Effetto delle diete rivestite con Bacillus megaterium sulla crescita, l’attività degli enzimi digestivi e la diversità microbica intestinale della carpa a specchi Songpu (Cyprinus specularis Songpu)

Abstract

Il presente studio è stato condotto per valutare l’effetto di una dieta rivestita con Bacillus megaterium sulle prestazioni di crescita, gli enzimi digestivi e la diversità microbica intestinale nella carpa a specchio Songpu (Cyprinus specularis Songpu). I pesci sono stati alimentati manualmente con due diete (una dieta di controllo e una dieta rivestita di B. megaterium) tre volte al giorno fino a sazietà apparente per 56 giorni. Rispetto al gruppo di controllo, l’integrazione con la dieta rivestita di B. megaterium ha migliorato la crescita dei pesci e ha ridotto significativamente il rapporto di conversione del mangime. Le attività dell’amilasi e della lipasi dell’intestino anteriore nel gruppo di trattamento erano significativamente più alte di quelle del gruppo di controllo. Le attività delle proteasi del foregut, del midgut e del hindgut nel gruppo di trattamento erano tutte più alte di quelle del gruppo di controllo (). I risultati del sequenziamento dei geni 16S rDNA del microbiota attraverso il sequenziamento ad alta produttività hanno mostrato che la diversità e l’abbondanza della microflora intestinale sono aumentate insieme alla crescita della carpa a specchi Songpu. Le carpe a specchi Songpu alimentate con una dieta ricoperta di B. megaterium hanno mostrato un aumento delle proporzioni di Bacillus e Lactococcus intestinali a livello di genere, ed entrambi erano significativamente più alti di quelli del gruppo di controllo. Questi risultati suggeriscono quindi che l’applicazione di B. megaterium nella dieta può migliorare la crescita e l’attività degli enzimi digestivi della carpa a specchio Songpu e arricchire la composizione del genere benefico della sua principale microflora intestinale.

1. Introduzione

Il pesce, come una delle principali fonti alimentari di proteine animali, gioca un ruolo molto importante nella struttura alimentare umana. Tuttavia, negli ultimi anni, la sicurezza dei prodotti acquatici è diventata uno dei maggiori fattori che ostacolano lo sviluppo dei prodotti acquatici a causa delle preoccupazioni sulla sicurezza di ormoni, antibiotici e microrganismi eccessivi. Con il rapido sviluppo dell’allevamento intensivo ad alta densità, l’ambiente acquatico dell’acquacoltura si sta deteriorando ogni giorno, con conseguenti epidemie e persino morti di massa degli animali allevati. C’è un urgente bisogno di trovare alternative ecologiche e sicure per garantire la crescita sana degli animali d’allevamento.

Come un nuovo additivo per mangimi dopo l’era degli antibiotici, i probiotici sono considerati importanti sostituti degli antibiotici per mangimi. Gli studi hanno dimostrato che l’uso di probiotici non solo può promuovere la crescita degli animali acquatici e migliorare il loro tasso di sopravvivenza, ma anche può ridurre l’incidenza delle malattie degli animali acquatici. Bacillus è un batterio saprofita gram-positivo che si trova comunemente nell’ambiente di allevamento. La ricerca e l’applicazione dei bacilli nel campo dell’acquacoltura hanno attirato molta attenzione. La prima applicazione dei probiotici in acquacoltura è stata effettuata bilanciando la popolazione batterica nell’acqua, e ha ottenuto buoni risultati. Alcuni studi hanno dimostrato che l’aggiunta di Bacillus subtilis al mangime non solo può promuovere la crescita degli animali acquatici e migliorare le attività dei loro enzimi digestivi e la loro immunità aspecifica, ma può anche migliorare la struttura della loro microflora intestinale. A metà del 20° secolo, gli studiosi cinesi hanno iniziato a studiare Bacillus megaterium, concentrandosi principalmente sullo screening dei ceppi, in particolare la loro capacità di abbattere la materia organica, il loro metabolismo dell’azoto e la loro applicazione come probiotici nel trattamento delle acque reflue dell’acquacoltura .

