Trombocitopenia indotta da eparina (HIT) – Un approccio di laboratorio sensato (si spera)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: January 28, 2020

Trombocitopenia indotta dall’eparina (HIT) – Un approccio di laboratorio sensato (si spera)

Nel 1980, sono stato esposto alla mia prima richiesta di un work-up su un disturbo che non avevo mai sperimentato. Un ematologo del nostro istituto venne con la richiesta di vedere se un paziente del nostro istituto poteva avere un caso di trombocitopenia indotta da eparina (HIT). Non avevo mai sentito parlare di questo disturbo in quel momento, quindi ho dovuto ricorrere al vecchio modo di cercarlo nell’Index Medicus (libri veri e propri) per avere un riferimento. Non riuscii a trovare nessuna procedura di laboratorio in quel momento nella nostra zona, così mi imbarcai in una missione per ottenere un metodo convalidato in modo da poter assistere questo medico nel trattamento di questo soggetto. In seguito ho trovato un metodo che utilizzava l’aggregometria in trasmittanza luminosa (LTA). Questa procedura ha utilizzato plasma ricco di piastrine (PRP) di donatori normali e siero di donatori pazienti con concentrazioni multiple di UFH per controllare la reazione di aggregazione. Questo è stato eseguito su un aggregometro a doppio canale LTA Chronolog. Non posso darvi il riferimento perché Pubmed risale solo al 1983 sull’argomento.

Poi ho dovuto imparare cosa fosse la HIT. La HIT è la conseguenza di una risposta immunitaria che è una contraddizione in termini o un “paradosso” di reazioni. La trombocitopenia immune indotta da farmaci può essere causata da farmaci come il chinino e la vancomicina che causano una trombocitopenia immediata e drastica (<20 x 109/L), che provoca gravi emorragie. Una persona con una vera reazione HIT può perdere il 50% delle sue piastrine a partire dall’inizio dell’eparina dopo un periodo di 5 giorni o più, ma invece di problemi emorragici, sviluppa problemi trombotici.

HIT è un problema di risposta immunitaria causato da anticorpi IgG. Gli anticorpi si sviluppano in risposta all’eparina non frazionata (UFH) e all’eparina a basso peso molecolare (LMWH). L’incidenza in risposta alla terapia con UFH è dello 0,5-5%. Nella terapia con LMWH l’incidenza di HIT è un decimo di quella che si osserva con UFH.

HIT è un disturbo che richiede al medico di prendere decisioni rapide per evitare conseguenze catastrofiche al paziente. Essi possono usare il punteggio 4Ts insieme alla conta delle piastrine per guidarli sull’opportunità di ordinare protocolli di test di laboratorio: Il 4Ts è un sistema di punteggio pretest per la HIT che è ampiamente usato nella pratica clinica. Vedi la tabella qui sotto. Il titolo si riferisce a quattro caratteristiche della HIT:

• Trombocitopenia
• Tempistica della trombocitopenia relativa all’esposizione all’eparina
• Trombosi o altre conseguenze della HIT
• Probabilità di altre cause di trombocitopenia

Tabella. 4Ts score

Feature	Score
	2 punti	1 punto	0 punti
Trombocitopenia	> caduta del 50% e nadir piastrinico 20-100 × 109/L	30%-50% caduta o nadir piastrinico 10-19× 109/L	< caduta del 30% o nadir piastrinico < 10×109/L
Tempistica della caduta della conta piastrinica	Inizio chiaro il giorno 5-10 o ≤1 d se l’esposizione all’eparina negli ultimi 30 d	Consistente con la caduta del giorno 5-10, ma non chiaro (ad esempio, conta delle piastrine mancante); insorgenza dopo il 10° giorno; o caduta ≤1 giorno se l’esposizione all’eparina risale a 30-100 giorni prima	Caduta della conta piastrinica ≤4 giorni senza recente esposizione all’eparina
Trombosi o altre sequele	Nuova trombosi (confermata); necrosi della pelle nei punti di iniezione dell’eparina; reazione anafilattoide dopo bolo di eparina endovena; emorragia surrenale	Trombosi progressiva o ricorrente; lesioni cutanee eritematose; trombosi sospetta ma non provata	Nessuno
Altre cause di trombocitopenia	Nessuno apparente	Possibile	Definito

Il punteggio massimo è 8. Un punteggio di 6-8 è indicativo di un’alta probabilità di HIT. Un punteggio di 4-5 è indicativo di una presenza intermedia di HIT e un punteggio di 0-3 è una bassa possibilità di presenza di HIT.3,4

Se la HIT è sospettata da un punteggio 4Ts elevato, il laboratorio assisterà il medico nel fare una diagnosi accurata. Questo può essere fatto con una serie di test. Di solito rientrano in due classi: immunologici e funzionali. Le seguenti informazioni discuteranno i test che sono più comunemente usati nei test di laboratorio per il disturbo.

