Bortom COX-1: Aspirins effekter på trombocyternas biologi och potentiella mekanismer för kemoprevention

Trombocyter spelar en kritisk roll för hemostas, trombos och upprätthållande av blodkärlens integritet. Otillräcklig reglering i trombocytaktiviteten kan leda till olämplig blödning, medan överdriven aktivitet leder till trombos och akuta ischemiska händelser. Koagulationsprocessen regleras av glykoproteiner och receptorer på membranytan som utlöser koagulationskaskaden efter bindning av exogena effektorer, t.ex. adenosindifosfat (ADP), tromboxan A2 (TXA2), serotonin, kollagen, trombin och adrenalin. Den grundläggande sekvensen i trombocytaggregationen sker i tre steg: initiering, utvidgning och stabilisering. I initieringsstadiet blir trombocyter bundna till exponerade von Willebrandfaktor (vWF)/kollagenkomplex och stannar kvar på platsen för kärlskada och reaktion tillräckligt länge för att utlösa ytterligare aktivering av kollagen. Förstärkning kännetecknas av en andra våg av sekretion och aggregering och förstärks ytterligare av trombocytmedierad frisättning av trombin, adenosindifosfat (ADP) och tromboxan A2 (TXA2). Den andra vågen markerar också förlängningsfasen där nytillkomna trombocyter fäster vid det ursprungliga trombocytmonolagret. Efter interaktion mellan proteinreceptor och effektor fortsätter aktiverade trombocyter att aggregera och bildar broar mellan ytglykoproteiner, fibrinogen, fibrin och vWF och aktiverade glykoproteiner. Denna stabiliseringsfas innefattar efterföljande signalhändelser i trombocytpluggbildningen som möjliggör konsolidering av trombocytaggregatet för att förhindra att det sprids av skjuvkrafter i det cirkulerande blodet.

Signalering vid trombocytaggregation börjar med aktivering av receptorerna på trombocytaggregatets yta med hjälp av agonister som kollagen, trombin, ADP, TXA2 och epinefrin. Aktivering av dessa GPCR-receptorer leder till aktivering av fosfolipas A2, som klyver fosfotidylkolin och andra membranfosfolipider och frigör arakidonat från C2-positionen i glycerolryggraden. Arakidonat kan omvandlas till en rad olika prostaglandiner (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α,) som förmedlar det proinflammatoriska svaret. Dessutom inducerar tromboxaner, t.ex. TXA2, frisättning, aggregering och koagulering av trombocyter, förutom att de förstärker den cirkulerande trombocytaktiveringen. Prostaglandinendoperoxidsyntas-1 (PGSH-1)/cyklooxygenas-1 (COX-1) utför de inledande cyklooxygenas- och peroxidasreaktionerna för att omvandla arakidonsyra till de föregående metaboliterna prostaglandin G2 och prostaglandin H2. Dessa bearbetas kemiskt för att generera andra prostaglandiner, inklusive TXA2, som förmedlar majoriteten av den trombocytavledda reaktionen. En sammanfattning av de signalhändelser som sker under trombocytaktivering visas i fig. 3.

Aspirin modulerar trombocytaktivitet och biologi – cyklooxygenashämning

Aspirin hämmar trombocytaggregation och prostaglandinfrisättning . Tidiga studier med aspirin radioaktivt märkt med 14C vid acetatkarbonylkolet visade att <0,1 % av 14C-radiomärkningen togs upp av trombocyter och att aktiviteten främst var förknippad med tre proteiner . Även om associeringen var irreversibel, vilket tyder på att det bildades en kovalent bindning, visade det sig att den endast var mättbar vid biologiskt relevanta koncentrationer för ett enda 85 kDa-protein. De andra två lösliga trombocytproteinerna uppvisade icke-mättbar acetylering, vilket tyder på att aspirinberoende acetylering i trombocyter är både specifik och ospecifik. Det acetylerade 85 kDa-enzymet visade sig senare vara prostaglandinendoperoxidsyntas-1 (PTGS-1/COX-1). Hämning av trombocytens COX-1 genom acetylöverföring är irreversibel och inhiberingen bibehålls under trombocytens 10-dagarsliv.

