Efectul dietelor acoperite cu Bacillus megaterium asupra creșterii, activității enzimelor digestive și diversității microbiene intestinale a crapului oglindă Songpu Cyprinus specularis Songpu

Abstract

Studiul de față a fost efectuat pentru a evalua efectul unei diete acoperite cu Bacillus megaterium asupra performanței de creștere, enzimele digestive și diversitatea microbiană intestinală la crapul oglindă Songpu (Cyprinus specularis Songpu). Peștii au fost hrăniți manual cu două diete (o dietă de control și o dietă acoperită cu B. megaterium) de trei ori pe zi, până la sațietate aparentă, timp de 56 de zile. În comparație cu grupul de control, suplimentarea cu dieta acoperită cu B. megaterium a îmbunătățit creșterea peștilor și a redus semnificativ indicele de conversie a hranei (). Activitățile amilazei și lipazei din foregut în grupul de tratament au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul de control (). Activitățile proteazelor din intestinul anterior, mijlociu și posterior din grupul de tratament au fost toate mai mari decât cele din grupul de control (). Rezultatele secvențierii genelor ADNr 16S ale microbiotei prin secvențiere de mare capacitate au arătat că diversitatea și abundența microflorei intestinale au crescut odată cu creșterea crapului oglindă Songpu. Crapul oglindă Songpu hrănit cu o dietă acoperită cu B. megaterium a prezentat proporții crescute de Bacillus și Lactococcus intestinal la nivel de gen, ambele fiind semnificativ mai mari decât cele ale grupului de control (). Prin urmare, aceste rezultate sugerează că aplicarea de B. megaterium în dietă poate îmbunătăți creșterea și activitatea enzimatică digestivă a crapului oglindă Songpu și poate îmbogăți compoziția genurilor benefice ale microflorei sale intestinale principale.

1. Introducere

Peștele, ca una dintre principalele surse dietetice de proteine animale, joacă un rol foarte important în structura alimentației umane. Cu toate acestea, în ultimii ani, siguranța produselor acvatice a devenit unul dintre cei mai mari factori care împiedică dezvoltarea produselor acvatice din cauza preocupărilor legate de siguranța hormonilor, antibioticelor și a microorganismelor în exces . Odată cu dezvoltarea rapidă a creșterii intensive de mare densitate, mediul acvatic din acvacultură se deteriorează zilnic, ceea ce duce la apariția unor focare de boli și chiar la moartea în masă a animalelor de crescătorie. Există o nevoie urgentă de a găsi alternative ecologice și sigure pentru a asigura o creștere sănătoasă a animalelor de fermă .

Ca un nou aditiv pentru hrana animalelor după era antibioticelor, probioticele sunt considerate a fi înlocuitori importanți pentru antibioticele din hrana animalelor . Studiile au arătat că utilizarea probioticelor nu numai că poate promova creșterea animalelor acvatice și poate îmbunătăți rata de supraviețuire a acestora, dar poate reduce și incidența bolilor animalelor acvatice . Bacillus este o bacterie saprofitică gram-pozitivă care se găsește în mod obișnuit în mediul de creștere . Cercetarea și aplicarea bacililor în domeniul acvaculturii au atras multă atenție. Prima aplicare a probioticelor în acvacultură a fost realizată prin echilibrarea populației bacteriene din apă și a obținut rezultate bune . Unele studii au arătat că adăugarea de Bacillus subtilis în hrana pentru animale nu numai că poate promova creșterea animalelor acvatice și poate îmbunătăți activitățile enzimelor lor digestive și imunitatea lor nespecifică, dar poate îmbunătăți și structura microflorei lor intestinale . La mijlocul secolului al XX-lea, savanții chinezi au început să studieze Bacillus megaterium, concentrându-se în principal pe depistarea tulpinilor, în special pe capacitatea lor de a descompune materia organică, pe metabolismul lor de azot și pe aplicarea lor ca probiotice în tratarea apelor reziduale din acvacultură .