La carpa comune (Cyprinus carpio) è la specie di pesce d’acqua dolce più estesamente coltivata in Cina, e la produzione di carpa comune era 2.962.218 t nel 2018 . La carpa a specchio Songpu (Cyprinus specularis Songpu), una varietà di carpa comune, rappresenta una parte sempre più grande della produzione grazie alla sua crescita relativamente più veloce, alla migliore resistenza alle malattie, al più alto tasso di conversione della carne e alla quasi assenza di squame sulla superficie del corpo. Tuttavia, con l’espansione e la promozione dell’allevamento ad alta densità, l’aumento della frequenza di alimentazione e l’inquinamento dell’acqua, i problemi di sicurezza e qualità del cibo sono diventati sempre più seri.

I nutrienti sono tra i fattori più importanti e facilmente regolabili che influenzano la resistenza degli animali acquatici. La microbiologia alimentare comprende microrganismi che hanno sia effetti benefici che deleteri sulla qualità e la sicurezza degli alimenti e possono quindi essere motivo di preoccupazione per la salute pubblica. In questo studio, abbiamo voluto valutare l’effetto delle diete rivestite con B. megaterium sulla crescita, l’attività enzimatica digestiva e la diversità microbica intestinale della carpa specchio Songpu e fornire una base teorica per la pratica di un allevamento ittico sano ed ecologico.

2. Materiali e metodi

2.1. Preparazione della dieta

B. megaterium è stato preparato nel nostro laboratorio. Il contenuto di B. megaterium è stato acquistato da Zhejiang AIPHA Feed Co. I valori garantiti dell’analisi della composizione del prodotto del mangime sono riportati nella tabella 1. Il brodo di fermentazione di B. megaterium è stato spruzzato uniformemente sulla superficie del materiale commerciale ad un tasso di 100 ml/kg, e poi, il mangime spruzzato è stato posto in un luogo fresco per 1 ora, dopo di che è stato usato come mangime del gruppo sperimentale. Il gruppo di controllo è stato alimentato con il mangime commerciale inalterato.

2.2. Esperimento di alimentazione

Le carpe a specchio Songpu (Cyprinus specularis Songpu) (peso corporeo) sono state ottenute dalla Stazione Sperimentale Hulan dell’Istituto di Ricerca sulla Pesca del fiume Heilongjiang nella provincia di Heilongjiang, Cina (45.97°N, 126.63°E). I pesci sono stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per 14 giorni e adattati al mangime di controllo sperimentale prima dell’esperimento. Poi, 90 carpe a specchio Songpu sane sono state selezionate e distribuite a caso in due gruppi (gruppo di controllo e gruppo sperimentale). Ogni trattamento è stato eseguito in triplicato, e ogni replica aveva 15 pesci. Il gruppo di controllo è stato alimentato con mangime commerciale. Il gruppo di trattamento è stato alimentato con mangime commerciale rivestito con B. megaterium. La quantità giornaliera di cibo era pari al 3% del peso corporeo della carpa a specchio Songpu, tre volte al giorno alle 08:00, 12:00 e 19:00. L’intero periodo sperimentale è stato di 56 giorni. Durante il periodo sperimentale, l’acqua del laboratorio è stata sostituita di 1/3 del volume dell’acqua alla settimana. La qualità dell’acqua è stata misurata (usando YSI professional plus, Ohio State, USA) quotidianamente durante il periodo sperimentale, la temperatura dell’acqua variava da 18 a 25°C, e un compressore d’aria è stato usato per aggiungere ossigeno 24 ore al giorno. I pesci sono stati pesati sia all’inizio che alla fine della prova di alimentazione.

