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Se si vuole sapere se il tumore di un paziente risponderà ad un regime terapeutico specifico, si deve esaminare la risposta di quel tumore umano, non un tumore di topo, alla terapia

Sono stati sviluppati numerosi modelli murini per studiare il cancro umano. Questi modelli sono utilizzati per studiare i fattori coinvolti nella trasformazione maligna, l’invasione e le metastasi, così come per esaminare la risposta alla terapia. Uno dei modelli più utilizzati è lo xenotrapianto del tumore umano. In questo modello, le cellule tumorali umane vengono trapiantate, sotto la pelle o nel tipo di organo in cui il tumore ha avuto origine, in topi immunocompromessi che non rigettano le cellule umane. Per esempio, lo xenotrapianto sarà prontamente accettato da topi nudi atimici, topi immunodeficienti gravemente compromessi (SCID), o altri topi immunocompromessi (Morton e Houghton, 2007). A seconda del numero di cellule iniettate, o delle dimensioni del tumore trapiantato, il tumore si svilupperà in 1-8 settimane (o in alcuni casi 1-4 mesi, o più a lungo), e la risposta a regimi terapeutici appropriati può essere studiata in vivo. Un altro tipo di modello animale per studiare il cancro umano è il modello di topo geneticamente modificato (GEM). Il profilo genetico di questi topi è alterato in modo tale che uno o più geni che si pensa siano coinvolti nella trasformazione o malignità siano mutati, cancellati o sovraespressi; successivamente, l’effetto dell’alterazione di questi geni è studiato nel tempo e le risposte terapeutiche a questi tumori possono essere seguite in vivo. Sia i topi nudi atimici che i modelli di xenotrapianto di topo che utilizzano linee cellulari tumorali umane sono stati utilizzati per decenni per aumentare la nostra comprensione dei fattori che influenzano la crescita del tumore; tuttavia, le recenti informazioni riguardanti l’influenza chiave del microambiente tumorale sulla progressione e la crescita del tumore hanno portato a una maggiore dipendenza dai modelli di tumore GEM utilizzando topi immunocompetenti, così come l’uso di xenotrapianti di tumori umani primari in modelli di topi umanizzati. Infatti, i modelli di xenotrapianto sono spesso considerati inferiori ai modelli GEM. In questo articolo, spero di mostrare che ogni modello ha il suo uso nella diagnostica del cancro e nelle modalità terapeutiche precliniche.

Diversi criteri sono stati recentemente suggeriti per i modelli GEM di tumori umani: (1) i topi devono essere portatori della stessa mutazione che si verifica nei tumori umani; (2) le mutazioni dovrebbero essere ingegnerizzate all’interno del locus endogeno, e non espresse come transgene; (3) i geni mutati dovrebbero essere silenziosi durante l’embriogenesi e il primo sviluppo postnatale, tranne che nei modelli di tumori pediatrici ereditati; (4) le mutazioni dovrebbero essere all’interno dei tessuti bersaglio specifici in tipi di cellule selezionate; e (5) le mutazioni devono verificarsi in un numero limitato di cellule. Ulteriori “caratteristiche desiderate” sono che il tipo di tumore e l’anatomopatologia devono essere il più possibile simili a quelli osservati nei tumori umani, e che lo sviluppo del tumore deve procedere attraverso le stesse, o simili, fasi “preneoplastiche” (M. Barbacid, Keystone Symposium on Inflamation, Microenvironment and Cancer, 2008, e comunicazione personale). Un altro criterio importante, che è difficile da raggiungere nei modelli GEM, è che l’ambiente ospite/tumorale dovrebbe essere riproducibile nel modello. Inoltre, anche se i modelli tumorali murini che utilizzano GEM sono molto utili per valutare gli effetti di una specifica mutazione, delezione o amplificazione genica di uno o due geni durante la progressione del tumore murino, di solito non possono riprodurre completamente la complessità genetica dei tumori umani. Per esempio, negli esseri umani, i melanomi maligni e altri tipi di tumore con simili gradi di eterogeneità genetica mostrano un ampio grado di aneuploidia, e il guadagno o la perdita specifica di geni varia enormemente da una cellula all’altra all’interno dello stesso tumore. Così, mentre ci sono punti di forza significativi per questo modello, ci sono debolezze innate che possono influenzare profondamente l’uso di questi topi per prevedere la risposta di un paziente a una terapia.

Se si vuole sapere se il tumore di un paziente risponderà a un regime terapeutico specifico, si deve esaminare la risposta di quel tumore umano, non un tumore del mouse, alla terapia. È qui che può essere utile lo xenotrapianto del tumore umano su topi nudi atimici, topi SCID o topi non obesi diabetici (NOD)/SCID umanizzati (Fig. 1). Anche se alcuni componenti del sistema immunitario mancano quando si scelgono modelli di topi nudi o SCID, nei topi nudi atimici, le cellule B, le cellule dendritiche e i granulociti sono tutti relativamente intatti, e c’è un aumento compensativo sia dell’attività delle cellule natural killer (NK) che dei macrofagi tumoricidi in questi topi. Inoltre, si può sostenere che, nel momento in cui queste lesioni metastatiche vengono rimosse chirurgicamente o sottoposte a biopsia, il tumore è già sfuggito alla sorveglianza immunitaria e all’uccisione da parte delle cellule immunitarie. In questo editoriale discuterò i vantaggi e gli svantaggi degli xenotrapianti tumorali umani, rispetto ai modelli GEM, come metodo per analizzare le potenziali risposte dei tumori dei pazienti alla terapia (Fig. 1).

