notamment avec un échantillon dissous dans un solvant polaire.
Après le chargement de l’échantillon, les solvants de la phase mobile sont introduits. Cependant, pour obtenir une séparation, les composants de l’échantillon doivent se désorber de la phase stationnaire à des vitesses différentes. Bien que cela soit réalisable en utilisant un solvant de polarité constante (élution isocratique), une meilleure purification est généralement réalisée en utilisant une phase mobile qui commence avec une faible polarité et augmente sa polarité au fil du temps. C’est ce qu’on appelle l’élution par gradient.
Avec un gradient, les composés ayant une solubilité plus élevée dans le solvant de faible polarité (composés de polarité inférieure) se désorbent en premier et passent dans la colonne. Au fur et à mesure que la polarité du solvant de la phase mobile augmente, les composés adsorbés se désorbent du support à des vitesses différentes en fonction de leur solubilité dans la phase mobile de plus en plus polaire, Figure 2.
Figure 2. En haut – Avec une élution isocratique (polarité constante de la phase mobile), les composés se désorbent plus lentement que lorsqu’on utilise un gradient (en bas). L’élution par gradient permet généralement une meilleure séparation/purification, que l’élution isocratique.
Une caractéristique intéressante de la chromatographie en phase normale est qu’une fois qu’un composé se désorbe du milieu, il ne s’adsorbe plus jamais car la phase mobile de plus en plus polaire s’adsorbe préférentiellement à sa place.
Les différences de polarité (force de liaison) entre les composés peuvent être aussi subtiles que l’ajout d’un groupe fonctionnel différent, les différences d’emplacement des groupes fonctionnels (Parida, 2006) comme sur un cycle aromatique, ou aussi distinctes que des composés avec des structures totalement différentes, Figure 3.
Figure 3. Séparation de composés de polarités différentes en fonction du type de groupe fonctionnel et de son emplacement sur la molécule. Par ordre d’élution – naphtalène (aucune fonctionnalité polaire), 1-nitronaphtalène, o-nitroaniline, m-nitroaniline, p-nitroaniline. Les nitroanilines ne diffèrent que par l’emplacement du groupe fonctionnel nitro par rapport à l’amine.
Donc, pour résumer, les séparations chromatographiques en phase normale sont basées sur les différences de polarité des composés (à la fois évidentes et subtiles), leur attraction vers la phase stationnaire et leur solubilité dans la phase mobile. Pour obtenir les meilleurs résultats de purification, le repérage des solvants est recommandé en utilisant la CCM.
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1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
