A nossa clientela na Biotage tem formações interessantes e diversificadas, desde químicos sintéticos altamente qualificados, a especialistas em química de produtos naturais, até àqueles que estão apenas a começar a sua viagem com a química. O que aprendi ao longo dos meus 40+ anos de carreira na “arte” da cromatografia é que para muitas dessas pessoas finas existe uma falta de compreensão sobre os princípios cromatográficos. Esta falta de compreensão, acredito, deve-se apenas ao seu currículo principal de estudo, onde a ciência da separação é usada como uma ferramenta durante o trabalho de laboratório, mas os princípios por trás dos componentes de uma mistura separam (ou não separam) talvez não sejam efetivamente explicados, compreendidos ou estudados.
Existem quatro tipos básicos de cromatografia, incluindo:
- Cromatografia gás-líquido (GC)
- Cromatografia líquido-líquido (LLC)
- Cromatografia líquido-sólido (LSC)
- Cromatografia de exclusão de tamanho/cromatografia de permeação gel (SEC/GPC)
Para este post eu vou focar na cromatografia líquido-sólido.
Cromatografia líquido-sólido
Esta é a mais popular das técnicas mencionadas acima porque é útil para separações de compostos semi-voláteis e não-voláteis. Como não é necessário calor para eluir compostos de uma coluna separadora (como com GC), a cromatografia sólido-líquido requer o uso de um solvente ou mistura de solventes miscíveis com polaridade diferente para que os componentes químicos da amostra se separem uns dos outros.
Com LSC, a amostra é carregada em um suporte sólido ou fase estacionária. Os componentes da amostra ligam-se à fase estacionária, mas em vários graus. A quantidade de interação com a fase estacionária controla a taxa de separação e a eficácia. Assim, quanto maior for a atração pela fase estacionária, mais tempo os compostos necessitam para se eluir. Para ajudar a eluir esses compostos fortemente ligados, a proporção de solvente precisa mudar (aumentando a força) ao longo do tempo.
No reino do LSC existem várias técnicas cromatográficas diferentes…
- Cromatografia de papel (PC)
- Cromatografia de camada fina (TLC)
- Cromatografia de alta…performance liquid chromatography (HPLC)
- Cromatografia flash (FC)
- Cromatografia de troca de íons (IX)
- Cromatografia de afinidade (AC)
- Cromatografia espiral (CC)
- Cromatografia de fluidos supercríticos (SFC)
Neste post eu vou focar na cromatografia flash, cujos princípios são os mesmos do HPLC. Ambos usam colunas preenchidas com uma fase estacionária na qual a amostra é injetada e através da qual o solvente é bombeado. Entretanto, a cromatografia flash utiliza colunas maiores do que a HPLC, que é principalmente uma técnica de separação analítica.
Cromatografia flash é uma técnica cromatográfica preparativa cujas colunas também são preenchidas com um suporte ou meio sólido que tem um tamanho de partícula maior do que as colunas de HPLC. Essas diferenças de meios e tamanho de coluna permitem que as colunas flash purifiquem mais compostos por grama de meio do que as colunas HPLC.
- Cromatografia em flash usa 15 µm até 60 µm de partículas de meio
- HPLC usa 1,7 µm até 10 µm de partículas de meio
O que acontece dentro da coluna
Cromatografia em flash e HPLC é realizada usando a metodologia de fase normal ou de fase reversa. As diferenças entre essas metodologias estão na química de fase estacionária e nos solventes utilizados para separar os componentes químicos individuais de uma mistura.
- Fase normal utiliza solventes não-polares e moderadamente solventes (por exemplo, hexano e acetato de etila) para a fase móvel e um meio polar (e.g. sílica) como fase estacionária
- Fase inversa, usando solventes polares e uma fase não polar estacionária
Com estas metodologias sendo “polares” opostas umas das outras (trocadilho pretendido), a ordem de eluição para a maioria dos compostos é invertida. É aqui que acontece a química por detrás das separações cromatográficas.
Fase normal por agora.
Cromatografia de fase normal
Cromatografia de fase normal, os compostos químicos que compõem uma mistura (por exemplo, mistura de reação, extrato de produto natural, etc.) são dissolvidos em um solvente adequado e injetados na coluna. Quando a mistura entra em contato com a fase polar estacionária, digamos sílica, os compostos da mistura e seu solvente de dissolução competem com a fase móvel para os locais de ligação da sílica. Quanto mais polar o produto químico, mais fortemente atraído pela sílica. Esta atração é chamada de adsorção (diferente da absorção).
