Efeito do Bacillus megaterium-Coated Diets on the Growth, Digestive Enzyme Activity, and Intestinal Microbial Diversity of Songpu Mirror Carp Cyprinus specularis Songpu

Abstract

O presente estudo foi realizado para avaliar o efeito de uma dieta revestida com Bacillus megaterium no desempenho de crescimento, enzimas digestivas, e diversidade microbiana intestinal na carpa espelho Songpu (Cyprinus specularis Songpu). Os peixes foram alimentados manualmente com duas dietas (uma de controlo e uma de B. megaterium) três vezes ao dia até aparente saciedade durante 56 dias. Em comparação com o grupo de controlo, a suplementação com a dieta com B. megaterium aumentou o crescimento dos peixes e reduziu significativamente a taxa de conversão alimentar (). As actividades de amilase e lipase foregut no grupo de tratamento foram significativamente mais elevadas do que as do grupo de controlo (). As actividades de foregut, midgut, e hindgut proteases no grupo de tratamento foram todas mais altas do que as do grupo de controlo (). Os resultados do sequenciamento dos 16S genes rDNA da microbiota através do sequenciamento de alto rendimento mostraram que a diversidade e abundância da microflora intestinal aumentou juntamente com o crescimento da carpa Songpu espelho. A carpa Songpu espelho alimentada com uma dieta revestida com B. megaterium mostrou proporções aumentadas de Bacillus intestinal e Lactococcus a nível do género, e ambos foram significativamente maiores do que os do grupo de controlo (). Estes resultados sugerem portanto que a aplicação dietética de B. megaterium pode melhorar o crescimento e a actividade enzimática digestiva da carpa Songpu espelho e enriquecer a composição benéfica do género da sua principal microflora intestinal.

1. Introdução

Peixe, como uma das principais fontes dietéticas de proteína animal, desempenha um papel muito importante na estrutura alimentar humana. No entanto, nos últimos anos, a segurança dos produtos aquáticos tornou-se um dos maiores factores que têm dificultado o desenvolvimento de produtos aquáticos devido à preocupação com a segurança das hormonas, antibióticos e microrganismos em excesso. Com o rápido desenvolvimento da agricultura intensiva de alta densidade, o ambiente aquático deteriora-se diariamente, resultando em surtos de doenças e até na morte em massa de animais de criação. Há uma necessidade urgente de encontrar alternativas ambientalmente amigáveis e seguras para garantir o crescimento saudável dos animais de cultivo .

Como um novo aditivo alimentar após a era dos antibióticos, os probióticos são considerados importantes substitutos para os antibióticos alimentares. Estudos demonstraram que o uso de probióticos não só pode promover o crescimento de animais aquáticos e melhorar sua taxa de sobrevivência, mas também pode reduzir a incidência de doenças de animais aquáticos . O Bacillus é uma bactéria gram-positiva saprófita comumente encontrada no ambiente de reprodução . A pesquisa e aplicação dos Bacilos no campo da aquacultura tem atraído muita atenção. A primeira aplicação de probióticos em aquacultura foi feita através do equilíbrio da população bacteriana na água, e obteve bons resultados . Alguns estudos mostraram que a adição de Bacillus subtilis à alimentação não só pode promover o crescimento de animais aquáticos e melhorar as actividades das suas enzimas digestivas e a sua imunidade não específica, como também pode melhorar a estrutura da sua microflora intestinal. Em meados do século XX, estudiosos chineses começaram a estudar o Bacillus megaterium, concentrando-se principalmente no rastreio de estirpes, particularmente a sua capacidade de decompor a matéria orgânica, o seu metabolismo de azoto e a sua aplicação como probiótico no tratamento de águas residuais de aquacultura .

A carpa comum (Cyprinus carpio) é a espécie de peixe de água doce mais cultivada na China, e a produção de carpa comum foi de 2.962.218 t em 2018 . A carpa espelho Songpu (Cyprinus specularis Songpu), uma variedade de carpas comuns, é responsável por uma proporção cada vez maior da produção devido ao seu crescimento relativamente mais rápido, melhor resistência a doenças, maior taxa de conversão de carne e quase ausência de escamas na superfície do corpo. No entanto, com a expansão e promoção da agricultura de alta densidade, aumento da frequência de alimentação e poluição da água, os problemas de segurança e qualidade alimentar tornaram-se cada vez mais graves.