Carmul comun (Cyprinus carpio) este cea mai extinsă specie de pește de apă dulce cultivată în China, iar producția de crap comun a fost de 2.962.218 t în 2018 . Crapul oglindă Songpu (Cyprinus specularis Songpu), o varietate de crap comun, reprezintă o proporție din ce în ce mai mare din producție datorită creșterii sale relativ mai rapide, a rezistenței mai bune la boli, a ratei mai mari de conversie a cărnii și a absenței aproape totale a solzilor pe suprafața corpului . Cu toate acestea, odată cu expansiunea și promovarea creșterii de mare densitate, creșterea frecvenței de hrănire și poluarea apei, problemele legate de siguranța și calitatea alimentelor au devenit din ce în ce mai serioase.

Nutrienții se numără printre cei mai importanți și mai ușor de reglementat factori care afectează rezistența animalelor acvatice. Microbiologia alimentară include microorganismele care au atât efecte benefice, cât și efecte dăunătoare asupra calității și siguranței alimentelor și, prin urmare, pot fi de interes pentru sănătatea publică. În acest studiu, ne-am propus să evaluăm efectul dietelor acoperite cu B. megaterium asupra creșterii, activității enzimelor digestive și diversității microbiene intestinale la crapul oglindă Songpu și să furnizăm o bază teoretică pentru practica pisciculturii sănătoase și ecologice.

2. Materiale și metode

2.1. Prepararea dietei

B. megaterium a fost preparat în laboratorul nostru . Conținutul de B. megaterium a fost . Hrana comercială a fost achiziționată de la Zhejiang AIPHA Feed Co., Ltd., China. Valorile garantate ale analizei compoziției produselor furajere sunt prezentate în tabelul 1. Bulionul de fermentație de B. megaterium a fost pulverizat în mod uniform pe suprafața materialului comercial la o rată de 100 ml/kg, iar apoi, furajul pulverizat a fost plasat într-un loc răcoros timp de 1 oră, după care a fost utilizat ca furaj pentru grupul experimental. Grupul de control a fost hrănit cu hrana comercială nealterată.

2,2. Experimentul de hrănire

Cărpii oglindă Songpu (Cyprinus specularis Songpu) (greutate corporală ) au fost obținuți de la Stațiunea experimentală Hulan a Institutului de cercetare în domeniul pescuitului pe râul Heilongjiang din provincia Heilongjiang, China (45,97°N, 126,63°E). Peștii au fost aclimatizați la condițiile de laborator timp de 14 zile și au fost adaptați la hrana experimentală de control înainte de experiment. Apoi, au fost selectați 90 de crapi oglindă Songpu sănătoși și distribuiți aleatoriu în două grupuri (grupul de control și grupul experimental). Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare, iar fiecare replică a avut 15 pești. Grupul de control a fost hrănit cu furaje comerciale. Grupul de tratament a fost hrănit cu furaje comerciale acoperite cu B. megaterium. Cantitatea zilnică de hrană a fost de 3% din greutatea corporală a crapului oglindă Songpu, de trei ori pe zi, la orele 08:00, 12:00 și 19:00. Întreaga perioadă experimentală a fost de 56 de zile. În timpul perioadei experimentale, apa de laborator a fost înlocuită cu 1/3 din volumul de apă pe săptămână. Calitatea apei a fost măsurată (cu ajutorul YSI professional plus, Ohio State, SUA) zilnic în timpul perioadei experimentale, temperatura apei a fost cuprinsă între 18 și 25°C, iar un compresor de aer a fost utilizat pentru a adăuga oxigen 24 de ore pe zi. Peștii au fost cântăriți atât la începutul, cât și la sfârșitul procesului de hrănire.

