Effekt av Bacillus megaterium-belagd kost på tillväxt, matsmältningsenzymaktivitet och intestinal mikrobiell mångfald hos Songpu Mirror Carp Cyprinus specularis Songpu

Abstract

Denna studie genomfördes för att utvärdera effekten av en Bacillus megaterium-belagd kost på tillväxtprestanda, matsmältningsenzymer och tarmmikrobiell mångfald hos Songpu-spegelkarp (Cyprinus specularis Songpu). Fisken utfodrades manuellt med två dieter (en kontrolldiet och en diet belagd med B. megaterium) tre gånger dagligen tills de var uppenbart mätta i 56 dagar. Jämfört med kontrollgruppen ökade tillägget med B. megaterium-belagt foder fiskens tillväxt och minskade foderomvandlingskvoten avsevärt (). Aktiviteterna hos förskottsamylas och lipas i behandlingsgruppen var betydligt högre än i kontrollgruppen (). Aktiviteterna hos proteaser i för-, mellan- och bakgut i behandlingsgruppen var alla högre än i kontrollgruppen (). Resultaten av sekvenseringen av 16S rDNA-generna i mikrobiota med hjälp av högflödessekvensering visade att mångfalden och rikedomen av tarmmikrofloran ökade tillsammans med Songpu-spegelkarpens tillväxt. Songpu-spegelkarpar som utfodrades med en diet belagd med B. megaterium uppvisade ökade proportioner av intestinal Bacillus och Lactococcus på genusnivå, och båda var signifikant högre än i kontrollgruppen (). Dessa resultat tyder därför på att applicering av B. megaterium i fodret kan förbättra tillväxten och matsmältningsenzymaktiviteten hos Songpu-spegelkarp och berika den fördelaktiga genussammansättningen i dess huvudsakliga tarmmikroflora.

1. Introduktion

Fisk, som en av de viktigaste kostkällorna för animaliskt protein, spelar en mycket viktig roll i människans livsmedelsstruktur. Under de senaste åren har dock säkerheten för vattenprodukter blivit en av de största faktorerna som hindrar utvecklingen av vattenprodukter på grund av oro för säkerheten för hormoner, antibiotika och överdrivna mikroorganismer . Med den snabba utvecklingen av intensiv odling med hög densitet försämras vattenmiljön för vattenbruket dagligen, vilket leder till sjukdomsutbrott och till och med till massdöd av odlade djur. Det finns ett brådskande behov av att hitta miljövänliga och säkra alternativ för att säkerställa en hälsosam tillväxt hos djur i uppfödning.

Som en ny fodertillsats efter antibiotikans era anses probiotika vara viktiga substitut för foderantibiotika . Studier har visat att användningen av probiotika inte bara kan främja tillväxten hos vattenlevande djur och förbättra deras överlevnad, utan också minska förekomsten av sjukdomar hos vattenlevande djur . Bacillus är en saprofytisk grampositiv bakterie som är vanligt förekommande i uppfödningsmiljön . Forskningen och tillämpningen av Bacillus inom vattenbruket har rönt stor uppmärksamhet. Den första tillämpningen av probiotika inom vattenbruket genomfördes genom att balansera bakteriepopulationen i vattnet och gav goda resultat . Vissa studier har visat att tillsats av Bacillus subtilis i foder inte bara kan främja tillväxten hos vattenlevande djur och förbättra aktiviteten hos deras matsmältningsenzymer och deras ospecifika immunitet, utan även förbättra strukturen hos deras tarmmikroflora . I mitten av 1900-talet började kinesiska forskare studera Bacillus megaterium, främst med fokus på screening av stammar, särskilt deras förmåga att bryta ner organiskt material, deras kvävemetabolism och deras tillämpning som probiotika i vattenbrukets avloppsrening .

Den vanliga karpen (Cyprinus carpio) är den mest extensivt odlade sötvattensfiskarten i Kina, och produktionen av vanlig karp uppgick till 2 962 218 ton år 2018 . Songpu-spegelkarp (Cyprinus specularis Songpu), en sort av vanlig karp, står för en allt större del av produktionen på grund av dess relativt snabbare tillväxt, bättre sjukdomsresistens, högre köttomvandlingsgrad och nära nog avsaknad av fjäll på kroppsytan . I och med expansionen och främjandet av jordbruk med hög densitet, ökad utfodringsfrekvens och vattenförorening har dock problemen med livsmedelssäkerhet och -kvalitet blivit allt allvarligare.