Test diagnostici di laboratorio per la HIT

HIT Immunoassay: Test per rilevare gli anticorpi anti-PF4/eparina

Saggi immunoenzimatici (EIA) (rilevano le IgG)

EIA (rilevano gli anticorpi polispecifici)

Questi metodi sono solitamente PF4 dipendenti con alta sensibilità. I soggetti con HIT risulteranno positivi al 97% con i kit in fase solida. Questi sono ampiamente disponibili in commercio. I metodi sono di solito testati per lotti a causa della durata di questo metodo. Tuttavia, i risultati debolmente positivi possono avere una bassa specificità. Le linee guida per la positività devono essere stabilite in ogni laboratorio.

– Test di chemiluminescenza IgG-specifica (CLIA)

Un test immunologico di chemiluminescenza (CLIA) è una procedura automatizzata rapida che rileva gli anticorpi anti-PF4/eparina utilizzando particelle magnetiche rivestite di PF4/polivinil sulfonato (PVS). Dopo l’incubazione, la separazione magnetica e una fase di lavaggio, viene aggiunto un tracciante costituito da un anticorpo anti-IgG umane marcato con isoluminolo, che si lega agli anticorpi anti-PF4/eparina sulle particelle. Una seconda incubazione, la separazione magnetica e il lavaggio completano la reazione. Si ottiene una lettura OD proporzionale alla concentrazione degli anticorpi anti-PF4/ eparina misurata. Il test viene solitamente eseguito su richiesta con un tempo di risposta di circa 30 minuti. In uno studio che ha confrontato questo metodo con il gold-standard del test di rilascio della serotonina (SRA), le correlazioni del test sono state eccezionali in specificità e sensibilità (98,8/97,0% rispettivamente).6

– Test immunoturbidometrico al lattice (LIA) per (HIT).

LLIA è classificato come un test immunologico. Si differenzia dalla maggior parte degli altri test immunologici, come gli EIA, in quanto la presenza di anticorpi PF4/reattivi all’eparina nel plasma del paziente provoca l’inibizione dell’agglutinazione delle particelle attraverso la competizione con un anticorpo monoclonale che simula la HIT. Di conseguenza, il LIA è stato chiamato un “test immunologico funzionalizzato”, che in teoria suggerisce che potrebbe fornire una specificità diagnostica intermedia tra il test funzionale altamente specifico, SRA, e i metodi EIA meno specifici dipendenti dal PF4. Si tratta di una procedura facilmente automatizzata con un tempo di esecuzione di circa 20 minuti. Gli studi hanno dimostrato una sensibilità del 97,4% e una specificità del 91,2%.7

Saggio a flusso laterale (STiC):

I test immunologici a flusso laterale rilevano gli anticorpi IgG contro i complessi PF4/polyanion contenuti in una scheda di valutazione in cui i risultati vengono letti visivamente. Con un tempo di incubazione di 10 minuti, questo è un metodo rapido per determinare la presenza di una HIT.

Saggi funzionali HIT: Saggi che rilevano anticorpi in grado di legare e attivare le piastrine

Saggio di rilascio della serotonina (SRA) – Test di attivazione piastrinica indotta dall’eparina (HIPA) – Test di aggregazione piastrinica (PAT) – Saggi basati sulla citometria a flusso.

Saggio di rilascio della serotonina (SRA): saggio di conferma della HIT

Questo metodo rileva gli anticorpi attivatori delle piastrine. L’SRA misura la serotonina radiomarcata rilasciata dalle piastrine.9,10 Un risultato positivo richiede > 20% di rilascio di serotonina con basse dosi di UFH e < 20% di rilascio in presenza di alti livelli di UFH. Questo metodo in passato è stato generalmente riconosciuto come il gold standard per i test di conferma. Ha un tasso di sensibilità e specificità del 95%. L’SRA rileva la presenza di anticorpi attivatori piastrinici. Ha la più alta sensibilità/specificità per la HIT clinica. L’SRA ha anche una specificità diagnostica molto maggiore rispetto all’EIA. L’SRA non dovrebbe essere eseguito senza un precedente risultato positivo dell’EIA come test di screening. Questo aiuterà ad escludere il problema di una SRA falsamente positiva. Se si trova un EIA negativo in un campione di soggetto con un SRA positivo, questo dovrebbe essere un “avviso di allarme” che il metodo SRA deve essere valutato.