2.3. Raccolta dei campioni

Prima dell’esperimento di alimentazione, dieci pesci sono stati presi a caso dalla vasca di coltura temporanea, e il loro peso corporeo iniziale è stato misurato. Poi, il tratto intestinale è stato raccolto per la misurazione della microflora intestinale iniziale (gruppo iniziale). Alla fine della prova di alimentazione di 56 giorni, circa 24 ore dopo l’ultima alimentazione, tutti i pesci sono stati anestetizzati con MS-222 diluito nell’acqua ad una concentrazione di 75 mg/l. Questi pesci sono stati contati e pesati per determinare il tasso di incremento del peso (WGR), il tasso di crescita specifico (SGR), e il tasso di conversione del mangime (FCR, Tabella 2).

Dopo aver ottenuto il peso finale di tutti i pesci, cinque pesci di ogni vasca sono stati selezionati a caso e messi in una piastra di ghiaccio per una rapida dissezione. I campioni di tessuto, compresi l’intestino anteriore, medio e posteriore, sono stati raccolti con forbici asettiche, lavati con soluzione fisiologica asettica, pesati e poi preparati in un omogeneizzato con soluzione fisiologica asettica (1 : 4). Tutti i campioni sono stati immediatamente conservati a -80°C in un congelatore per la determinazione degli enzimi digestivi. Altri cinque pesci sono stati campionati a caso da ogni vasca. Le superfici dei pesci sono state disinfettate con alcool al 75% prima che i pesci fossero portati in una stanza bioclean. Dopo un’ulteriore disinfezione, la cavità addominale è stata aperta, l’esterno dell’intestino è stato pulito con alcol al 75% e lavato quattro volte con acqua sterile, e poi il tratto intestinale è stato raccolto per la valutazione della microflora intestinale finale.

2.4. Determinazione degli enzimi digestivi

Prima di misurare gli indici di immunità, il foregut, il midgut e il hindgut sono stati omogeneizzati manualmente in un omogeneizzatore di vetro con 0,86% NaCl (/) per ottenere un omogeneizzato al 10%. Dopo la centrifugazione (4000 rpm, 10 min) a 4°C, è stato ottenuto il surnatante, costituito principalmente da liquido enzimatico grezzo. Le attività di amilasi, proteasi e lipasi nel foregut, midgut e hindgut sono state analizzate spettrofotometricamente utilizzando kit di reagenti diagnostici (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Cina).

2.5. Amplificazione del gene 16S rRNA e Illumina Sequencing

Il DNA microbico è stato estratto dai campioni intestinali utilizzando l’E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) secondo i protocolli del produttore. La concentrazione finale del DNA e la purificazione sono state determinate con uno spettrofotometro UV-vis NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA), e la qualità del DNA è stata determinata mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1%. Le regioni ipervariabili V4-V5 dei geni 16S rRNA batterici sono state amplificate con i primer 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3) e 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) utilizzando un sistema PCR a termociclatore (GeneAmp 9700, ABI, USA). Le PCR sono state condotte utilizzando il seguente programma: 3 min di denaturazione a 95°C, 27 cicli di 30 s a 95°C, 30 s di annealing a 55°C, e 45 s di elongazione a 72°C, e un’estensione finale a 72°C per 10 min. I prodotti di PCR risultanti sono stati estratti da un gel di agarosio al 2% e ulteriormente purificati utilizzando un kit di estrazione su gel di DNA AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) e quantificati utilizzando QuantiFluor™-ST (Promega, USA) secondo il protocollo del produttore. Gli ampliconi purificati sono stati raggruppati in quantità equimolari e sequenziati in paired-end () su una piattaforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, USA) secondo i protocolli standard di Majorbio Bio-Pharm Technology Co. (Shanghai, Cina) .

