Clienții noștri de la Biotage au o experiență interesantă și diversă, de la chimiști sinteticieni foarte pricepuți, la experți în chimia produselor naturale și până la cei care sunt la început de drum în chimie. Ceea ce am învățat de-a lungul carierei mele de peste 40 de ani în „arta” cromatografiei este că, pentru mulți dintre acești oameni de calitate, există o lipsă de înțelegere a principiilor cromatografice. Cred că această lipsă de înțelegere se datorează doar programei lor de studiu de bază, în care știința separării este folosită ca un instrument în timpul lucrărilor de laborator, dar principiile care stau la baza separării (sau ne-separării) componentelor unui amestec nu sunt, probabil, explicate, înțelese sau studiate în mod eficient.
Există patru tipuri de bază de cromatografie, inclusiv:
- Cromatografia gaz-lichid (GC)
- Cromatografia lichid-lichid (LLC)
- Cromatografia lichid-solid (LSC)
- Cromatografia de excludere a mărimii/Cromatografia de permeabilitate în gel (SEC/GPC)
Pentru această postare mă voi concentra pe cromatografia lichid-solid.
Cromatografia lichid-solid
Este cea mai populară dintre tehnicile menționate mai sus, deoarece este utilă pentru separarea compușilor semivolatili și nevolatili. Deoarece nu este necesară căldura pentru a elua compușii dintr-o coloană de separare (ca în cazul GC), cromatografia lichid-solid necesită utilizarea unui solvent sau a unui amestec de solvenți miscibili cu polaritate diferită pentru a obține separarea componentelor chimice ale probei una de cealaltă.
Cu LSC, proba este încărcată pe un suport solid sau pe o fază staționară. Componentele probei se leagă de faza staționară, dar în grade diferite. Cantitatea de interacțiune cu faza staționară controlează viteza și eficiența separării. Astfel, cu cât atracția față de faza staționară este mai mare, cu atât mai mult timp este nevoie de compuși pentru a se elua. Pentru a ajuta la eluția acelor compuși puternic legați, raportul de solvent trebuie să se modifice (creșterea puterii) în timp.
În cadrul domeniului LSC există mai multe tehnici cromatografice diferite…
- Cromatografie pe hârtie (PC)
- Cromatografie în strat subțire (TLC)
- Cromatografie în strat subțire (TLC)
- Cromatografie pe hârtie (PC)
- Cromatografie flash (FC)
- Cromatografie cu schimb de ioni (IX)
- Cromatografie de afinitate (AC)
- Cromatografie chirală (CC)
- Cromatografie cu fluid supercritic (SFC)
.performanță (HPLC)
În această postare mă voi concentra asupra cromatografiei flash, ale cărei principii sunt aceleași cu cele ale HPLC. Ambele utilizează coloane umplute cu o fază staționară în care se injectează proba și prin care se pompează solventul. Cu toate acestea, cromatografia flash folosește coloane mai mari decât HPLC, care este în principal o tehnică de separare analitică.
Cromatografia flash este o tehnică cromatografică preparativă ale cărei coloane sunt, de asemenea, umplute cu un suport sau mediu solid care are o dimensiune mai mare a particulelor decât coloanele HPLC. Aceste diferențe de mărime a suportului și a coloanei permit coloanelor flash să purifice mai mulți compuși pe gram de suport decât HPLC.
- Cromatografia flash utilizează particule de suport de 15 µm până la 60 µm
- HPLC utilizează particule de suport de 1,7 µm până la 10 µm
Ce se întâmplă în interiorul coloanei
Cromatografia flash și HPLC se realizează în cea mai mare parte folosind fie metodologia cu fază normală, fie cea cu fază inversă. Diferențele dintre aceste metodologii constau în chimia fazei staționare și în solvenții utilizați pentru a separa componentele chimice individuale ale unui amestec.
- Faza normală utilizează solvenți nepolari și moderați (de ex. hexan și acetat de etil) pentru faza mobilă și un mediu polar (de ex.ex. silice) ca fază staționară
- Faza inversă este exact opusul, folosind solvenți polari și o fază staționară nepolară
Căci aceste metodologii sunt opuse „polar” una față de cealaltă (joc de cuvinte), ordinea de eluție pentru majoritatea compușilor este inversată. Aici are loc chimia din spatele separărilor cromatografice.
Să ne concentrăm deocamdată asupra cromatografiei în fază normală.
Cromatografia în fază normală
Cu cromatografia în fază normală, compușii chimici care compun un amestec (de exemplu, amestec de reacție, extract de produs natural etc.) sunt dizolvați într-un solvent adecvat și injectați în coloană. Când amestecul intră în contact cu faza staționară polară, să spunem silice, compușii amestecului și solventul de dizolvare a acestora concurează cu faza mobilă pentru situsurile de legare ale silicei. Cu cât substanța chimică este mai polară, cu atât este mai puternic atrasă de silice. Această atracție se numește adsorbție (diferită de absorbție).