2.3. Colectarea eșantioanelor

Înainte de experimentul de hrănire, zece pești au fost luați la întâmplare din acvariul temporar de cultură, iar greutatea inițială a corpului lor a fost măsurată. Apoi, a fost colectat tractul intestinal pentru măsurarea microflorei intestinale inițiale (grupul inițial). La sfârșitul experimentului de hrănire de 56 de zile, la aproximativ 24 de ore după ultima hrănire, toți peștii au fost anesteziați cu MS-222 diluat în apă la o concentrație de 75 mg/l. Acești pești au fost numărați și cântăriți pentru a determina rata de creștere în greutate (WGR), rata specifică de creștere (SGR) și rata de conversie a hranei (FCR, tabelul 2) .

După obținerea greutății finale a tuturor peștilor, cinci pești din fiecare acvariu au fost selectați la întâmplare și plasați într-o placă de gheață pentru disecție rapidă. Probele de țesut, inclusiv intestinul anterior, intestinul mijlociu și intestinul posterior, au fost colectate cu o foarfecă aseptică, spălate cu soluție salină fiziologică aseptică, cântărite și apoi pregătite într-un omogenat cu soluție salină fiziologică aseptică (1 : 4). Toate probele au fost depozitate imediat la -80°C într-un congelator pentru determinarea enzimelor digestive. Alți cinci pești au fost, de asemenea, eșantionați aleatoriu din fiecare acvariu. Suprafețele peștilor au fost dezinfectate cu alcool de 75% înainte ca peștii să fie duși într-o cameră biocurățată. După o dezinfecție suplimentară, cavitatea abdominală a fost deschisă, exteriorul intestinului a fost șters cu alcool de 75% și spălat de patru ori cu apă sterilă, iar apoi tractul intestinal a fost colectat pentru evaluarea microflorei intestinale finale.

2.4. Determinarea enzimelor digestive

Înainte de măsurarea indicilor de imunitate, intestinul anterior, intestinul mijlociu și intestinul posterior reunite au fost omogenizate manual într-un omogenizator de sticlă cu 0,86% NaCl (/) pentru a obține un omogenat de 10%. După centrifugare (4000 rpm, 10 minute) la 4°C, s-a obținut supernatantul, format în principal din lichid enzimatic brut. Activitățile amilazei, proteazei și lipazei din intestinul anterior, din intestinul mijlociu și din intestinul posterior au fost analizate spectrofotometric cu ajutorul unor kituri de reactivi de diagnosticare (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China).

2.5. Amplificarea genei 16S rRNA și secvențierea Illumina

DNA microbian a fost extras din probele intestinale cu ajutorul kitului E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, SUA) în conformitate cu protocoalele producătorului. Concentrația finală de ADN și purificarea au fost determinate cu un spectrofotometru NanoDrop 2000 UV-vis (Thermo Scientific, Wilmington, SUA), iar calitatea ADN-ului a fost determinată prin electroforeză pe gel de agaroză 1%. Regiunile hipervariabile V4-V5 ale genelor bacteriene de ARNr 16S au fost amplificate cu amorsele 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGCGG-3) și 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) cu ajutorul unui sistem PCR cu termociclator (GeneAmp 9700, ABI, SUA). PCR-urile au fost efectuate cu ajutorul următorului program: 3 minute de denaturare la 95°C, 27 de cicluri de 30 de secunde la 95°C, 30 de secunde pentru recoacere la 55°C și 45 de secunde pentru alungire la 72°C, precum și o extensie finală la 72°C timp de 10 minute. Produsele PCR rezultate au fost extrase de pe un gel de agaroză 2% și purificate ulterior cu ajutorul unui kit de extracție pe gel de ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, CA, SUA) și cuantificate cu QuantiFluor™-ST (Promega, SUA) în conformitate cu protocolul producătorului. Ampliconii purificați au fost grupați în cantități echimolare și secvențializați prin împerechere () pe o platformă Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, SUA) în conformitate cu protocoalele standard de către Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) .