2.6. Analisi statistica

Le unità tassonomiche operative (OTU) sono state raggruppate con un cutoff di somiglianza del 97% utilizzando UPARSE (versione 7.1, http://drive5.com/uparse/) con un nuovo algoritmo “greedy” che esegue contemporaneamente il filtraggio delle chimere e il clustering delle OTU. La tassonomia di ogni sequenza del gene 16S rRNA è stata analizzata dall’algoritmo RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) contro il database SILVA 16S rRNA usando una soglia di fiducia del 70%. Gli indici Chao e ACE estimator sono stati selezionati per identificare la ricchezza della comunità, e gli indici Shannon e Simpson sono stati utilizzati per identificare la diversità della comunità. Tutti questi indici nei nostri campioni sono stati calcolati con QIIME (versione 1.7.0) e preparati per la visualizzazione con il software R (versione 2.15.3). Le analisi statistiche sono state eseguite con il pacchetto software statistico SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). I dati sono espressi come il di tre replicati. I dati sono stati sottoposti ad ANOVA a una via, e quando sono state trovate differenze, i mezzi sono stati classificati usando il test di confronto multiplo di Duncan. Le differenze sono state considerate significative a .

3. Risultati

3.1. Effetto della dieta rivestita di B. megaterium sulla crescita dei pesci

Come mostrato nella tabella 2, il tasso di aumento del peso e il tasso di crescita specifico del gruppo di trattamento (71.03%, 0.42% day-1) sono stati significativamente aumentati rispetto a quelli del gruppo di controllo (52.75%, 0.33% day-1, ), e il rapporto di conversione del mangime del gruppo di trattamento (1.28) è stato significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo (2.23, ). Nessuna mortalità è stata osservata durante i 56 giorni della prova di alimentazione.

3.2. Effetto della dieta rivestita di B. megaterium sull’attività degli enzimi digestivi

Gli effetti della dieta rivestita di B. megaterium sull’attività degli enzimi digestivi sono mostrati nella tabella 3. L’attività dell’amilasi dell’intestino anteriore nel gruppo di trattamento era significativamente più alta di quella del gruppo di controllo. Le attività di amilasi del midgut e del hindgut nel gruppo di trattamento erano significativamente più alte di quelle del gruppo di controllo, ma non c’erano differenze significative (). Le attività di proteasi dell’intestino anteriore, medio e posteriore del gruppo di trattamento erano superiori a quelle del gruppo di controllo, ma non c’erano differenze significative. L’attività della lipasi dell’intestino anteriore nel gruppo di trattamento era significativamente più alta di quella del gruppo di controllo. Le attività della lipasi del midgut e del hindgut nel gruppo di trattamento erano fondamentalmente le stesse di quelle del gruppo di controllo, e non c’erano differenze significative ().

3.3. Effetto della dieta rivestita con B. megaterium sulla diversità e ricchezza microbica intestinale

La diversità microbica intestinale della carpa a specchi Songpu è stata determinata mediante sequenziamento ad alta produttività. Il numero medio di OTU rilevate dal campione iniziale del gruppo era di 63. Dopo 56 giorni, il numero medio di OTU rilevato nei gruppi di controllo e di trattamento era 114 e 196, rispettivamente. L’indice di copertura di tutti i campioni era superiore a 0,97, indicando che c’era un alto tasso di rilevamento. Come mostrato nella tabella 4, gli indici Chao e ACE, che riflettono la ricchezza della microflora intestinale della carpa a specchi Songpu, erano significativamente più alti nel gruppo di trattamento dopo 56 giorni rispetto ai gruppi di controllo e iniziale. L’indice Shannon della diversità della comunità intestinale nel gruppo di trattamento era significativamente più alto di quello del gruppo di controllo. L’indice Simpson della diversità della comunità intestinale nel gruppo di trattamento era significativamente più basso di quello del gruppo di controllo (). Non c’erano differenze significative per i suddetti quattro indici tra il gruppo di controllo e il gruppo iniziale ().