COX-1 är ett bifunktionellt enzym som uttrycks konstitutivt i de flesta vävnader och utför två olika och sekventiella reaktioner vid rumsligt åtskilda, men mekanistiskt kopplade aktiva platser. I normala celler är COX-1 membranbunden och inbäddad i den luminala ytan av det endoplasmatiska retikulumet samt de inre och yttre ytorna av kärnhöljet. Trombocyter är dock anukleära cellfragment och uttrycker i stället COX-1-proteiner i det täta tubulära membransystemet som uppstår från det demarkatiska membransystemet under trombocyternas biogenes. Detta täta tubulära membransystem spelar en viktig roll vid trombocytaktivering och är den viktigaste platsen för eikosanoidsyntesen i trombocyter . Den 85 kDa COX-1 homodimern innehåller 576 rester och är glykosylerad vid olika lysinsidokedjor. Även om COX-1 är ett av de få proteiner som har förknippats med aspirinhämning vid sin aktiva plats är det viktigt att notera att glykosylering av lysinrester förstärker acetylering av andra rester, och i detta fall serinet vid COX-1:s aktiva plats . Varje strukturell COX-1-underenhet innehåller tre vikningsdomäner: en epidermal tillväxtfaktordomän, en membranbindande domän och en katalytisk aktiv plats. Den katalytiska domänen innehåller en cyklooxygenasplats som utför dioxygeneringen av arakidonsyra för att bilda en hydroxylendoperoxid prostaglandin G2 (PGG2), medan den intilliggande aktiva peroxidasplatsen utför reduktionen av PGG2 till PGH2. Mittemot den membranaktiva domänen, inom den katalytiska domänen, finns den peroxidasaktiva platsen som har en hemkofaktor bunden till en ytlig klyfta. Hemsgruppen är nödvändig för aktiveringen av en tyrosylradikal i cyklooxygenasets aktiva plats för lipidperoxidation av arakidonsyra. Den aktiva platsen för cyklooxygenas ligger mittemot den hembindande peroxidasplatsen i toppen av en tunnel som utgår från den membranbindande domänen. Arakidonsyra binds på denna plats, vilket leder till att substratets karboxylat omplaceras för dioxygenering . Strukturstudier av COX-1 från får som behandlats med 2-bromoacetoxibensoesyra tyder på att bindningen av arakidonsyra till cyklooxygenasets ände av den aktiva platsen, och följaktligen den dubbla syresättningen av arakidonsyra, hämmas till följd av acetylering av serin 530 .

Ireversibel hämning av COX-1 genom acetylering av acetylering av serinet på den aktiva platsen med aspirin minskar prostaglandinbiosyntesen dramatiskt. I trombocyter kan COX-1 inte snabbt regenereras och följaktligen kan COX-1-aktiviteten endast återställas genom ny trombocytbiogenes. Syntesen av tromboxan A2, prostaglandin E2 och prostacyklin (PGI2) är de mest påverkade i aspirinbehandlade trombocyter vilket resulterar i en brist i koagulationsmekanismen , minskad sekretion av magslemhinnan, ökad irritation av magsyror , samt förändrad patofysiologisk koagulation och vasodilatation/konstriktion .

COX-2 är till 60 % identiskt med COX-1 på aminosyranivå och deras tredimensionella strukturer är nästan superimposerbara. COX-2 är inducerbar och dess uttryck förstärks av samma prostaglandiner som syntetiseras av COX-1 i trombocyter och epitelceller. COX-2 överuttrycks under megakaryocytopoeisis och har identifierats i tvärsnittsprover av benmärg från patienter med kronisk myeloisk leukemi och polycytemia vera . I en annan studie karakteriserades COX-2-uttrycksnivåerna i trombocyter i förhållande till COX-1, genom direkt mätning av mRNA-nivåer . Man fann att trombocyter uttrycker COX-2 på nivåer som är jämförbara med vissa maligna epitelceller, om än på betydligt lägre nivåer än COX-1 i trombocyter. Acetylering av COX-2 i endotel- och epitelceller hämmar biosyntesen av PGI2 och PGE2, som har olika effekter på processer i efterföljande led, t.ex. inflammation. Även om aspirinmedierad hämning av COX-1 och COX-2 resulterar i olika profiler av hämning av prostaglandinbiosyntesen, är grunden för hämning i båda fallen blockering av prostaglandinendoperoxidsyntesen och den därav följande minskningen av nivåerna av multifunktionellt prostaglandin H2. COX-3:s roll i samband med trombocyternas biologi är fortfarande okänd.