2.6. Analiză statistică

Unitățile taxonomice operaționale (OTU) au fost grupate cu un cutoff de similaritate de 97% folosind UPARSE (versiunea 7.1, http://drive5.com/uparse/) cu un nou algoritm „greedy” care realizează simultan filtrarea chimeră și gruparea OTU. Taxonomia fiecărei secvențe a genei 16S ARNr a fost analizată cu ajutorul algoritmului RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) față de baza de date SILVA 16S ARNr folosind un prag de încredere de 70%. Indicii estimatori Chao și ACE au fost selectați pentru a identifica bogăția comunității, iar indicii Shannon și Simpson au fost utilizați pentru a identifica diversitatea comunității . Toți acești indici din probele noastre au fost calculați cu QIIME (versiunea 1.7.0) și pregătiți pentru afișare cu software-ul R (versiunea 2.15.3). Analizele statistice au fost efectuate cu pachetul software statistic SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, SUA). Datele sunt exprimate ca fiind cele din trei repetiții. Datele au fost supuse ANOVA într-o singură direcție, iar atunci când s-au constatat diferențe, mediile au fost clasificate cu ajutorul testului de comparație multiplă al lui Duncan. Diferențele au fost considerate semnificative la .

3. Rezultate

3.1. Efectul dietei acoperite cu B. megaterium asupra creșterii peștilor

După cum se arată în tabelul 2, rata de creștere în greutate și rata de creștere specifică a grupului de tratament (71,03%, 0,42% zi-1) au crescut semnificativ în comparație cu cele ale grupului de control (52,75%, 0,33% zi-1, ), iar raportul de conversie a hranei din grupul de tratament (1,28) a fost semnificativ mai mic decât cel al grupului de control (2,23, ). Nu a fost observată nicio mortalitate pe parcursul celor 56 de zile ale studiului de hrănire.

3.2. Efectul dietei cu strat de B. megaterium asupra activității enzimelor digestive

Efectele dietei cu strat de B. megaterium asupra activității enzimelor digestive sunt prezentate în tabelul 3. Activitatea amilazei din foregut în grupul de tratament a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de control (). Activitățile amilazei din intestinul mijlociu și din intestinul posterior în grupul de tratament au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul de control, dar nu au existat diferențe semnificative (). Activitățile proteazei din foregut, midgut și hindgut din grupul de tratament au fost mai mari decât cele din grupul de control, dar nu au existat diferențe semnificative (). Activitatea lipazei din intestinul anterior din grupul de tratament a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de control (). Activitățile de lipază ale intestinului mijlociu și ale intestinului posterior din grupul de tratament au fost practic aceleași cu cele din grupul de control și nu au existat diferențe semnificative ().

3.3. Efectul dietei acoperite cu B. megaterium asupra diversității și bogăției microbiene intestinale

Diversitatea microbiană intestinală a crapului oglindă Songpu a fost determinată prin secvențiere de mare capacitate. Numărul mediu de OTU-uri detectate din eșantionul inițial de grup a fost de 63. După 56 de zile, numărul mediu de OTU-uri detectate în grupurile de control și de tratament a fost de 114 și, respectiv, 196. Indicele de acoperire a tuturor probelor a fost de peste 0,97, ceea ce indică faptul că a existat o rată de detecție ridicată. După cum se arată în tabelul 4, indicii Chao și ACE, care reflectă bogăția microflorei intestinale a crapului oglindă Songpu, au fost semnificativ mai mari în grupul de tratament după 56 de zile decât în grupurile de control și inițial (). Indicele Shannon al diversității comunității intestinale în grupul de tratament a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul de control (). Indicele Simpson al diversității comunității intestinale în grupul de tratament a fost semnificativ mai mic decât cel din grupul de control (). Nu au existat diferențe semnificative pentru cei patru indici de mai sus între grupul de control și grupul inițial ().