Il SRA può anche fornire informazioni sul fatto che un campione di siero HIT possa produrre una forte risposta piastrinica in assenza di eparina. L’attivazione piastrinica indipendente dall’eparina è un avvertimento di una presenza estremamente grave di HIT. Questo risultato potrebbe indicare una HIT a insorgenza ritardata e una HIT fortemente positiva con la presenza di una coagulopatia da consumo con un rischio di trombosi microvascolare.

Il test è complesso, costoso e richiede tempo. Sono richieste piastrine di donatori normali (difficili da standardizzare a causa delle reazioni individuali dei donatori normali). Pertanto, è un test relativamente non standardizzato che non è ampiamente utilizzato.9,10

Saggio di attivazione piastrinica indotta da eparina (HIPA):

Questo metodo è un test di attivazione piastrinica lavata che viene generalmente eseguito solo in Europa. Questo test viene eseguito tramite aggregazione piastrinica e determinato visivamente da un punto finale di attivazione piastrinica.10 In confronto, l’SRA viene eseguito testando le piastrine in un agitatore e reagisce per 60 minuti. L’HIPA differisce in quanto utilizza piastrine agitate e lette con mezzi visivi a intervalli di 5 minuti per 45 minuti.

Alcuni ricercatori hanno osservato che il metodo HIPA è più sensibile per rilevare gli anticorpi attivatori piastrinici rispetto alla procedura SRA. Questo risultato, tuttavia, potrebbe raccogliere anticorpi non patogeni che abbassano la specificità della diagnosi.6

Saggi di aggregazione piastrinica

(LTA: aggregometria a trasmissione luminosa)/WB: aggregometria del sangue intero):

L’aggregometria a trasmissione luminosa (LTA) è stato il primo test usato per determinare una risposta qualitativa delle piastrine agli anticorpi HIT. Si esegue mettendo il PRP normale del donatore e il PRP del paziente in una cuvetta che viene agitata. L’eparina viene aggiunta alla miscela a diverse concentrazioni e l’aggregazione viene monitorata per 15 minuti. Se un campione mostra aggregazione, viene aggiunta una concentrazione maggiore di eparina per determinare il punto in cui l’aggregazione viene inibita. A questo viene data una determinazione del risultato qualitativo positivo o negativo: negativo, debolmente positivo o fortemente positivo (0, 2, 3). Questo test non è più utilizzato per l’intensità del lavoro coinvolto e la sua sensibilità relativamente bassa.11

– L’aggregometria piastrinica a sangue intero (WB) utilizza una miscela di piastrine normali del donatore e sangue intero o siero del paziente, a seconda dell’aggregometro utilizzato. Se questa informazione non è nota, il donatore dovrebbe essere di gruppo sanguigno O. Il donatore o i donatori di sangue intero dovrebbero essere prequalificati (usando un campione positivo alla HIT) per assicurare che il campione reagisca all’anticorpo. A seconda del metodo WB il campione può essere prelevato in una normale provetta di citrato di sodio al 3,2% o in una speciale provetta di raccolta di hirudina. Entrambi i metodi utilizzano una forma di aggregometria a impedenza. Per ogni metodo, l’eparina e i campioni di sangue vengono incubati e l’aggregazione viene osservata mediante aggregometria a impedenza. Tutti i campioni che mostrano una risposta di aggregazione sono poi messi alla prova con una concentrazione più alta di eparina fino a quando non viene determinata alcuna aggregazione. L’aggregometria piastrinica WB è considerata un test quantitativo ed è riportata come valori da 0 a 3, a seconda della concentrazione dell’eparina richiesta per ridurre l’aggregazione osservata.11

Citometria a flusso per la presenza di HIT

Il Platelet P-Selectin Expression Assay (PEA) è usato per la valutazione della HIT tramite citometria a flusso. Come abbiamo discusso prima, il metodo SRA è il “gold standard” per i test di conferma per riconoscere gli anticorpi che possono riconoscere la PF4 in un compex con la presenza di eparina. Alcuni pazienti trattati con eparina senza la presenza di HIT possono essere positivi agli anticorpi. L’SRA è solitamente disponibile solo in speciali laboratori di riferimento. Il metodo è dispendioso in termini di tempo, tecnicamente impegnativo ed espansivo. Non è possibile un turn-around-time rapido, il che ritarda ulteriormente la diagnosi per la presenza di una HIT che richiede un trattamento immediato per prevenire possibili problemi di vita. Uno studio recente ha valutato il metodo SRA rispetto alla tecnica PEA che utilizza un sistema di citometria a flusso. I saggi utilizzano il saggio di espressione della P-selectina PF4 dipendente dalla PEA. Uno studio retrospettivo è stato eseguito su campioni di siero conservati da 91 soggetti. Tutti i pazienti analizzati avevano precedenti informazioni sulla HIT 4Ts che includevano le seguenti informazioni: trombocitopenia, il momento della perdita della quantità di piastrine, una diagnosi di trombosi e qualsiasi altro caso di trombocitopenia. Tutti i soggetti con un punteggio 4Ts intermedio e un test PF4 EIA elevato con un OD ≥2.0 o un punteggio 4Ts elevato e un test PF4 EIA inferiore con un OK di ≥1.0 sono stati classificati HIT positivi; gli altri campioni sono stati classificati come HIT negativi.