Den COX-hämmande aktiviteten hos aspirin är beroende av den administrerade dosen. Låga doser, de som sträcker sig från 75 till 300 mg, resulterar i selektiv hämning i trombocyternas TXA2-produktion utan att undertrycka prostacyklin (PGI2), en vanlig trombocytaggregationsantagonist och vasodilator. PGI2 förväntas huvudsakligen härröra från vaskulär COX-2 vilket tyder på att COX-2-hämningen är minimal i lågdosregimen. Ökade doser (>1200 mg) har analgetiska och antiinflammatoriska egenskaper, egenskaper som förknippas med den patofysiologiska hämmningen av COX-1 och COX-2. Det är viktigt att notera att COX-2 också kan utnyttja arakidonsyra för syntes av lipoxiner, särskilt 15-hydroxyeikosatetraensyra (15-HETE). Denna biosyntesväg förväntas förbli intakt även efter acetylering av COX-2 . Denna differentiella hämning av COX-aktiviteter kan delvis förklaras av den relativa hämmande effekten av aspirin. Även om aspirin vanligtvis betraktas som en ospecifik COX-hämmare är det mycket selektivt för COX-1 jämfört med COX-2. Som framgår av Blanco et al. är IC50 för aspirin för COX-1 cirka 3,5 μM medan IC50 för COX-2 är cirka 30 μM. Även om de båda enzymernas aspirinreaktiva platser är homologa, resulterar acetylering av Ser-516 i COX-2 endast i en partiell hämning av den katalytiska aktiviteten . Med tanke på den serumkoncentration som kan uppnås vid låga doser (~7 μM) är det osannolikt att COX-2 är acetylerad till mer än 5 %, medan trombocytavledd COX-1 sannolikt är acetylerad till >70 % . Detta tyder på att regelbunden lågdosaspirin alltid kommer att upprätthålla COX-1-hämning i cirkulerande trombocyter, med minimal effekt på inhiberingen av perifert COX-2. En sammanfattning av effekterna av låg- och högdosaspirin på COX-aktiviteten i blod och vävnad visas i tabell 1.

Aspirinberoende acetylering av proteiner som interagerar med trombocyter i blodet

Trombocyter uttrycker en mängd olika ytreceptorer som gör att de kan interagera med plasma- och blodproteiner, patogener, patogenrelaterade produkter och det inflammerade endotelet. Ytreceptorer är avgörande för trombocyternas vidhäftning till den skadade vaskulaturen, bildandet av den koagulerande trombus och aktivering via ett antal metaboliska effektorer. Interaktionen mellan trombocyter och andra blodproteiner i den systemiska cirkulationen är avgörande för genomförandet och upplösningen av koagulationsreaktionen. Intressant nog modifieras många av dessa proteiner också av aspirin.

Fibrinogen

Farr och medarbetare identifierade 1968 fibrinogen som ett mål för acetylering av aspirin. Fibrinogen finns som ett lösligt protein i plasma samt som ett intracellulärt membranassocierat protein i trombocyter . Fibrinogen utgör 3-10 % av det totala trombocytproteinet (varav nära 25 % finns i α-granuler ) och frigörs vid trombocytaktivering. Fibrinogen har rapporterats acetyleras in vitro och in vivo av aspirin för att bilda ε-N-acetyllysinderivat med i genomsnitt tre rester av fibrinogen som genomgår modifiering. Acetylerat fibrinogen ökar fibrinpropparnas känslighet för lysis.