3.4. Effetto della dieta a base di B. megaterium sulla composizione e sui cambiamenti del microbiota principale nell’intestino della carpa a specchi Songpu

Una ricchezza microbica intestinale superiore all’1% a livello di phylum è stata presa come microflora principale per le statistiche presentate nella figura 1. Il phylum dominante nell’intestino del gruppo iniziale era prevalentemente Fusobatteri (86,36%) e Bacteroidetes (8,60%) prima dell’inizio della sperimentazione. Dopo la prova di alimentazione di 56 giorni, il numero della microflora intestinale principale è aumentato in ogni gruppo. Nel gruppo di controllo, i phyla dominanti erano Fusobatteri (86,36%), Bacteroidetes (14,4%), Firmicutes (2,42%), e Proteobatteri (1,37%). Nel gruppo di trattamento, i phyla dominanti erano Firmicutes (69,15%), Proteobacteria (23,8%), Bacteroidetes (4,65%), e Actinobacteria (1,43%). Una ricchezza microbica intestinale superiore allo 0,5% a livello di genere è stata presa come microflora principale per i calcoli statistici, mostrata nella tabella 5. C’erano solo 5 generi dei principali microrganismi intestinali nel gruppo iniziale. Dopo la prova di alimentazione di 56 giorni, i principali microrganismi intestinali sono aumentati a 11 generi nel gruppo di trattamento. Il microrganismo più abbondante nell’intestino della carpa specchio Songpu nel gruppo iniziale era il Cetobacterium. Dopo la prova di alimentazione di 56 giorni, il microrganismo più abbondante nel gruppo di controllo era ancora Cetobacterium. Nel gruppo di controllo, gli 11 generi dominanti erano Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified, e Yersinia. La carpa a specchi Songpu alimentata con una dieta rivestita con B. megaterium ha mostrato un aumento delle proporzioni di Bacillus e Lactococcus intestinali a livello di genere, che erano entrambi significativamente più alti rispetto a quelli del gruppo di controllo ().

Figura 1

Composizione microbica intestinale a livello di phylum nella carpa specchio Songpu alimentata con una dieta ricoperta di B. megaterium per 56 giorni.

4. Discussione

Probiotici come i bacilli sono stati ampiamente utilizzati in acquacoltura. Alcuni studi hanno dimostrato che l’aggiunta di vari ceppi di Bacillus spp. al mangime per larve ha ottenuto buoni risultati e ha un buon effetto di promozione sulla crescita delle larve di pesce. L’aggiunta di batteri (ceppo CA2) come integratore alimentare alle colture larvali xeniche dell’ostrica Crassostrea gigas ha costantemente migliorato la crescita delle larve durante diverse stagioni dell’anno. La manipolazione del microbiota utilizzando i probiotici è stata riportata come una pratica degna per l’acquacoltura per controllare o inibire i batteri patogeni e per migliorare le prestazioni di crescita e l’attività degli enzimi digestivi. Rispetto al gruppo di controllo non trattato, il peso finale e l’aumento di peso erano significativamente maggiori nei gamberi alimentati con una miscela di due diete di ceppi probiotici. In questo studio, è stato trovato che una dieta rivestita di B. megaterium ha aumentato il tasso di aumento del peso e il tasso di crescita specifico e ha ridotto il rapporto di conversione del mangime, indicando che le diete rivestite di B. megaterium possono promuovere la crescita della carpa specchio Songpu. Risultati simili sono stati trovati nel pesce gatto Clarias sp., dove l’aggiunta di B. megaterium PTB 1.4 alla loro alimentazione ha migliorato significativamente il loro tasso di crescita. Risultati simili sono stati trovati anche in Penaeus monodon, per il quale sono stati ottenuti valori più elevati di FCR e SGR dopo l’aggiunta di Bacillus cereus.