In questo studio la PEA ha avuto un risultato diagnostico superiore (area sotto la curva di 0.92 vs 0.82;P-0.02) rispetto alla SRA. Undici dei 16 campioni di siero che erano PEA positivi e SRA negativi erano positivi alla HIT. Gli autori hanno dichiarato che altri studi che hanno utilizzato campioni con marcatori piastrinici simili e campioni diluiti in serie da soggetti con diagnosi confermata di HIT hanno dimostrato che la PEA è più sensibile della SRA per gli anticorpi attivanti le piastrine.

Hanno quindi concluso che la PEA è più semplice da eseguire e i risultati hanno mostrato un risultato più accurato nella diagnosi della presenza di una HIT.13

Un altro test basato sulla citometria di flusso è l’HITAlert della IQ Products. In uno studio del 2013 è stato sviluppato un protocollo utilizzando il metodo della citometria a flusso HITAlert per rilevare le HIT in un laboratorio ospedaliero di assistenza terziaria. Essi hanno confrontato il punteggio 4Ts per lo screening della possibile presenza di una HIT in 37 soggetti. Il siero è stato analizzato per la presenza di anticorpi HIT con il metodo della citometria a flusso HITAlert e poi confrontato con un test antigenico. I metodi comparativi erano il test immunologico in gel di particelle (PaGIA) ID PF4/Hep Ab e due test funzionali. Hanno usato il Multiplate WBA (non disponibile negli Stati Uniti e in Canada) e i metodi SRA. I loro risultati sono stati i seguenti: La citometria a flusso ha mostrato HIT positiva in 14 dei 37 pazienti. Nei 4Ts punteggio di basso (0 di 8) intermedio (5 di 19) e alto (9 di 10). Rispetto alla SRA, il metodo a flusso aveva una specificità del 100% e una sensibilità dell’81% per identificare la presenza di una HIT. Anche il test funzionale WBIA aveva una sensibilità dell’81% e una specificità del 90% rispetto all’analisi con la citometria a flusso. Tuttavia, la procedura PaGIA aveva solo una specificità del 20% ma una sensibilità del 20%. La citometria a flusso ha migliorato la specificità della procedura antigenica. Questo era più evidente nel gruppo a rischio intermedio 4T. Questo era evidente in tutti e 3 i metodi funzionali usati nel protocollo. Gli investigatori hanno concluso che il metodo della citometria a flusso HITAlert potrebbe migliorare la specificità dell’identificazione di una HIT senza perdere sensibilità.12 Questo test è solo per uso di ricerca negli Stati Uniti e in Canada e non è disponibile per le procedure diagnostiche.

Sommario per la rilevazione della HIT

Vorrei concludere con un algoritmo che si trova nel riferimento #14 di Cuker et al, che è raccomandato per la diagnosi di HIT. Si tratta di un algoritmo diagnostico di punteggio intermedio/alto 4Ts, seguito da un test immunologico, seguito da un test funzionale che risulta in: – Pochi falsi negativi (mancate diagnosi di HIT), e – Pochi o nessun falso positivo (diagnosi errate di HIT).

Nota: Un test funzionale potrebbe non essere necessario per i pazienti nel gruppo ad alta probabilità in base al loro punteggio 4Ts e un test immunologico molto positivo (valore ELISA di > 2. 0 unità OD).0 unità OD).

L’incidenza della presenza di HIT è un’interazione avversa al farmaco moderata dagli anticorpi attivatori delle piastrine che hanno come bersaglio i complessi PF4/eparina. È responsabilità del laboratorio determinare i saggi di laboratorio appropriati per identificare la presenza o e la capacità funzionale degli anticorpi indotti dall’eparina di attivare le piastrine. Questi test devono essere eseguiti in modo tempestivo per aiutare i medici a prevenire situazioni trombotiche catastrofiche.

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