Albumin

Albuminmodifiering genom acetylering av aspirin har varit känd i över ett halvt sekel . Ett antal studier från Farr och medarbetare har bedömt de möjliga konformationseffekter som utlöses av acetylgruppens tillsats till albumin . Den mest diskuterade modifieringen av serumalbumin i litteraturen fokuserar på acetylering av lysinrester . Humant serumalbumin har också observerats påverka mekanismerna för blodplättarkoagulation genom att påverka kalciumregleringen .

Hemoglobin

Den kanske viktigaste komponenten i blod- och plasma-miljön, hemoglobin, genomgår acetylering av acetylering beroende på aspirin in vitro, och det antas genomgå liknande modifieringar vid höga aspirindoser in vivo . Studier av hemoglobinacetylering av aspirin visade på minskad proteinglykering, och i närvaro av höga glukoskoncentrationer ökar hemoglobinacetyleringen av aspirin , en effekt som också har observerats i serumalbumin. Aspirin kan acetyla en mängd lysinrester i α- och β-kedjorna hos hemoglobin, utan att ha någon effekt på dess strukturella konformation eller syrebindnings- och transportfunktioner . Hemoglobin kan utlösa trombocytaggregation via interaktioner med GP1βα, ett av de många receptorproteinerna på trombocyternas yta. Relativt låga koncentrationer av hemoglobin kan också framkalla trombocytaggregation, även om effekten av acetylering av hemoglobin med aspirin på interaktionen mellan hemoglobin och trombocyter fortfarande är okänd .

Effekt av aspirin på trombocytaggregationen: implikationer för cancer

Cyklooxygenashämning och den samtidiga minskningen av tromboxanbiosyntesen resulterar i minskad trombocytaggregation, uttryck av P-selektin och försvagad koagulationsfunktion. Förutom sin roll i moduleringen av trombocytaggregationen har aspirin också visat sig förändra profilen av uttryckta och utsöndrade proteiner i trombocyter. Många av dessa proteiner är involverade i att förmedla koaguleringssvaret och rekrytera immunceller till skadeplatsen. Många proteiner som finns i trombocyternas ”releasat” kan dock också spela en viktig roll för att främja angiogenes och tumörtillväxt.

Aspirin har visat sig hämma frisättningen av interleukin 7 (IL-7) av trombocyter som stimulerats med trombinreceptor-aktiverande peptid (SFLLRN). Friska patienter som tar aspirin uppvisade också signifikant lägre plasma IL-7 . Denna proinflammatoriska cytokin har visat sig spela en nyckelroll i både B- och T-cellernas mognad . IL-7 har också visat sig ha både pro- och antitumoreffekter, där den senare främst beror på hämning av apoptos genom reglering av BCL2 . Trombocyter är också en källa till pro-angiogena faktorer, däribland VEGF och angiopoetin-1, och det finns vissa belägg för att regelbunden användning av aspirin minskar plasmakoncentrationen av båda faktorerna, även om det är oklart om detta enbart beror på trombocyternas frisättning . Detta stöds av en klinisk studie där aspirinbehandling verkade gynna en övergripande antiangiogen balans hos kvinnor med bröstcancer som fick tamoxifen, vilket bedömdes genom minskade plasma VEGF-nivåer och trombinreceptormedierad frisättning av TSP-1 och VEGF från trombocyter .

Coppinger m.fl. genomförde en masspektrometri-baserad proteomstudie för att ytterligare utforska sammansättningen av trombocyternas frisättning som en funktion av aspirinbehandling . I denna studie resulterade behandling av mänskliga trombocyter med låg dos aspirin (20 μM) efter stimulering med kollagen, SFLLRN eller ADP i en bred minskning av mängden protein i releasatet, även om omfattningen av denna minskning var beroende av den agonist som användes. Aspirinbehandling visade sig också resultera i minskade nivåer av tillväxtreglerande tillväxtfaktor (GRO), trombocytavledd tillväxtfaktor (PDGF), angiogenin, RANTES och oncostatin M (OSM) i trombocyternas releasat, särskilt efter stimulering med kollagen. Även om dessa och andra trombocytakiner som härrör från trombocyter (t.ex, CXCL4 och CTGF ), är kritiska för att reglera kärlreparation, spelar de också en roll för att driva tumörgenes, angiogenes och metastasering.

