Trombocitopenia induzida por Heparina (HIT) – Uma abordagem sensata ao laboratório (esperançosamente)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: 28 de Janeiro de 2020

Trombocitopenia induzida por Heparina (HIT) – Uma abordagem laboratorial sensata (esperançosamente)

Volta em 1980, fui exposto ao meu primeiro pedido de um work-up sobre uma desordem que nunca tinha experimentado. Um hematologista da nossa instituição chegou com um pedido para ver se um paciente da nossa instituição pode ter um caso de trombocitopenia induzida por heparina (HIT). Nunca tinha ouvido falar da doença na altura, por isso tive de ir à velha maneira de procurar no Index Medicus (livros actuais) para uma referência. Na altura não consegui encontrar nenhum procedimento laboratorial na nossa área, por isso embarquei numa missão para conseguir validar um método para poder ajudar este médico no tratamento deste assunto. Mais tarde encontrei um método que utiliza a agregometria de transmissão de luz (LTA). Este procedimento usou plasma rico em plaquetas (PRP) e soro de doador normal com múltiplas concentrações de UFH para verificar se havia uma reação de agregação. Isto foi realizado em um Cronologogrômetro LTA de canal duplo. Não posso dar a referência porque Pubmed só remonta a 1983 sobre o assunto.

Então tive que aprender sobre o que era HIT. HIT é o resultado de uma resposta imune que é uma contradição em termos ou um “paradoxo” de reações. A trombocitopenia imune induzida por drogas pode ser causada por medicamentos como quinina e vancomicina que causam uma trombocitopenia imediata e drástica (<20 x 109/L), que causa uma hemorragia grave. Uma pessoa com uma verdadeira reacção HIT pode perder 50% das suas plaquetas começando após o início da heparina após um período de 5 dias ou mais, mas em vez de problemas hemorrágicos, desenvolve problemas trombóticos.

HIT é um problema de resposta imunitária causado por anticorpos IgG. Os anticorpos evoluem em resposta à Heparina não fracionada (UFH) e à Heparina de baixo peso molecular (LMWH). A ocorrência em resposta à terapia de UFH é de 0,5-5%. Na terapia com HBPM a incidência de HIT é um décimo do que é observado com UFH.

HIT é uma desordem que requer que o médico tome decisões rápidas para evitar consequências catastróficas para o paciente. Eles podem usar a pontuação de 4Ts junto com a contagem de plaquetas para orientá-los sobre se devem pedir protocolos de testes laboratoriais: O 4Ts é um sistema de pontuação de pré-testes para o HIT que é amplamente utilizado na prática clínica. Veja a tabela abaixo. O título refere-se a quatro características do HIT:

• Trombocitopenia
• Timulação da trombocitopenia em relação à exposição à heparina
• Trombose ou outras sequelas do HIT
• Probabilidade de outras causas de trombocitopenia

Tábua. 4Ts pontuação

Função	Partitura
	2 pontos	1 ponto	0 pontos
Trombocitopenia	>50% de queda e nadir de plaqueta 20-100 × 109/L	30%-50% de queda ou nadir de plaqueta 10-19× 109/L	< 30% de queda ou Nadir de plaquetas < 10×109/L
Tempo de queda da contagem de plaquetas	Configuração clara no dia 5-10, ou ≤1 d se a exposição à heparina nos últimos 30 d	Consistente com a queda do dia 5-10, mas não clara (por exemplo, contagem de plaquetas ausentes); início após o 10º dia; ou queda ≤1 dia se a exposição à heparina 30-100 dias atrás	Contagem de plaquetas cai ≤4 d sem exposição recente à heparina
Trombose ou outras sequelas	Trombose nova (confirmada); necrose da pele nos locais de injecção de heparina; reacção anafilactoide após o bolo de heparina IV; hemorragia adrenal	Trombose progressiva ou recorrente; lesões cutâneas eritematosas; trombose suspeita mas não provada	Nenhuma
Outras causas de trombocitopenia	Nenhuma aparente	Possível	Definida

A pontuação máxima é 8. Uma pontuação de 6-8 é indicativa de uma alta probabilidade de HIT. Uma pontuação de 4-5 é indicativa de uma presença intermediária de HIT e uma pontuação de 0-3 é uma baixa possibilidade de uma presença de HIT.3,4

Se HIT for suspeito por uma pontuação elevada de 4Ts, o laboratório ajudará o médico a fazer um diagnóstico preciso. Isto pode ser realizado através de uma série de ensaios. Eles geralmente se enquadram em duas classes: imunológicos e funcionais. A informação seguinte irá discutir os testes que são mais utilizados no laboratório para a doença.