Os nutrientes estão entre os factores mais importantes e facilmente reguláveis que afectam a resistência dos animais aquáticos. A microbiologia alimentar inclui microorganismos que têm efeitos benéficos e deletérios na qualidade e segurança alimentar e que podem, portanto, ser preocupantes para a saúde pública. Neste estudo, o nosso objectivo foi avaliar o efeito das dietas revestidas com B. megaterium no crescimento, actividade enzimática digestiva e diversidade microbiana intestinal da carpa Songpu espelho e fornecer uma base teórica para a prática de piscicultura saudável e ecológica.

2. Materiais e Métodos

2.1. Preparação da dieta

B. megaterium foi preparado em nosso laboratório . O conteúdo de B. megaterium foi . A ração comercial foi comprada da Zhejiang AIPHA Feed Co., Ltd., China. Os valores garantidos da análise da composição do produto da ração são mostrados na Tabela 1. O caldo de fermentação de B. megaterium foi uniformemente pulverizado na superfície do material comercial a uma taxa de 100 ml/kg, e então, a ração pulverizada foi colocada em um local fresco por 1 h, após o que foi usada como ração experimental do grupo. O grupo de controle foi alimentado com a ração comercial inalterada.

2.2. Experiência de alimentação

Carpa espelho de carpa (Cyprinus specularis Songpu) (peso corporal ) foram obtidos da Estação Experimental Hulan do Instituto de Investigação Pesqueira do Rio Heilongjiang na Província de Heilongjiang, China (45,97°N, 126,63°E). Os peixes foram aclimatados às condições laboratoriais durante 14 dias e adaptados à ração de controlo experimental antes da experiência. Depois foram seleccionadas 90 carpas saudáveis Songpu espelho e distribuídas aleatoriamente em dois grupos (grupo de controlo e grupo experimental). Cada tratamento foi realizado em triplicado, e cada replicado tinha 15 peixes. O grupo de controlo foi alimentado com ração comercial. O grupo de tratamento foi alimentado com ração comercial revestida com B. megaterium. A quantidade de alimentação diária era de 3% do peso corporal da carpa Songpu espelho, três vezes por dia às 08 : 00, 12 : 00, e 19 : 00. Todo o período experimental foi de 56 dias. Durante o período experimental, a água do laboratório foi substituída por 1/3 do volume de água por semana. A qualidade da água foi medida (usando YSI professional plus, Ohio State, EUA) diariamente durante o período experimental, a temperatura da água variou de 18 a 25°C, e um compressor de ar foi usado para adicionar oxigênio 24 h por dia. Os peixes foram pesados tanto no início como no final da experiência de alimentação.

2.3. Recolha de amostras

Antes da experiência de alimentação, dez peixes foram retirados aleatoriamente do aquário de cultura temporária, e os seus pesos corporais iniciais foram medidos. Em seguida, o tracto intestinal foi recolhido para a medição da microflora intestinal inicial (grupo inicial). No fim da experiência de 56 dias de alimentação, aproximadamente 24 horas após a última alimentação, todos os peixes foram anestesiados com MS-222 diluído na água a uma concentração de 75 mg/l. Estes peixes foram contados e pesados para determinar a taxa de ganho de peso (WGR), taxa de crescimento específico (SGR), e taxa de conversão alimentar (FCR, Tabela 2) .

Após a obtenção do peso final de todos os peixes, cinco peixes de cada aquário foram seleccionados aleatoriamente e colocados num prato de gelo para dissecação rápida. Amostras de tecidos, incluindo o vísceras, o meio intestino e o hindgut, foram colhidas com tesouras assépticas, lavadas com soro fisiológico asséptico, pesadas, e depois preparadas num homogeneizado com soro fisiológico asséptico (1 : 4). Todas as amostras foram imediatamente armazenadas a -80ºC num congelador para determinação da enzima digestiva. Outros cinco peixes foram também amostrados aleatoriamente de cada aquário. As superfícies dos peixes foram desinfectadas com 75% de álcool antes dos peixes serem levados para uma sala bioclimpa. Após desinfecção adicional, a cavidade abdominal foi aberta, o exterior do intestino foi limpo com 75% de álcool e lavado quatro vezes com água estéril, e depois o tracto intestinal foi recolhido para avaliação da microflora intestinal final.