I batteri probiotici sono in grado di produrre enzimi digestivi che aiutano i pesci a utilizzare i nutrienti del mangime e a digerirli. L’aggiunta di B. megaterium ai pasti di proteine vegetali può promuovere lo sviluppo della morfologia intestinale e aumentare l’attività degli enzimi digestivi. Lo studio dei probiotici per la carpa comune Cyprinus carpio basato sulle prestazioni di crescita e sulle attività degli enzimi digestivi ha mostrato che le attività medie degli enzimi digestivi di tutti i gruppi di trattamento probiotico erano significativamente diverse da quelle del controllo. Nel presente studio, una dieta rivestita di B. megaterium ha avuto un effetto positivo e importante sulle attività degli enzimi digestivi, in particolare quelle dell’amilasi e della proteasi nel foregut, midgut e hindgut. Risultati simili sono stati trovati anche nella tilapia, che ha mostrato un miglioramento nella digestione del cibo e nella crescita dopo che il Bacillus NP5 è stato aggiunto al loro mangime. Un livello più elevato di attività enzimatica ottenuto con diete contenenti probiotici ha migliorato la digestione di proteine, amido, grasso e cellulosa, che potrebbe, a sua volta, spiegare la migliore crescita osservata con le diete integrate con probiotici. Gli enzimi digestivi aiutano i pesci a scomporre e digerire i nutrienti nel mangime, rendendo più facile per il pesce assorbire i nutrienti nel mangime.

I progressi nel sequenziamento ad alta produttività hanno permesso un ampio catalogo di campioni metagenomici, fornendo informazioni sulla diversità delle specie microbiche da un’ampia varietà di fonti, tra cui l’oceano, il suolo e il corpo umano. Questi studi utilizzano sia il sequenziamento del gene 16S rRNA per determinare le relazioni filogenetiche che il sequenziamento shotgun più completo per prevedere le specie dettagliate e la composizione genica. L’indice di ricchezza e l’indice di diversità sono indici importanti per rilevare la diversità e la complessità dei microrganismi nei campioni. In questo studio, con la crescita della carpa a specchi Songpu, la diversità e la ricchezza microbica intestinale sono aumentate, e gli indici Chao e ACE, che riflettono la ricchezza della microflora intestinale della carpa a specchi Songpu, erano significativamente più alti nel gruppo di trattamento che nel gruppo di controllo. Inoltre, l’indice Shannon della diversità della comunità intestinale nel gruppo di trattamento era significativamente più alto di quello del gruppo di controllo. Allo stesso modo, i risultati hanno anche mostrato che la struttura della microflora intestinale è stata modificata quando i giovani di orata dal muso smussato sono stati alimentati con diete integrate con diversi livelli di Bacillus subtilis. L’aggiunta di probiotici al mangime può anche cambiare il numero e la struttura della microflora originale nel tratto intestinale del Litopenaeus vannamei e promuovere le complesse interazioni tra le comunità microbiche nel tratto intestinale del Litopenaeus vannamei .

In questo studio, la carpa specchio Songpu alimentata con una dieta ricoperta di B. megaterium ha mostrato proporzioni aumentate di Bacillus intestinale e Lactococcus a livello di genere, che erano entrambi significativamente più alti di quelli del gruppo di controllo. I risultati hanno anche indicato che la composizione e le proporzioni del microbiota principale nell’intestino della carpa a specchi Songpu possono essere modificate con diete rivestite di B. megaterium. In conclusione, l’uso di diete rivestite con B. megaterium può migliorare significativamente la crescita dei pesci e ridurre il rapporto di conversione del mangime, migliorare le attività degli enzimi digestivi e arricchire la composizione dei generi benefici della principale microflora intestinale.

Data Availability

Tutti i dati sono stati forniti nell’articolo, e non ci sono altri dati da caricare.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato finanziato dal Central-Level Non-Profit Scientific Research Institutes Special Funds (no. HSY202005M), dalla Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (no. QC2018038), dal Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (nn. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502, e 2020TD56), dal National Key R&D Program of China (no. 2019YFD0900302), e il Laboratorio chiave di biotecnologia e allevamento acquatico d’acqua dolce, Ministero dell’agricoltura e degli affari rurali, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (no. FBB2017-04).