Testes de Diagnóstico Laboratorial para HIT

HIT Imunoensaio: Testes para detectar anticorpos anti-PF4/heparina

Imunoensaio enzimático (EIAs) (detectar IgG)

EIA (detectar anticorpos poli-específicos)

Estes métodos são normalmente dependentes do PF4 com elevada sensibilidade. Os sujeitos HIT testarão 97% de positivo com kits de fase sólida. Estes estão amplamente disponíveis comercialmente. Os métodos são geralmente testados em lote devido ao tempo de duração deste método. Entretanto, resultados fracamente positivos podem ter baixa especificidade. Diretrizes para positividade devem ser estabelecidas em cada configuração laboratorial.

– Ensaio quimioluminescente específico para IgG (CLIA)

-A quimioluminescente (CLIA) é um procedimento automatizado rápido que detecta anticorpos anti-PF4/heparina usando partículas magnéticas revestidas com PF4/ sulfonato de polivinil (PVS). Após a incubação, separação magnética e um passo de lavagem, é adicionado um marcador composto por um anticorpo IgG anti-humano marcado com isoluminol, que se liga aos anticorpos anti-PF4/heparina nas partículas. Uma segunda incubação, separação magnética e lavagem completam a reacção. Uma leitura de DO é obtida proporcional à concentração dos anticorpos anti-PF4/heparina medida. Os testes são geralmente realizados a pedido com um tempo de viragem de aproximadamente 30 minutos. Em um estudo comparando este método com o ensaio de liberação de serotonina (SRA) padrão ouro, as correlações do teste foram excelentes em especificidade e sensibilidade (98,8/97,0% respectivamente).6

– Ensaio imunoturbidométrico de látex (LIA) para (HIT).

LIA é classificado como um imunoensaio. Difere da maioria dos outros imunoensaios, como os EIAs, na medida em que a presença de anticorpos PF4/heparina reactivos no plasma do doente resulta na inibição da aglutinação de partículas através da competição com um anticorpo monoclonal que imita o HIT. Consequentemente, a AIA tem sido chamada de “imunoensaio funcionalizado”, o que em teoria sugere que pode fornecer uma especificidade diagnóstica que é intermediária entre o ensaio funcional altamente específico, SRA, e os métodos de AIA menos específicos PF4-dependentes. Este é um procedimento facilmente automatizado com um tempo de resposta de aproximadamente 20 minutos. Estudos mostraram uma sensibilidade de 97,4% e uma especificidade de 91,2%.7

Ensaio de fluxo lateral (STiC):

Imunoensaios de fluxo lateral detectam anticorpos IgG contra complexos PF4/polianion contidos numa ficha de avaliação na qual os resultados são visualmente lidos. Com um tempo de incubação de 10 minutos, este é um método rápido para determinar a presença de um HIT.

Avaliações de HIT funcional: Ensaios que detectam anticorpos capazes de ligar e activar plaquetas

Ensaio de libertação de serotonina (SRA) – Ensaio de activação plaquetária induzida por HIPA – Ensaio de agregação plaquetária (PAT) – Ensaio baseado na citometria de fluxo.

Ensaio de libertação de serotonina (SRA): Ensaio de confirmação HIT

Este método detecta anticorpos activadores de plaquetas. O SRA mede a serotonina radiolabelada libertada pelas plaquetas.9,10 Um resultado positivo requer > 20% de libertação de serotonina com baixa dose de UFH e < 20% de libertação na presença de níveis elevados de UFH. Este método no passado foi geralmente reconhecido como o padrão ouro para testes confirmatórios. Tem uma sensibilidade de 95% e uma taxa de especificidade. O SRA detecta a detecção de anticorpos activadores de plaquetas. Tem a sensibilidade/especificidade mais elevada para HIT clínico. A ARS também tem uma especificidade de diagnóstico muito maior do que a AEI. A ARS não deve ser realizada sem um resultado positivo prévio de AIS como teste de rastreio. Isto ajudará a descartar a questão de uma AIS falso positivo. Se for encontrada uma AIA negativa numa amostra com uma AIS positiva, isto deve ser um “aviso de bandeira vermelha” de que o método AIS precisa de ser avaliado.

A AIS também pode fornecer informações sobre se uma amostra de soro HIT pode produzir uma resposta plaquetária forte na ausência de heparina. A ativação plaquetária independente da heparina é um aviso de uma presença extremamente severa de HIT. Este achado pode indicar uma HIT tardia e forte HIT positiva com a presença de coagulopatia consumida com risco de trombose microvascular.

O teste é complexo, caro e demorado. Plaquetas doadoras normais são necessárias (difíceis de padronizar devido a reações individuais normais do doador). Portanto, é um teste relativamente não padronizado que não é amplamente utilizado.9,10

Ensaio de activação plaquetária induzida por hepatite (HIPA):

Este método é um ensaio de activação plaquetária lavada que normalmente só é realizado na Europa. Este ensaio é realizado por agregação plaquetária e determinado visualmente por um ponto final de activação plaquetária.10 Em comparação, o SRA é realizado testando as plaquetas num agitador e reagiu durante 60 minutos. O HIPA difere no facto de usar plaquetas agitadas e ler por meios visuais em intervalos de 5 minutos durante 45 minutos.