2,4. Determinação da enzima digestiva

Antes de medir os índices de imunidade, o foregut, o midgut e o hindgut combinados foram homogeneizados manualmente em um homogeneizador de vidro com 0,86% de NaCl (/) para obter uma homogeneização de 10%. Após centrifugação (4000 rpm, 10 min) a 4°C, foi obtido o sobrenadante, constituído principalmente de líquido enzimático bruto. As atividades de amilase, protease e lipase no foregut, midgut e hindgut foram analisadas espectrofotometricamente usando kits de reagentes diagnósticos (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China).

2,5. 16S rRNA Gene Amplification and Illumina Sequencing

DNA microbial foi extraído das amostras intestinais usando o E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. A concentração e purificação final do DNA foram determinadas com um espectrofotômetro NanoDrop 2000 UV-vis (Thermo Scientific, Wilmington, EUA), e a qualidade do DNA foi determinada por eletroforese em gel de agarose a 1%. As regiões hipervariáveis V4-V5 dos genes rRNA 16S da bactéria foram amplificadas com primers 515F (5-GTGCCAGCMGCCGGG-3) e 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTTT-3) usando um sistema de termociclagem PCR (GeneAmp 9700, ABI, EUA). As PCRs foram realizadas usando o seguinte programa: 3 min de desnaturação a 95°C, 27 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s para recozimento a 55°C, e 45 s para alongamento a 72°C, e uma extensão final a 72°C durante 10 min. Os produtos PCR resultantes foram extraídos de um gel de agarose a 2% e posteriormente purificados usando um kit de extracção de gel de ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, EUA) e quantificados usando QuantiFluor™-ST (Promega, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os amplicons purificados foram agrupados em quantidades equimolares e sequenciados () em uma plataforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, EUA) de acordo com os protocolos padrão da Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Xangai, China) .

2.6. Análise estatística

Unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram agrupadas com um corte de 97% de similaridade usando UPARSE (versão 7.1, http://drive5.com/uparse/) com um novo algoritmo “ganancioso” que realiza simultaneamente a filtragem de quimeras e o agrupamento de OTUs. A taxonomia de cada sequência do gene 16S rRNA foi analisada pelo algoritmo RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) contra a base de dados SILVA 16S rRNA usando um limiar de confiança de 70%. Os índices estimadores Chao e ACE foram selecionados para identificar a riqueza da comunidade, e os índices Shannon e Simpson foram usados para identificar a diversidade da comunidade. Todos esses índices em nossas amostras foram calculados com QIIME (versão 1.7.0) e preparados para exibição com software R (versão 2.15.3). As análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software estatístico SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Os dados são expressos como a de três réplicas. Os dados foram submetidos à ANOVA unidirecional, e quando foram encontradas diferenças, as médias foram classificadas usando o teste de comparação múltipla de Duncan. As diferenças foram consideradas significativas em .

3. Resultados

3,1. Efeito da dieta B. megaterium-Coated Diet no crescimento dos peixes

Como mostrado na Tabela 2, a taxa de ganho de peso e taxa de crescimento específico do grupo de tratamento (71,03%, 0,42% dia-1) foi significativamente aumentada em comparação com os do grupo controle (52,75%, 0,33% dia-1, ), e a taxa de conversão alimentar do grupo de tratamento (1,28) foi significativamente menor do que a do grupo controle (2,23, ). Nenhuma mortalidade foi observada durante os 56 dias da experiência de alimentação.

3,2. Efeito da dieta revestida com B. megaterium na atividade enzimática digestiva

Os efeitos da dieta revestida com B. megaterium na atividade enzimática digestiva são mostrados na Tabela 3. A atividade da amilase foregut no grupo de tratamento foi significativamente maior do que a do grupo controle (). As atividades de midgut e hindgut amilase no grupo de tratamento foram significativamente maiores do que as do grupo controle, mas não houve diferenças significativas (). As atividades de foregut, midgut e hindgut protease do grupo de tratamento foram maiores do que as do grupo controle, mas não houve diferenças significativas (). A atividade de lipase do foregut no grupo tratamento foi significativamente maior que a do grupo controle (). As atividades de midgut e lipase hindgut no grupo tratamento foram basicamente as mesmas do grupo controle, e não houve diferenças significativas ().