Absorção é o que ocorre quando uma esponja ou toalha de papel interage com um líquido. A adsorção é uma combinação de interações físicas e químicas onde a superfície polar da sílica liga quimicamente os componentes químicos que ela entra em contato, principalmente devido a fenômenos conhecidos como ligação de hidrogênio e forças de van der Walls.
Quando qualquer produto químico interage com a sílica seca (como usada com uma nova coluna de flash), a adsorção ocorre. Esta interação libera calor, o que pode causar problemas com a estabilidade do composto e com os resultados cromatográficos. Por este motivo, as colunas de sílica são normalmente equilibradas (pré-molhadas) com um solvente de baixa polaridade antes da introdução da amostra. Solventes de baixa polaridade (por exemplo, hexano, heptano, ciclohexano) são solventes fracos e não bem adsorvidos pela sílica ou outros meios polares.
A química de superfície da sílica é uma mistura de grupos hidroxila (silanóis) e éteres silílicos, Figura 1. Estes grupos funcionais são polares, pensa-se que tenham carga negativa, e adsorvem compostos deficientes em electrões. As pi-clouds dos compostos aromáticos podem se ligar hidrogênio com os grupos hidroxila da sílica durante a adsorção.1
Figure 1. A química cromatográfica da sílica compreende uma mistura de silanóis e funcionalidades do éter de silício. Para garantir uma boa ligação (adsorção) dos componentes da amostra, a amostra a ser purificada precisa ser dissolvida e carregada na coluna com um solvente fraco (carga líquida) ou, dissolvida com um solvente mais forte (polar), misturada com um meio inerte (por exemplo, sílica, terra diatomácea), seca e embalada numa coluna diferente colocada em linha com a coluna de purificação (carga seca). A carga seca elimina muitos problemas encontrados quando se utiliza uma carga líquida, especialmente com uma amostra dissolvida em um solvente polar.
Após a carga da amostra, os solventes de fase móvel são introduzidos. Entretanto, para conseguir uma separação os componentes da amostra precisam ser desorbitados da fase estacionária em diferentes taxas. Embora isto seja possível utilizando um solvente de polaridade constante (eluição isocrática), uma melhor purificação é normalmente realizada utilizando uma fase móvel que começa com baixa polaridade e aumenta sua polaridade ao longo do tempo. Isto é conhecido como eluição de gradiente.
Com um gradiente, aqueles compostos com maior solubilidade no solvente de baixa polaridade (compostos de menor polaridade) desorbitam primeiro e passam através da coluna. medida que a polaridade do solvente de fase móvel aumenta, os compostos adsorvidos desorbrem do meio a diferentes velocidades com base na sua solubilidade na fase cada vez mais polar móvel, Figura 2.
Figure 2. Superior – Com eluição isocrática (polaridade de fase móvel constante), os compostos desorbitam mais lentamente do que quando se utiliza um gradiente (inferior). A eluição gradiente tipicamente proporciona uma melhor separação/purificação do que a eluição isocrática.
Uma característica interessante da cromatografia de fase normal é que uma vez que um composto desorbs da mídia, ele nunca mais adsorve porque a fase cada vez mais polar móvel adsorve preferencialmente em seu lugar.
As diferenças de polaridade (força de ligação) entre compostos podem ser tão subtis como a adição de um grupo funcional diferente, as diferenças de localização do grupo funcional (Parida, 2006) como num anel aromático, ou tão distintas como compostos com estruturas totalmente diferentes, Figura 3.
Figure 3. Separação de compostos com diferentes polaridades com base no tipo de grupo funcional e localização na molécula. Por ordem de eluição – naftaleno (sem funcionalidade polar), 1-nitronaftaleno, o-nitroanilina, m-nitroanilina, p-nitroanilina. As nitroanilinas diferem apenas na localização do grupo funcional nitro em relação à amina.
Então, para resumir, as separações cromatográficas de fase normal são baseadas em diferenças de polaridade composta (tanto óbvias quanto sutis), sua atração pela fase estacionária, e sua solubilidade na fase móvel. Para obter os melhores resultados de purificação é recomendado o uso de TLC.
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1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