3.4. Efectul dietei acoperite cu B. megaterium asupra compoziției și modificărilor microbiotei principale din intestinul crapului oglindă Songpu

O bogăție microbiană intestinală mai mare de 1% la nivel de phylum a fost considerată ca fiind microflora principală pentru statisticile prezentate în figura 1. Phylum-ul dominant în intestinul grupului inițial a fost predominant Fusobacteria (86,36%) și Bacteroidetes (8,60%) înainte de începerea experimentului. După testul de hrănire de 56 de zile, numărul microflorei intestinale principale a crescut în fiecare grup. În grupul de control, filamentele dominante au fost Fusobacteria (86,36%), Bacteroidetes (14,4%), Firmicutes (2,42%) și Proteobacteria (1,37%). În grupul de tratament, filamentele dominante au fost Firmicutes (69,15%), Proteobacteria (23,8%), Bacteroidetes (4,65%) și Actinobacteria (1,43%). O bogăție microbiană intestinală mai mare de 0,5% la nivel de gen a fost considerată ca fiind microflora principală pentru calculele statistice, prezentate în tabelul 5. Au existat doar 5 genuri de microorganisme intestinale principale în grupul inițial. După testul de hrănire de 56 de zile, principalele microorganisme intestinale au crescut la 11 genuri în grupul de tratament. Cel mai abundent microorganism din intestinul crapului oglindă Songpu din grupul inițial a fost Cetobacterium. După testul de hrănire de 56 de zile, cel mai abundent microorganism din grupul de control a fost tot Cetobacterium. În grupul de control, cele 11 genuri dominante au fost Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified și Yersinia. Crapul oglindă Songpu hrănit cu o dietă acoperită cu B. megaterium a prezentat proporții crescute de Bacillus și Lactococcus la nivel de gen, care au fost ambele semnificativ mai mari decât cele ale grupului de control ().

Figura 1

Compozițiile microbiene intestinale la nivel de phylum la crapul oglindă Songpu hrănit cu o dietă acoperită cu B. megaterium timp de 56 de zile.

4. Discuție

Probioticele, cum ar fi bacilii, au fost utilizate pe scară largă în acvacultură. Unele studii au arătat că adăugarea diferitelor tulpini de Bacillus spp. la hrana pentru larve a obținut rezultate bune și are un bun efect de promovare a creșterii larvelor de pește . Adăugarea de bacterii (tulpina CA2) ca supliment alimentar la culturile xenice de larve de stridii Crassostrea gigas a îmbunătățit în mod constant creșterea larvelor în diferite anotimpuri ale anului . Manipularea microbiotei cu ajutorul probioticelor a fost raportată ca o practică utilă în acvacultură pentru a controla sau inhiba bacteriile patogene și pentru a îmbunătăți performanțele de creștere și activitatea enzimelor digestive . În comparație cu grupul de control netratat, greutatea finală și creșterea în greutate au fost semnificativ mai mari la creveții hrăniți cu un amestec de două diete cu tulpini probiotice . În acest studiu, s-a constatat că o dietă acoperită cu B. megaterium a crescut rata de creștere în greutate și rata specifică de creștere și a redus raportul de conversie a hranei, ceea ce indică faptul că dietele acoperite cu B. megaterium pot promova creșterea crapului oglindă Songpu. Rezultate similare au fost găsite la peștele pisică Clarias sp., unde adăugarea de B. megaterium PTB 1.4 în hrana lor a îmbunătățit semnificativ rata de creștere. Rezultate similare au fost găsite și la Penaeus monodon, pentru care s-au obținut valori mai mari ale FCR și SGR după adăugarea de Bacillus cereus .