Ci sono diversi vantaggi chiave nell’utilizzo di xenotrapianti tumorali umani per esaminare le risposte terapeutiche ai farmaci: (1) si può utilizzare il tessuto tumorale umano reale, caratterizzato dalla complessità delle anomalie genetiche ed epigenetiche che esistono nella popolazione tumorale umana; (2) gli xenotrapianti tumorali umani possono essere utilizzati per aiutare nello sviluppo di approcci terapeutici molecolari individualizzati; (3) i risultati possono essere ottenuti nel giro di poche settimane da una biopsia tumorale umana per quanto riguarda la risposta alla terapia, mentre i modelli GEM spesso richiedono anche un anno per sviluppare prima della terapia farmacologica; (4) più terapie possono essere testate da una singola biopsia tumorale; (5) i dati dei microarray tissutali e genetici possono essere facilmente ottenuti dalla biopsia umana e dal tessuto dello xenotrapianto, prima e dopo la terapia farmacologica, per un’ampia analisi prima che il paziente sia sottoposto a una terapia che potrebbe non funzionare; (6) gli xenotrapianti ortotopici possono essere collocati in modo appropriato per riprodurre l’ambiente d’organo in cui cresce il tumore, in modo che l’effetto del tumore sul suo microambiente possa essere modulato, anche se con l’eccezione di alcune popolazioni di cellule T; (7) lo stroma del microambiente tumorale umano può essere incluso nello xenotrapianto per imitare più completamente il microambiente tumorale umano; e (8) gli xenotrapianti che utilizzano topi NOD/SCID che sono stati “umanizzati” con l’iniezione di sangue periferico o cellule del midollo osseo, permettono una ricostituzione quasi completa della risposta immunitaria al tumore. Gli xenotrapianti che utilizzano linee cellulari umane per testare le risposte ai farmaci non sono spesso correlati all’attività clinica nei pazienti (Kerbel, 2003). Al contrario, quando i tumori primari sono usati come xenotrapianto ortotopico, c’è un valore predittivo di risposta più forte, specialmente quando viene usato un dosaggio di farmaco clinicamente rilevante (Johnson et al., 2001; Kerbel, 2003; Scholz et al., 1990). Ci sono tre diversi tipi di risposta alla terapia che possono essere valutati: effetto sul tasso di crescita del tumore, effetto sulla contrazione/regressione del tumore e sopravvivenza. È stato riportato che l’effetto di un farmaco sul tasso di crescita del tumore o sulla citostasi è spesso più predittivo di una risposta clinica rispetto alla contrazione/regressione del tumore (Kelland, 2004). Inoltre, i modelli di tumori sottocutanei che non sono ortotopici e non rappresentano siti appropriati per i tumori umani non sono predittivi quando vengono usati per testare le risposte ai farmaci anticancro (Killion et al., 1998). Una sfida presentata con i modelli ortotopici, rispetto ai modelli sottocutanei, è la difficoltà di seguire la crescita del tumore. Tuttavia, il recente sviluppo di nuove tecniche di risonanza magnetica (MRI) e di micro-imaging può minimizzare questo problema.

Ci sono diversi altri svantaggi e sfide nell’uso del modello xenotrapiantato del topo per monitorare e/o prevedere le risposte terapeutiche nel cancro. I modelli tumorali ortotopici richiedono tempo, sono costosi e tecnicamente impegnativi. Inoltre, se si usano topi atimici nudi o SCID, si perde la risposta mediata dai linfociti al tumore, cioè i topi nudi perdono alcune risposte delle cellule T e i topi SCID perdono entrambe le risposte delle cellule T e B. Tuttavia, questi deficit immunologici possono, in linea di principio, essere ampiamente superati innestando tumori umani su topi NOD/SCID “umanizzati”. Questo riduce notevolmente molti degli svantaggi dei modelli xenografici di tumori umani ortotopici per studiare la risposta terapeutica. Tuttavia, il ripristino completo del sistema immunitario nel ‘topo umanizzato’ non è possibile, poiché il ripristino degli elementi di selezione HLA di classe I e II nelle popolazioni di cellule T rimane una sfida (Bernard et al., 2008). Inoltre, per eseguire questi esperimenti i topi appena nati devono essere irradiati e poi incisi con cellule staminali ematopoietiche umane CD34+ dal sangue del cordone ombelicale umano. La tempistica per ottenere il sangue del cordone ombelicale, irradiare i topi neonati e verificare il fenotipo umanizzato dei topi NOD/SCID dopo l’incisione, rende questa procedura piuttosto macchinosa, ma molto preziosa.