Alguns investigadores observaram que o método HIPA é mais sensível para detectar anticorpos activadores de plaquetas do que o procedimento SRA. Este achado, contudo, pode estar a detectar anticorpos não patogénicos o que leva a baixar a especificidade do diagnóstico.6

Agregação de Agregados Plaquetários

(LTA: light transmittance aggregometry)/WB: whole blood aggregometry):

Agregometria de Transmitância Clara (LTA) foi o primeiro ensaio usado para determinar uma resposta plaquetária qualitativa aos anticorpos HIT. É realizado colocando PRP normal doador e PRP do doente numa cuvette que está a ser agitada. A heparina é adicionada à mistura em diferentes concentrações e a agregação é monitorizada durante 15 min. Se uma amostra apresentar agregação, é adicionada uma concentração maior de heparina para determinar o ponto em que a agregação é inibida. É dada uma determinação qualitativa de resultados positiva ou negativa: negativa, fraca positiva ou forte positiva (0, 2, 3). Este ensaio não é mais usado para a intensidade de trabalho envolvido e sua sensibilidade relativamente baixa.11

– A agregação plaquetária de sangue total (WB) utiliza uma mistura de plaquetas doadoras normais e sangue total ou soro do paciente, dependendo do agregador utilizado. Se essa informação não for conhecida, o dador deve ser do tipo O. O(s) dador(es) de sangue total deve(m) ser pré-qualificado(s) (usando uma amostra positiva HIT) para assegurar que a amostra reage ao Anticorpo. Dependendo do método WB, a amostra pode ser colhida num tubo normal de citrato de sódio a 3,2% ou num tubo especial de colheita de hirudina. Ambos os métodos utilizam uma forma de agregometria de impedância. Para cada método, a heparina e as amostras de sangue são incubadas e a agregação é observada através da agregometria de impedância. As amostras que mostram uma resposta de agregação são então desafiadas com uma maior concentração de heparina até que não seja determinada a agregação. A agregação plaquetária WB é considerada um ensaio quantitativo e é relatada como valores de 0-3, dependendo da concentração da heparina necessária para reduzir a agregação observada.11

Citometria de fluxo para a presença de HIT

O ensaio de expressão plaquetária P-Selectin Expression Assay (PEA) é utilizado para avaliação de HIT por citometria de fluxo. Como discutimos anteriormente, o método SRA é o “padrão ouro” para testes de confirmação para reconhecer anticorpos que podem reconhecer PF4 em um compex com a presença de heparina. Alguns doentes tratados com heparina sem a presença de HIT podem ser positivos para os anticorpos. O SRA está normalmente disponível apenas em laboratórios de referência especiais. O método é demorado, tecnicamente exigente e expansivo. Não é possível um tempo de resposta rápido, o que irá atrasar ainda mais o diagnóstico da presença de uma HIT que requer tratamento imediato para evitar possíveis problemas de risco de vida. Um estudo recente avaliou o método SRA para a técnica PEA que utiliza um sistema de citometria de fluxo. Os ensaios utilizam o ensaio de expressão PF4 dependente de P-selectina para a PEA. Foi realizado um estudo retrospectuoso em amostras de soro armazenado de 91 sujeitos. Todos os doentes testados tinham informação prévia do HIT 4T que incluía o seguinte: trombocitopenia, o tempo de perda da quantidade plaquetária, um diagnóstico de trombose e qualquer outro caso de trombocitopenia. Todos os sujeitos com um resultado intermédio de 4Ts e um teste de PF4 EIA elevado com uma DO ≥2.0 ou um resultado elevado de 4Ts e um teste de PF4 EIA inferior com um OK de ≥1.0 foram classificados como HIT positivo; outras amostras foram classificadas como HIT negativo.

Neste estudo a PEA teve um resultado diagnóstico mais elevado (área sob a curva de 0.92 vs 0.82;P-0.02) do que a SRA. Onze das 16 amostras de soro que foram PEA positiva e SRA negativa foram HIT positiva. Os autores afirmaram que outros estudos utilizando amostras com marcadores plaquetários semelhantes e amostras que foram diluídas em série de srom com diagnóstico confirmado de HIT demonstraram que a PEA é mais sensível que a THSRA para anticorpos activadores de plaquetas.