3.3. Efeito do B. megaterium-Coated Diet on Intestinal Microbial Diversity and Richness

A diversidade microbiana intestinal da carpa espelho Songpu foi determinada por uma sequência de alta produção. O número médio de OTUs detectadas a partir da amostra inicial do grupo foi 63. Após 56 dias, o número médio de UTRs detectadas nos grupos controle e tratamento foi de 114 e 196, respectivamente. O índice de cobertura de todas as amostras foi superior a 0,97, indicando que houve uma alta taxa de detecção. Como mostrado na Tabela 4, os índices Chao e ACE, que reflectem a riqueza da microflora intestinal da carpa espelho Songpu, foram significativamente mais elevados no grupo de tratamento após 56 dias do que nos grupos controle e inicial (). O índice de Shannon da diversidade da comunidade intestinal no grupo de tratamento foi significativamente mais elevado do que no grupo de controlo (). O índice Simpson de diversidade da comunidade intestinal no grupo de tratamento foi significativamente mais baixo do que no grupo controle (). Não houve diferenças significativas para os quatro índices acima entre o grupo controle e o grupo inicial ().

3.4. Efeito da dieta revestida de B. megaterium na composição e alterações da Microbiota Principal no Intestino da Carpa Espelho de Songpu

Uma riqueza microbiana intestinal superior a 1% a nível do filo foi tomada como a microflora principal para as estatísticas apresentadas na Figura 1. O filo dominante no intestino do grupo inicial era predominantemente Fusobacteria (86,36%) e Bacteroidetes (8,60%) antes do início da experiência. Após a experiência de 56 dias de alimentação, o número da microflora intestinal principal aumentou em cada grupo. No grupo controle, os phyla dominantes foram Fusobacteria (86,36%), Bacteroidetes (14,4%), Firmicutes (2,42%), e Proteobacteria (1,37%). No grupo de tratamento, os filas dominantes foram Firmicutes (69,15%), Proteobactérias (23,8%), Bacteroidetes (4,65%) e Actinobactérias (1,43%). Uma riqueza microbiana intestinal superior a 0,5% a nível do género foi tomada como a principal microflora para os cálculos estatísticos, apresentados na Tabela 5. Havia apenas 5 gêneros dos principais microrganismos intestinais no grupo inicial. Após o ensaio de alimentação de 56 dias, os principais microrganismos intestinais aumentaram para 11 gêneros no grupo de tratamento. O microrganismo mais abundante no intestino da carpa espelho Songpu no grupo inicial foi Cetobacterium. Após a experiência de alimentação de 56 dias, o microrganismo mais abundante no grupo de controle ainda era Cetobacterium. No grupo de controle, os 11 gêneros dominantes eram Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified, e Yersinia. A carpa espelho Songpu alimentada com uma dieta revestida com B. megaterium mostrou proporções aumentadas de Bacillus intestinal e Lactococcus ao nível do género, que eram ambos significativamente mais elevados do que os do grupo de controlo ().

Figura 1

Composições microbianas intestinais ao nível do filo na carpa Songpu espelho alimentada com uma dieta revestida com B. megaterium durante 56 dias.

4. Discussão

Probióticos como os Bacilli têm sido amplamente utilizados em aquacultura. Alguns estudos mostraram que a adição de várias estirpes de Bacillus spp. à ração larvar tem alcançado bons resultados e tem um bom efeito promotor no crescimento das larvas dos peixes. A adição de bactérias (estirpe CA2) como suplemento alimentar a culturas larvares xénicas da ostra Crassostrea gigas aumentou consistentemente o crescimento das larvas durante as diferentes estações do ano. A manipulação de microbiota usando probióticos tem sido relatada como uma prática digna para a aquacultura para controlar ou inibir bactérias patogênicas e para melhorar o desempenho de crescimento e a atividade das enzimas digestivas . Em comparação com o grupo de controle sem tratamento, o peso final e o ganho de peso foram significativamente maiores no camarão alimentado com uma mistura de duas dietas de cepas probióticas . Neste estudo, verificou-se que uma dieta revestida com B. megaterium aumentou a taxa de ganho de peso e a taxa de crescimento específico e reduziu a taxa de conversão alimentar, indicando que as dietas revestidas com B. megaterium podem promover o crescimento da carpa espelho Songpu. Resultados semelhantes foram encontrados no peixe gato Clarias sp., onde a adição de B. megaterium PTB 1.4 à sua ração melhorou significativamente a sua taxa de crescimento . Resultados semelhantes foram também encontrados em Penaeus monodon, para os quais foram obtidos valores mais elevados de FCR e SGR após a adição de Bacillus cereus .