Nonostante gli svantaggi del modello di xenotrapianto per prevedere la risposta clinica alla terapia, ci sono una serie di importanti successi. Per esempio, gli xenotrapianti di linee cellulari di mieloma multiplo in topi singenici rispondono all’inibitore del proteasoma, bortezomib/VELCADE®, che ha mostrato una promessa significativa per il trattamento del mieloma multiplo (LeBlanc et al., 2002; Moreau et al., 2008; Oyajobi e Mundy, 2003). La combinazione di bortezomib e melphalen si è dimostrata per la prima volta efficace per il trattamento del mieloma multiplo in studi preclinici sullo xenotrapianto, e questo ha portato al successo negli studi clinici, seguito da un nuovo standard di cura clinica raccomandato per i pazienti con mieloma multiplo di età superiore ai 65 anni (Mateos et al., 2006; Mitsiades et al., 2003). Herceptin ha dimostrato di potenziare l’attività antitumorale di paclitaxel e doxorubicina contro xenotrapianti di carcinoma mammario umano HER2/neu-overexpressing, e questo ha portato a successivi studi clinici di successo (Baselga et al., 1998; Sporn e Bilgrami, 1999). Anticorpi neutralizzanti contro il recettore 2 del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR2) in combinazione con paclitaxel hanno dimostrato di essere efficaci nell’inibire la crescita del tumore e la diffusione metastatica in un modello di xenotrapianto ortotopico (Davis et al., 2004). Questo lavoro di base è stato seguito dallo sviluppo del bevacizumab, un anticorpo monoclonale umanizzato che mira al fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A). Il bevacizumab è stato efficace negli studi clinici di fase III per il carcinoma colorettale e renale e ha ricevuto l’approvazione della FDA nel 2004 (Hurwitz et al., 2004; Yang et al., 2003). Inoltre, i modelli di xenotrapianto di topo sono utili per anticipare la tossicità delle terapie mirate e, in altri casi, per identificare possibili biomarcatori predittivi della modulazione del target. Anche se questi sono solo alcuni esempi dell’uso di successo degli studi di xenotrapianto, chiaramente, per molti tipi di tumori umani, le informazioni apprese dagli studi di xenotrapianto ortotopico nei topi utilizzando tumori umani ha portato a informazioni che sono state tradotte in studi clinici di successo.

I vantaggi del GEM sono che: (1) i topi sono immunocompetenti, così che il microambiente tumorale può essere rispecchiato il più possibile in un modello di tumore murino; (2) specifiche anomalie genetiche che sono presenti nei tumori umani possono essere riprodotte, in modo inducibile, a età specifiche nel tessuto-tipo di origine; (3) le fasi della progressione tumorale possono essere studiate nel tempo; e (4) diversi approcci terapeutici possono essere esplorati in varie fasi dello sviluppo tumorale. I modelli genetici sono anche utili nei topi umanizzati, dove i geni umani, come i geni del citocromo P450 o gli antigeni tumorali umani, sono espressi nei topi per seguire il metabolismo dei farmaci o le risposte immunologiche al tumore (Talmadge et al., 2007). Gli svantaggi del GEM sono, in primo luogo, che la complessità del tumore umano non può essere imitata in modo affidabile e, in secondo luogo, i tumori del topo non sono tumori umani e spesso non predicono ciò che accadrà nel tumore umano per quanto riguarda la risposta terapeutica. Possiamo curare molti tumori del topo, ma non c’è una correlazione diretta tra la risposta nel topo e la risposta nella clinica.

In sintesi, sia lo xenotrapianto di tumore umano ortotopico che i modelli GEM sono utili per migliorare la nostra comprensione dello sviluppo e del trattamento del cancro. Ognuno ha i suoi punti di forza e limiti, con lo xenotrapianto di tumore umano ortotopico eccellente per prevedere la risposta ai farmaci nei tumori umani, e il modello GEM è migliore per esaminare il ruolo di geni specifici nello sviluppo e nella progressione del tumore. Qualunque sia il modello utilizzato per prevedere la risposta clinica nei pazienti, è importante ottenere almeno un’inibizione del 50% della crescita tumorale per ottenere una “risposta” qualificata alla terapia, e utilizzare dosaggi clinicamente rilevanti degli agenti terapeutici e monitorare la sopravvivenza. Inoltre, è importante determinare se la crescita del tumore ritorna quando il farmaco viene interrotto, e, in tal caso, se la ricrescita è più veloce quando il trattamento viene sospeso rispetto a prima che il trattamento iniziasse. Se questo è il caso, nonostante qualsiasi risposta alla terapia farmacologica, l’effetto rebound consiglia di non utilizzare quel regime di trattamento farmacologico per i tipi di tumore che mostrano un effetto rebound. In conclusione, non abbiamo modelli murini ideali di tumori umani, ma dobbiamo imparare a interpretare i nostri dati nel quadro delle limitazioni del saggio utilizzato.