Definiering av acetylome av aspirin

Som nämnts ovan är aspirin känt för att acetyla ett stort antal intracellulära och extracellulära proteinmål, särskilt vid sidokedjans och N-terminala aminogrupper. Tyvärr har det inte gjorts några omfattande proteomiska studier som specifikt tar upp frågan om vilka trombocytproteiner, förutom COX-enzymerna, som acetyleras av aspirin eller vilken biologisk roll dessa icke-kanoniska acetyleringar spelar. I det här avsnittet kommer vi att överväga tidigare proteomiska studier för att identifiera icke-kanoniska mål för acetylering med hjälp av aspirin och försöka relatera dem till det aktuella läget inom trombocytproteomiken.

Det har gjorts ett stort antal proteomiska studier som har försökt definiera uppsättningen av proteiner som acetyleras av fysiologiska koncentrationer av aspirin i olika cellinjer. Bhat och medarbetare identifierade 33 cellulära proteiner som acetyleras av aspirin efter anrikning med en antikropp mot acetyllysin . Efterföljande analys med masspektrometri identifierade förekomsten av acetylerade cytoskeletala och metaboliska enzymer, inklusive glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD), laktatdehydrogenas, enolas, pyruvatkinas och transketolas, även om endast G6PD inhiberades signifikant av aspirinmedierad acetylering in vitro. Detta tyder på att aspirin kan blockera flödet genom pentosfosfatvägen även om ytterligare studier är nödvändiga för att bekräfta detta. Denna grupp visade också att aspirin acetylerar p53, vilket resulterar i ökad DNA-bindning, uttryck av p21Cip och ökad apoptotisk celldöd i närvaro av camptothecin . Även om dessa effekter har påvisats i flera tumörcellinjer, tyder avsaknaden av p53 i trombocytproteomet samt avsaknaden av ett funktionellt genom i trombocyter på att acetylering av p53 kommer att ha minimal inverkan på trombocyternas biologi.

Nyligen gjorda framsteg inom proteomik med hög genomströmning i kombination med aktivitetsbaserade prober har lett till identifiering av hundratals förmodade acetyleringar som förmedlas av aspirin. I ett tillvägagångssätt ersattes acetylgruppen i aspirin med pentynonsyra för att generera ett alkaninnehållande aspirinderivat (AspAlk) . Till skillnad från aspirin resulterar acetylöverföring genom AspAlk i inkorporering av en azidreaktiv alkan på platser som normalt acetyleras av aspirin. Efter inkubering av AspAlk med levande kolorektala HCT-15-celler märktes proteiner som acetylerades av AspAlk med biotin via kopparkatalyserad azidalkynecykloaddition (CuAAC) och isolerades genom streptavidin pulldown. Efter analys med LC-MS kunde författarna identifiera 120 proteiner med signifikant anrikning av AspAlk-acetylering i förhållande till DMSO-kontroller. De mest berikade klasserna av proteiner i den här studien var de som är involverade i proteinsyntesen och proteinveckningen, cytoskeletala proteiner och metaboliska enzymer. Histonacetylering observerades också och bekräftades biokemiskt. Detta arbete utökades i ett nyligen publicerat manuskript av Shen, Lin och medarbetare som använde en syra-labil biotinazid för att underlätta återfångst av AspAlk-modifierade proteiner efter biotinkonjugering och streptavidin pulldown . Denna strategi resulterade i identifiering av över 500 acetylerade proteiner. En analys av mållistan visade på en betydande acetylering inom mTOR-systemet, som kontrollerar många viktiga cellfunktioner, inklusive proteinsyntes och autofagi. Författarna validerade de första proteomiska observationerna genom att visa att aspirinbehandling av både HCT116-kolorektalceller och embryonala fibroblaster från möss minskade de novo-proteinsyntesen och inducerade autofagi. Induktionen av autofagi av aspirin är av särskilt intresse mot bakgrund av en nyligen genomförd studie som visar att autofagi är viktigt för normal trombocytfunktion och uppregleras under trombocytstimulering . Dessutom är ett fungerande autofagiskt maskineri nödvändigt för trombocyternas antikoagulerande aktivitet, vilket visats i musmodeller där trombocyternas Atg7 är utslaget. Även om det funktionella sambandet mellan acetylering med hjälp av aspirin och induktion av trombocyternas autofagi förblir oklart, kan hämning av pentosfosfatvägen (PPP) genom G6PD-blockad eller störning av mitokondriell andning genom acetylering av malatdehydrogenas och/eller isocitratdehydrogenas öka den intracellulära oxidativa belastningen, vilket är en känd utlösande faktor för autofagi . Alternativt finns det gott om bevis för aspirinmedierad acetylering av chaperoner, särskilt värmeschockproteiner och peptidylprolylisomeraser, vilket kan försämra den korrekta proteinveckningen och utlösa autofagiskt avlägsnande av felaktigt veckade proteiner.

