La nostra clientela alla Biotage ha un background interessante e diversificato, dai chimici sintetici altamente qualificati, agli esperti in chimica dei prodotti naturali, a coloro che hanno appena iniziato il loro viaggio con la chimica. Quello che ho imparato nel corso della mia carriera di oltre 40 anni nell'”arte” della cromatografia è che per molte di queste brave persone c’è una mancanza di comprensione dei principi cromatografici. Questa mancanza di comprensione, credo, è dovuta solo al loro curriculum di studi di base in cui la scienza della separazione è usata come strumento durante il lavoro di laboratorio, ma i principi che stanno dietro al perché i componenti di una miscela si separano (o non si separano) forse non sono efficacemente spiegati, compresi o studiati.
Ci sono quattro tipi fondamentali di cromatografia, tra cui:
- Cromatografia gas-liquido (GC)
- Cromatografia liquido-liquido (LLC)
- Cromatografia liquido-solido (LSC)
- Cromatografia a esclusione di grandezza/permeazione di gel (SEC/GPC)
Per questo post mi concentrerò sulla cromatografia liquido-solido.
Cromatografia liquido-solido
Questa è la più popolare delle tecniche menzionate sopra perché è utile per separazioni di composti semi-volatili e non volatili. Poiché il calore non è necessario per eluire i composti da una colonna di separazione (come con la GC), la cromatografia liquido-solida richiede l’uso di un solvente o di una miscela di solventi miscibili con polarità diversa per ottenere la separazione dei componenti chimici del campione. I componenti del campione si legano alla fase stazionaria, ma a vari gradi. La quantità di interazione con la fase stazionaria controlla il tasso di separazione e l’efficacia. Quindi, maggiore è l’attrazione verso la fase stazionaria, maggiore è il tempo necessario ai composti per eluire. Per aiutare l’eluizione di quei composti fortemente legati, il rapporto del solvente deve cambiare (forza crescente) nel tempo.
Nel regno della LSC ci sono diverse tecniche cromatografiche…
- Cromatografia su carta (PC)
- Cromatografia su strato sottile (TLC)
- Cromatografia liquida ad altecromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
- Cromatografia flash (FC)
- Cromatografia a scambio ionico (IX)
- Cromatografia di affinità (AC)
- Cromatografia chirale (CC)
- Cromatografia con fluido supercritico (SFC)
In questo post mi concentrerò sulla cromatografia flash, i cui principi sono gli stessi dell’HPLC. Entrambi usano colonne riempite con una fase stazionaria in cui viene iniettato il campione e attraverso cui viene pompato il solvente. Tuttavia, la cromatografia flash utilizza colonne più grandi dell’HPLC, che è per lo più una tecnica di separazione analitica.
La cromatografia flash è una tecnica cromatografica preparativa le cui colonne sono anche riempite con un supporto solido o media che ha una dimensione delle particelle più grande delle colonne HPLC. Queste differenze nelle dimensioni del supporto e della colonna permettono alle colonne flash di purificare più composti per grammo di supporto rispetto all’HPLC.
- La cromatografia flash utilizza particelle di supporto da 15 µm a 60 µm
- HPLC utilizza particelle di supporto da 1,7 µm a 10 µm
Cosa succede all’interno della colonna
La maggior parte della cromatografia flash e HPLC viene eseguita utilizzando una metodologia a fase normale o a fase inversa. Le differenze tra queste metodologie risiedono nella chimica della fase stazionaria e nei solventi utilizzati per separare i singoli componenti chimici di una miscela.
- La fase normale utilizza solventi non polari e moderatamente solventi (ad esempio esano e acetato di etile) per la fase mobile e un mezzo polare (ad es.Ad esempio la silice) come fase stazionaria
- La fase inversa è esattamente l’opposto, utilizzando solventi polari e una fase stazionaria non polare
Con queste metodologie che sono opposte “polari” l’una all’altra (gioco di parole), l’ordine di eluizione per la maggior parte dei composti è invertito. È qui che avviene la chimica dietro le separazioni cromatografiche.
Per ora concentriamoci sulla fase normale.
Cromatografia in fase normale
Con la cromatografia in fase normale, i composti chimici che compongono una miscela (ad es. miscela di reazione, estratto di prodotto naturale, ecc. Quando la miscela entra in contatto con la fase stazionaria polare, diciamo la silice, i composti della miscela e il loro solvente di dissoluzione competono con la fase mobile per i siti di legame della silice. Più la sostanza chimica è polare, più è fortemente attratta dalla silice. Questa attrazione è chiamata adsorbimento (diverso dall’assorbimento).