Bacteriile probiotice sunt capabile să producă enzime digestive care ajută peștii să utilizeze nutrienții din hrană și să le digere . Adăugarea de B. megaterium la mesele de proteine vegetale poate promova dezvoltarea morfologiei intestinale și crește activitatea enzimelor digestive . Studiul probioticelor pentru crapul comun Cyprinus carpio pe baza performanțelor de creștere și a activităților enzimatice digestive a arătat că activitățile enzimatice digestive medii ale tuturor grupurilor de tratament cu probiotice au fost semnificativ diferite de cele ale grupului de control. În studiul de față, o dietă acoperită cu B. megaterium a avut un efect pozitiv și important asupra activităților enzimatice digestive, în special cele ale amilazei și proteazei în intestinul anterior, în intestinul mijlociu și în intestinul posterior. Rezultate similare au fost, de asemenea, găsite la tilapia, care a prezentat o îmbunătățire a digestiei alimentelor și a creșterii după ce Bacillus NP5 a fost adăugat în hrana lor . Un nivel mai ridicat de activitate enzimatică obținut cu dietele care conțin probiotice a îmbunătățit digestia proteinelor, amidonului, grăsimilor și celulozei, ceea ce ar putea, la rândul său, să explice creșterea mai bună observată cu dietele suplimentate cu probiotice. Enzimele digestive ajută peștii să descompună și să digere substanțele nutritive din hrană, facilitând astfel absorbția de către pești a nutrienților din hrană .

Progresele în secvențierea de mare capacitate au permis un catalog extins de probe metagenomice, oferind o perspectivă asupra diversității speciilor microbiene dintr-o mare varietate de surse, inclusiv oceanul, solul și corpul uman. Aceste studii utilizează atât secvențierea genei 16S ARNr pentru a determina relațiile filogenetice, cât și secvențierea mai cuprinzătoare a shotgun pentru a prezice compoziția detaliată a speciilor și a genelor . Indicele de bogăție și indicele de diversitate sunt indici importanți pentru a detecta diversitatea și complexitatea microorganismelor din probe . În acest studiu, odată cu creșterea crapului oglindă Songpu, diversitatea și bogăția microbiană intestinală au crescut, iar indicii Chao și ACE, care reflectă bogăția microflorei intestinale a crapului oglindă Songpu, au fost semnificativ mai mari în grupul de tratament decât în grupul de control. În plus, indicele Shannon al diversității comunității intestinale din grupul de tratament a fost semnificativ mai mare decât cel din grupul de control. În mod similar, rezultatele au arătat, de asemenea, că structura microflorei intestinale a fost modificată în cazul în care puii de somn cu botul vânăt au fost hrăniți cu diete suplimentate cu diferite niveluri de Bacillus subtilis . Adăugarea probioticelor în hrana pentru animale poate modifica, de asemenea, numărul și structura microflorei originale din tractul intestinal al Litopenaeus vannamei și poate promova interacțiunile complexe dintre comunitățile microbiene din tractul intestinal al Litopenaeus vannamei .

În acest studiu, crapul oglindă Songpu hrănit cu o dietă acoperită cu B. megaterium a prezentat proporții crescute de Bacillus și Lactococcus intestinal la nivel de gen, care au fost ambele semnificativ mai mari decât cele din grupul de control. Rezultatele au indicat, de asemenea, că compoziția și proporțiile microbiotei principale din intestinul crapului oglindă Songpu pot fi modificate cu ajutorul dietelor acoperite cu B. megaterium. În concluzie, utilizarea dietelor acoperite cu B. megaterium poate spori în mod semnificativ creșterea peștilor și poate reduce raportul de conversie a hranei, poate îmbunătăți activitățile enzimelor digestive și poate îmbogăți compoziția genurilor benefice ale microflorei intestinale principale.

Date disponibile

Toate datele au fost furnizate în articol și nu mai există alte date care să fie încărcate.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu au conflicte de interese de dezvăluit.

Recunoștințe

Acest studiu a fost finanțat de către Central-Level Non-Profit Scientific Research Institutes Special Funds (nr. HSY202005M), Fundația de Științe Naturale a provinciei Heilongjiang (nr. QC2018038), Fondul de cercetare de bază al instituției științifice centrale de interes public, Academia Chineză de Științe ale Pescuitului (nr. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 și 2020TD56), Programul național cheie de R&D din China (nr. 2019YFD0900302), și Laboratorul cheie de biotehnologie și reproducere acvatică de apă dulce, Ministerul Agriculturii și Afacerilor Rurale, Institutul de cercetare în domeniul pescuitului din Heilongjiang, Academia chineză de științe piscicole (nr. FBB2017-04).

.