En annan nyligen genomförd proteomisk studie av Tatham och medarbetare använde 3H-märkt aspirin för att med hjälp av masspektrometri identifiera platser för aspirinmedierad acetylering i HeLa-celler . I detta tillvägagångssätt resulterar användningen av tritierat aspirin i en massförskjutning på +3 Da i förhållande till normal acetat och möjliggör en mer exakt diskriminering av aspirinmedierad acetylering jämfört med endogen acetylering. Denna metod avslöjade över 12 000 aspirinmedierade acetyleringar i över 3 700 unika proteiner. Intressant nog visade sig många av de proteiner som acetylerades av aspirin också vara acetylerade i avsaknad av aspirin, vilket tyder på att aspirin ”förstärker” befintliga acetyleringsställen för proteiner. Författarna till denna studie fann också att i de flesta fall acetylerades <1 % av de totala platser som var tillgängliga för acetylering på ett visst protein av aspirin, vilket innebär att stökiometrin för ospecifik acetylering med hjälp av aspirin kan vara otillräcklig för att ge betydande biologiska effekter utan farmakologisk blockering av endogena deacetylasaktiviteter.

Denna studie visade också en betydande acetylering av histonproteiner där majoriteten av den aspirinmedierade acetyleringen skedde i histonkärnan snarare än i de N-terminala svansarna. Histonacetylering har observerats i flera proteomiska studier och är något föga förvånande med tanke på den höga andelen nukleofila lysinrester i histoner som spelar en viktig roll för elektrostatisk DNA-bindning. Histonacetylering spelar en avgörande roll för DNA-bindning och är en välkänd epigenetisk mekanism för reglering av genuttryck . Även om trombocyter är anukleära har tidigare transkriptomiska studier identifierat histonspecifika transkript i trombocyter, särskilt H2A, H2B, H3 och H4 . Även om histonacetylering av aspirin har påvisats på ett övertygande sätt är det viktigt att notera att histonexpression inte har bekräftats i trombocyter. I stället har det postulerats att förekomsten av histontranskripter i trombocyter är en artefakt av avvikande cellcykler i megakaryocyter som ger upphov till trombocyter . Ännu viktigare är att histonernas roll när det gäller att kontrollera uttrycket på DNA-nivå saknas i anukleära trombocyter.