L’assorbimento è ciò che avviene quando una spugna o un tovagliolo di carta interagisce con un liquido. L’adsorbimento è una combinazione di interazioni fisiche e chimiche in cui la superficie polare della silice lega chimicamente i componenti chimici con cui entra in contatto, principalmente a causa di fenomeni noti come legame idrogeno e forze di van der Walls.
Quando qualsiasi prodotto chimico interagisce con la silice secca (come quella usata in una nuova colonna flash), avviene l’adsorbimento. Questa interazione libera calore, che può causare problemi con la stabilità del composto e i risultati cromatografici. Per questo motivo, le colonne di silice sono tipicamente equilibrate (pre-bagnate) con un solvente a bassa polarità prima dell’introduzione del campione. I solventi a bassa polarità (esano, eptano, cicloesano) sono solventi deboli e non ben assorbiti dalla silice o da altri mezzi polari.
La chimica di superficie della silice è una miscela di gruppi idrossilici (silanoli) e silileteri, Figura 1. Questi gruppi funzionali sono polari, pensati per essere caricati negativamente, e adsorbono composti carenti di elettroni. Le pi-clouds dei composti aromatici possono legarsi a idrogeno con i gruppi idrossilici della silice durante l’adsorbimento.1
Figura 1. La chimica della silice cromatografica comprende una miscela di silanoli e funzionalità di sililetere. Queste società si legano alle sostanze chimiche attraverso il legame a idrogeno/adsorbimento.
Per assicurare un buon legame del componente del campione (adsorbimento), il campione da purificare deve essere dissolto e caricato nella colonna in un solvente debole (caricamento liquido) o, dissolto con un solvente più forte (polare), mescolato con un mezzo inerte (ad esempio silice, terra diatomacea), essiccato e imballato in una colonna diversa posta in linea con la colonna di purificazione (caricamento a secco). Il caricamento a secco elimina molti problemi incontrati quando si usa un carico liquido, specialmente con un campione sciolto in un solvente polare.
Dopo il caricamento del campione, vengono introdotti i solventi della fase mobile. Tuttavia, per ottenere una separazione, i componenti del campione devono desorbire dalla fase stazionaria a tassi diversi. Anche se questo è possibile utilizzando un solvente a polarità costante (eluizione isocratica), una migliore purificazione è tipicamente realizzata utilizzando una fase mobile che inizia con bassa polarità e aumenta la sua polarità nel tempo. Questo è noto come eluizione a gradiente.
Con un gradiente, i composti con maggiore solubilità nel solvente a bassa polarità (composti a bassa polarità) desorbono per primi e passano attraverso la colonna. Man mano che la polarità del solvente della fase mobile aumenta, i composti adsorbiti desorbono dai media a tassi diversi in base alla loro solubilità nella fase mobile sempre più polare, Figura 2.
Figura 2. In alto – Con l’eluizione isocratica (polarità costante della fase mobile), i composti si desorbono più lentamente di quando si usa un gradiente (in basso). L’eluizione a gradiente fornisce tipicamente una migliore separazione/purificazione, rispetto all’eluizione isocratica.
Una caratteristica interessante della cromatografia in fase normale è che una volta che un composto si desorbe dal mezzo, non si adsorbe più perché la fase mobile sempre più polare si adsorbe preferenzialmente al suo posto.
Le differenze di polarità (forza di legame) tra i composti possono essere sottili come l’aggiunta di un gruppo funzionale diverso, differenze di posizione del gruppo funzionale (Parida, 2006) come su un anello aromatico, o distinte come composti con strutture completamente diverse, Figura 3.
Figura 3. Separazione di composti con polarità diverse in base al tipo di gruppo funzionale e alla posizione sulla molecola. Per ordine di eluizione – naftalene (nessuna funzionalità polare), 1-nitronaftalene, o-nitroanilina, m-nitroanilina, p-nitroanilina. Le nitroaniline differiscono solo nella posizione del gruppo funzionale nitro rispetto all’ammina.
Quindi, per riassumere, le separazioni cromatografiche in fase normale si basano sulle differenze di polarità dei composti (sia evidenti che sottili), la loro attrazione per la fase stazionaria e la loro solubilità nella fase mobile. Per ottenere i migliori risultati di purificazione, si raccomanda di effettuare un solvente scouting utilizzando la TLC.
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1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