Absorbția este ceea ce se întâmplă atunci când un burete sau un prosop de hârtie interacționează cu un lichid. Adsorbția este o combinație de interacțiuni fizice și chimice în care suprafața polară a siliciului leagă chimic componentele chimice cu care intră în contact, în principal datorită unor fenomene cunoscute sub numele de legături de hidrogen și forțe van der Walls.
Când orice substanță chimică interacționează cu siliciul uscat (așa cum se utilizează cu o nouă coloană flash), are loc adsorbția. Această interacțiune eliberează căldură, care poate cauza probleme cu stabilitatea compușilor și cu rezultatele cromatografice. Din acest motiv, coloanele de silice sunt de obicei echilibrate (preumectate) cu un solvent cu polaritate scăzută înainte de introducerea probei. Solvenții cu polaritate scăzută (de exemplu, hexan, heptan, ciclohexan) sunt solvenți slabi și nu sunt bine adsorbiți de silice sau de alte medii polare.
Chimia de suprafață a silicei este un amestec de grupe hidroxil (silanoli) și eteri sililici, Figura 1. Aceste grupări funcționale sunt polare, considerate a fi încărcate negativ și adsorb compuși cu deficit de electroni. Pi-cuvelele compușilor aromatici pot face legături de hidrogen cu grupele hidroxil ale siliciului în timpul adsorbției.1
Figura 1. Chimia silicei cromatografice cuprinde un amestec de silanoli și funcționalități silil eterice. Aceste fracțiuni se leagă de substanțele chimice prin legături de hidrogen/adsorbție.
Pentru a asigura o bună legare a componentelor probei (adsorbție), proba care urmează să fie purificată trebuie fie dizolvată și încărcată în coloană într-un solvent slab (încărcare lichidă), fie, dizolvată cu un solvent mai puternic (polar), amestecată cu un mediu inert (de exemplu, silice, pământ de diatomee), uscată și ambalată într-o coloană diferită plasată în linie cu coloana de purificare (încărcare uscată). Încărcarea uscată elimină multe probleme întâlnite atunci când se utilizează o încărcare lichidă, în special cu o probă dizolvată într-un solvent polar.
După încărcarea probei, se introduc solvenții fazei mobile. Cu toate acestea, pentru a realiza o separare, componentele probei trebuie să se desorb din faza staționară la viteze diferite. Deși acest lucru este realizabil folosind un solvent cu polaritate constantă (eluție izocratică), o purificare mai bună se realizează de obicei folosind o fază mobilă care începe cu o polaritate scăzută și își crește polaritatea în timp. Acest lucru este cunoscut sub numele de eluție în gradient.
Cu un gradient, acei compuși cu o solubilitate mai mare în solventul cu polaritate scăzută (compuși cu polaritate mai mică) se desorbesc primii și trec prin coloană. Pe măsură ce polaritatea solventului din faza mobilă crește, compușii adsorbiți se desorb de pe suport la viteze diferite în funcție de solubilitatea lor în faza mobilă din ce în ce mai polară, figura 2.
Figura 2. Sus – În cazul eluției izocratice (polaritate constantă a fazei mobile), compușii se desorb mai lent decât atunci când se utilizează un gradient (jos). Eluția în gradient oferă, de obicei, o separare/purificare mai bună, decât eluția izocratică.
O caracteristică interesantă a cromatografiei în fază normală este că, odată ce un compus se desorbează din mediu, acesta nu se mai adsorbe niciodată, deoarece faza mobilă din ce în ce mai polară se adsorbe preferențial în locul său.
Diferențele de polaritate (putere de legare) între compuși pot fi atât de subtile ca adăugarea unei grupări funcționale diferite, diferențe de localizare a grupării funcționale (Parida, 2006) ca pe un inel aromatic, sau atât de distincte ca și compuși cu structuri total diferite, Figura 3.
Figura 3. Separarea compușilor cu polarități diferite pe baza tipului de grup funcțional și a localizării pe moleculă. În ordinea eluției – naftalină (fără funcționalitate polară), 1-nitronaftalină, o-nitroanilină, m-nitroanilină, p-nitroanilină. Nitroanilinele diferă doar prin localizarea grupării funcționale nitro în raport cu amina.
Deci, pentru a rezuma, separările prin cromatografie în fază normală se bazează pe diferențele de polaritate a compușilor (atât evidente, cât și subtile), pe atracția lor față de faza staționară și pe solubilitatea lor în faza mobilă. Pentru a obține cele mai bune rezultate de purificare se recomandă explorarea solvenților cu ajutorul TLC.
Doriți să aflați mai multe despre cromatografia flash, descărcați cartea noastră albă – Successful Flash Chromatography.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