Effekter av aspirin på trombocytmetabolismen

Trombocytmetabolismen är främst oxidativ i motsats till neutrofiler som främst är glykolytiska . Blockering av anaerob glykolys minskar inte ATP och hämmar inte heller trombocytfunktionen. Det har visats att acetylering av enzymer i tricarboxylsyracykeln (TCA-cykeln) och komponenter i elektrontransportkedjan (ETC) är en vanlig regleringsmetod, särskilt för enzymer som är involverade i ämnesomsättningen, t.ex. malatdehydrogenas i kolmetabolismen , reglering av lipidmetabolismen och i ureacykeln för ammoniakavgiftning . Det följer av detta att acetylering av TCA-cykelenzymer och ETC-komponenter kan ha en betydande effekt på trombocyternas bioenergetik. Proteomiska studier av acetylering av aspirin har konsekvent avslöjat aspirinmedierad acetylering av malatdehydrogenas, som reglerar växlingen mellan kolhydrat- och fettsyrasyntes, och isocitratdehydrogenas, som regleras i mitokondrierna genom deacetylering med hjälp av sirtuinproteiner (Sirt3 och Sirt5) . Sirtuin-deacetylasaktivitet är associerad med ett antal TCA-enzymer i den mitokondriella matrisen och tros reglera antioxidantregenerering, reglering av TCA-flödet och anapleuros . Även om vi vid utarbetandet och tryckningen av denna översikt inte känner till några studier som direkt tar upp omfattningen av aspirinmedierad acetylering av metaboliska enzymer eller effekten av aspirin på det metaboliska flödet, tyder de proteomiska bevisen på att detta kan vara en viktig icke-kanonisk effekt av aspirin på trombocyternas biokemi.

Effekter av aspirin på trombocyternas lokalisering i tumörer

Nya bevis framkommer för att trombocyterna själva kan spela en betydande roll i cancerogenes och mer specifikt i utvecklingen av metastasering. I metastatiska musmodeller där tumörceller injiceras direkt i cirkulationen har strategier för att minska det cirkulerande antalet trombocyter visat sig vara effektiva för att minska tumörbördan . Andra studier i metastatiska modeller där lösligt fibrin och tumörceller injicerades tillsammans för att öka koagulationseffekten visade ökad förekomst av metastasering in vivo . Dessa studier stöddes av in vitro-experiment där lösligt fibrin förbättrade interaktionen mellan trombocyter och tumörceller i odlingsförhållanden . Dessa studier stöder hypotesen att aktivering av trombocytaggregation, utöver den förväntade ökningen av fibrin, ökar trombocyternas vidhäftning till tumörceller och underlättar metastatisk spridning. Förutom fibrin har ytterligare studier beaktat rollen för trombin, PAR-1 och koagulationsfaktor VII (FVII) , och deras samband med förstärkning av cancercellers livskraft , cancertillväxt och spridning , ökad tumörmalignitet och metastatiskt stöd .

Förutom modulering av tumörcellers biologi i systemisk cirkulation har trombocyter också visats spela en viktig roll i tillväxten av tumörceller. I en studie visades att aspirin signifikant minskade graden av proliferationsceller både in vitro och in vivo av äggstockscancer . I samma studie konstaterades också att trombocytaktivering kan öka proliferationen och tumörcellstillväxten efter saminkubation av tumörceller och trombocyter. Hämning av trombocyternas adhesiva receptorer inklusive GPIβα, GPIIβIIIα och P-selectin minskade dock inte de proliferativa effekterna från trombocyter. Detta tyder på att trombocytavskiljande proteiner och andra faktorer kan spela en roll i regleringen av tumörcellstillväxten. Det observerades till exempel att minskningen av TGF-β1 från trombocyter minskade proliferationen av äggstockscancerceller som exponerades för trombocyter . Vidare har aspirin också visat sig förhindra metastasering av kolorektalcancer genom en COX-1-mekanism som involverar TXA2 och PGE2 , vilket tyder på att aktiverade trombocyter kan stödja metastasering genom COX-1-beroende prostaglandinproduktion. Slutligen har ett nytt konjugat av aspirin och fosfotidylkolin (Aspirin-PC) visat sig störa den av trombocyter och tumörceller inducerade epitel-mesenkymövergången (EMT) genom VEGF- och tromboxanfrisättning. Denna formulering visade sig också hämma cellproliferation och angiogenes samtidigt som den ökar apoptos i cellmodeller för äggstocks- och kolorektalcancer .