As bactérias probióticas são capazes de produzir enzimas digestivas que ajudam os peixes a usar os nutrientes das rações e a digeri-las . A adição de B. megaterium às refeições de proteínas vegetais pode promover o desenvolvimento da morfologia intestinal e aumentar a actividade enzimática digestiva . O estudo dos probióticos para a carpa comum Cyprinus carpio baseado no desempenho do crescimento e na actividade das enzimas digestivas mostrou que as actividades médias das enzimas digestivas de todos os grupos de tratamento probiótico eram significativamente diferentes das do controlo . No presente estudo, uma dieta revestida com B. megaterium teve um efeito positivo e importante nas actividades das enzimas digestivas, especialmente as da amilase e protease no antebraço, no meio do intestino e no intestino grosso. Resultados similares também foram encontrados na tilápia, que mostrou melhora na digestão e crescimento dos alimentos após Bacillus NP5 ter sido adicionado à sua ração. Um maior nível de atividade enzimática obtida com dietas contendo probióticos melhorou a digestão de proteínas, amido, gordura e celulose, o que poderia, por sua vez, explicar o melhor crescimento observado com as dietas suplementadas com probióticos. As enzimas digestivas ajudam os peixes a decompor e digerir os nutrientes da ração, tornando mais fácil para os peixes a absorção dos nutrientes da ração .

Avanços na sequência de alta produção permitiram um extenso catálogo de amostras metagenómicas, fornecendo uma visão da diversidade de espécies microbianas de uma grande variedade de fontes, incluindo o oceano, o solo e o corpo humano. Estes estudos usam tanto o seqüenciamento do gene 16S rRNA para determinar as relações filogenéticas quanto um seqüenciamento mais abrangente de caçadeira para prever as espécies detalhadas e a composição gênica. O índice de riqueza e o índice de diversidade são índices importantes para detectar a diversidade e complexidade dos microrganismos nas amostras . Neste estudo, com o crescimento da carpa Songpu espelho, a diversidade e riqueza microbiana intestinal foram aumentadas, e os índices Chao e ACE, que reflectem a riqueza da microflora intestinal da carpa Songpu espelho, foram significativamente mais elevados no grupo de tratamento do que no grupo de controlo. Além disso, o índice de Shannon da diversidade da comunidade intestinal no grupo de tratamento foi significativamente mais elevado do que no grupo de controlo. Da mesma forma, os resultados também mostraram que a estrutura da microflora intestinal foi alterada quando os juvenis de focinho rombo rombo foram alimentados com dietas suplementadas com diferentes níveis de Bacillus subtilis . A adição de probióticos na alimentação também pode alterar o número e a estrutura da microflora original no trato intestinal do Litopenaeus vannamei e promover as complexas interações entre as comunidades microbianas no trato intestinal do Litopenaeus vannamei .

Neste estudo, a carpa Songpu espelhada alimentada com uma dieta revestida com B. megaterium mostrou proporções aumentadas de Bacillus intestinal e Lactococcus a nível do gênero, que foram ambos significativamente maiores do que os do grupo controle. Os resultados também indicaram que a composição e proporções da microbiota principal no intestino da carpa espelho Songpu pode ser alterada com dietas revestidas com B. megaterium. Em conclusão, o uso de dietas revestidas com B. megaterium pode aumentar significativamente o crescimento dos peixes e reduzir a taxa de conversão alimentar, melhorar as actividades das enzimas digestivas, e enriquecer a composição benéfica do género da microflora intestinal principal.

Data Availability

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Conflitos de interesse

Os autores declaram não ter conflitos de interesse a divulgar.

Confirmações

Este estudo foi financiado pelos Fundos Especiais dos Institutos de Pesquisa Científica Sem Fins Lucrativos de Nível Central (no. HSY202005M), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Heilongjiang (no. QC2018038), o Fundo de Pesquisa Basal da Instituição Científica Central de Interesse Público, Academia Chinesa de Ciências Pesqueiras (nos. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502, e 2020TD56), o Programa Chave Nacional R&D da China (no. 2019YFD0900302), e o Laboratório Principal de Biotecnologia e Reprodução Aquática de Água Doce, Ministério da Agricultura e Assuntos Rurais, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Academia Chinesa de Ciências da Pesca (n.º FBB2017-04).