Metoda Delta-Delta Ct sau metoda Livak este cea mai preferată metodă pentru analiza datelor qPCR. Cu toate acestea, ea poate fi utilizată numai atunci când sunt îndeplinite anumite criterii. vă rugăm să consultați notele de curs pentru a vă asigura că aceste criterii sunt îndeplinite. În caz contrar, o metodă mai generalizată se numește metoda Pfaffl. Vă rugăm să citiți materialul de lectură suplimentar pentru a obține mai multe informații despre această metodă.
Iată pașii pentru metoda Livak:
Fileul Excel cu toate calculele se află în folderul qPCR analysis de pe Blackboard.
Aveți Ct brut (numărul de cicluri de care este nevoie pentru a atinge pragul) pentru celulele normale și tumorale (3 replici pentru fiecare).
Normalizare¶
În primul rând, va trebui să calculați diferența relativă între gena de interes (p53) și gena de menținere a casei (GAPDH).
∆Ct = Ct (gena de interes) – Ct (gena de menținere a casei)
Media probelor de control (celule normale)¶
Pentru că vom compara tumora noastră (tratament) cu cea de control (celule normale), mai întâi trebuie să calculăm media ∆Ct pentru cele 3 probe de control (normale).
Calculați ∆∆Ct în raport cu media lui ∆Ct normal celule¶
∆∆Ct = ∆Ct (proba tumorală) – ∆Ct (media normală)
Puteți face acest lucru și pentru probele normale. Folosiți semnele $ în fața numărului coloanei și a literei brute (săgeți) pentru a fixa celula.
Expresia genică multiplicată pentru fiecare probă¶
Asigurați-vă că ridicați ∆∆Ct negativ la puterea a doua.
Fold gene expression = 2^-(∆∆Ct)
Overall fold change¶
Puteți calcula fold change-ul mediu atât pentru probele tumorale, cât și pentru cele normale. Raportul dintre acestea două reprezintă fold change între probele tumorale și cele normale.
Transformare log¶
Pentru a efectua teste statistice parametrice, cum ar fi testul T, se recomandă transformarea rezultatelor finale ale expresiei genice în valori logaritmice (orice bază log). Acest lucru ar face ca distribuția datelor să fie simetrică.
Aici am transformat 2^-(∆∆Ct) în log 10.
T-test¶
Este necesar să fim atenți atunci când folosim teste parametrice dacă datele nu sunt distribuite normal, aceasta ar duce la concluzii eronate.
Selectați log 10 al valorilor 2^-(∆∆Ct) pentru eșantioanele normale și tumorale, după cum este indicat. Folosiți testul cu două cozi (numărul 2) și presupunând o varianță inegală (3).
Valoarea P rezultată este mai mică de 0,05 și, prin urmare, respingem ipoteza nulă, iar mediile celor două eșantioane sunt semnificativ diferite la nivelul 0,05.
.