Concluíram que a PEA é mais simples de realizar e os resultados mostraram um resultado mais preciso ao diagnosticar a existência de um HIT.13

Um outro ensaio baseado na citometria de fluxo é o HITAlert da IQ Products. Em um estudo de 2013 foi desenvolvido um protocolo usando o método de citometria de fluxo HITAlert para detectar HIT em um ambiente de laboratório hospitalar de cuidados terciários. Eles compararam a pontuação de 4Ts para triar a possível presença de um HIT em 37 sujeitos. O soro foi analisado para a presença de anticorpos HIT pelo método de citometria de fluxo HITAlert e depois comparado com um ensaio antigénico. Os métodos comparativos foram o imunoensaio em gel de partículas (PaGIA) ID PF4/Hep Ab e dois testes funcionais. Eles utilizaram o método Multiplate WBA (não disponível nos EUA e Canadá) e os métodos SRA. Os seus resultados foram os seguintes: A citometria de fluxo mostrou HIT positivo em 14 dos 37 pacientes. Nos 4Ts a pontuação foi de baixo (0 de 8) intermediário (5 0f 19) e alto (9 de 10). Quando comparado com a ARS o método de fluxo teve uma especificidade de 100% e uma sensibilidade de 81% para identificar a presença de um TIE. O teste funcional WBIA também teve uma sensibilidade de 81% e uma especificidade de 90% quando comparado com a análise da citometria de fluxo. Entretanto, o procedimento PaGIA teve uma especificidade de apenas 20%, mas uma sensibilidade de 20%. A citometria de fluxo tinha melhorado a especificidade do procedimento antigênico. Isto foi mais proeminente no grupo de risco intermediário 4T. Isto foi evidente nos 3 métodos funcionais utilizados no protocolo. Os investigadores concluíram que o método de citometria de fluxo HITAlert poderia melhorar a especificidade da identificação de um HIT sem perder qualquer sensibilidade.12 Este ensaio é para uso em pesquisa apenas nos EUA e Canadá e não está disponível para procedimentos diagnósticos.

Sumário para detecção de HIT

I gostaria de concluir com um algoritmo que está na referência #14 de Cuker et al, que é recomendado para o diagnóstico de HIT. Trata-se de um algoritmo de diagnóstico com pontuação intermediária/alta de 4Ts, seguido de imunoensaio, seguido de teste funcional que resulta em: – Poucos ou nenhum falso positivo (diagnóstico errado de HIT).

Nota: Um ensaio funcional pode não ser necessário para pacientes no grupo de alta probabilidade com base em seu escore de 4Ts e um imunoensaio muito fortemente positivo (valor ELISA de > 2.0 unidades OD).

A incidência da presença de HIT é uma interacção medicamentosa adversa moderada por anticorpos activadores de plaquetas que visam os complexos de PF4/heparina. É da responsabilidade do laboratório determinar os ensaios laboratoriais adequados para identificar a presença ou a capacidade funcional dos anticorpos induzidos pela heparina para activar plaquetas. Estes ensaios precisam de ser realizados atempadamente para ajudar os médicos na prevenção de situações trombóticas catastróficas.

1. Prince M, Wenham T. Heparin-induced thrombocytopaenia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Heparina não fracionada versus heparinas de baixo peso molecular para evitar trombocitopenia induzida por heparina em pacientes pós-operatórios. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Revisão. Atualização em: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Predictive value of the 4Ts scoring system for heparin-induced thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis. . 2012 15 de novembro. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Avaliação do escore clínico pré-teste (4 T’s) para o diagnóstico de trombocitopenia induzida por heparina em dois cenários clínicos. . 2006 Abr. 4(4):759-65.
5. E de Parkentin, Sheppard JI, Moore JC, et al: Interpretação quantitativa de medidas de densidade óptica usando imunoensaios enzimáticos dependentes de PF4. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. E de Parkentin. Diagnóstico laboratorial de trombocitopenia induzida por heparina. Int. J Hematol de Laboratório. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Melhorando a interpretação clínica do ensaio imunossorvente ligado à enzima antiplaquetária fator 4/heparina para o diagnóstico de trombocitopenia induzida pela heparina através do uso de análise da característica operacional do receptor, relações de verossimilhança específicas do estrato, e Bayes theorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Protocolos de testes laboratoriais para teste de trombocitopenia induzida por heparina (HIT). Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5ª ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. O ensaio de libertação de serotonina plaquetária. Am J Hematol… 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT ou miss? Uma investigação contemporânea abrangente de testes laboratoriais para trombocitopenia induzida por heparina. Patologia. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Usando a citometria de fluxo HitAlert para detectar anticorpos para trombocitopenia induzida por heparina em um hospital terciário… Coagul sangüíneo e Fibrinólise. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. Um novo ensaio de ativação plaquetária dependente de PF4 identifica os pacientes com probabilidade de ter trombocitopenia/trombose induzida por Heparina. Tórax. 2016 Set;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).