Näringsämnen är bland de viktigaste och mest lättreglerade faktorerna som påverkar vattendjurens motståndskraft. Livsmedelsmikrobiologi omfattar mikroorganismer som har både gynnsamma och skadliga effekter på livsmedelskvalitet och livsmedelssäkerhet och som därför kan vara av betydelse för folkhälsan. I den här studien syftade vi till att utvärdera effekten av B. megaterium-belagda dieter på tillväxt, matsmältningsenzymaktivitet och tarmmikrobiell mångfald hos Songpu-spegelkarp och att tillhandahålla en teoretisk grund för utövandet av hälsosam och ekologisk fiskodling.

2. Material och metoder

2.1. Dietberedning

B. megaterium bereddes i vårt laboratorium . Innehållet av B. megaterium var . Det kommersiella fodret köptes från Zhejiang AIPHA Feed Co., Ltd., Kina. De garanterade värdena för analysen av foderproduktens sammansättning visas i tabell 1. Jäsningsbuljongen av B. megaterium sprayades jämnt på ytan av det kommersiella materialet i en mängd av 100 ml/kg, och sedan placerades det sprayade fodret på en sval plats i 1 timme, varefter det användes som försöksgruppens foder. Kontrollgruppen utfodrades med oförändrat kommersiellt foder.

2.2. Utfodringsförsök

Songpu-spegelkarp (Cyprinus specularis Songpu) (kroppsvikt ) erhölls från Hulan Experimental Station of the Heilongjiang River Fisheries Research Institute i Heilongjiang-provinsen, Kina (45,97°N, 126,63°E). Fisken acklimatiserades till laboratorieförhållandena i 14 dagar och anpassades till det experimentella kontrollfodret före försöket. Därefter valdes 90 friska Songpu-spegelkarpar ut och fördelades slumpmässigt i två grupper (kontrollgrupp och försöksgrupp). Varje behandling utfördes i tre exemplar och varje upprepning bestod av 15 fiskar. Kontrollgruppen utfodrades med kommersiellt foder. Behandlingsgruppen utfodrades med kommersiellt foder belagt med B. megaterium. Den dagliga utfodringsmängden var 3 % av Songpu-spegelkarpens kroppsvikt, tre gånger per dag kl. 08:00, 12:00 och 19:00. Hela försöksperioden var 56 dagar. Under försöksperioden ersattes laboratorievattnet med 1/3 av vattenvolymen per vecka. Vattenkvaliteten mättes (med YSI professional plus, Ohio State, USA) dagligen under försöksperioden, vattentemperaturen varierade mellan 18 och 25 °C och en luftkompressor användes för att tillsätta syre 24 timmar om dygnet. Fisken vägdes både i början och i slutet av utfodringsförsöket.

2.3. Provtagning

För utfodringsförsöket togs tio fiskar slumpmässigt från den tillfälliga odlingstanken, och deras ursprungliga kroppsvikt mättes. Därefter samlades tarmkanalen in för mätning av den initiala tarmmikrofloran (initialgrupp). I slutet av det 56 dagar långa utfodringsförsöket, ungefär 24 timmar efter den sista utfodringen, sövdes alla fiskar med MS-222 utspätt i vattnet i en koncentration på 75 mg/l. Dessa fiskar räknades och vägdes för att bestämma viktökningsgraden (WGR), den specifika tillväxten (SGR) och foderomvandlingsgraden (FCR, tabell 2) .

Efter att ha erhållit slutvikten för alla fiskar valdes fem fiskar från varje tank slumpmässigt ut och placerades i en isplatta för snabb dissektion. Vävnadsprover, inklusive för-, mellan- och bakgut, samlades in med en aseptisk sax, tvättades med aseptisk fysiologisk saltlösning, vägdes och bereddes sedan till ett homogenat med aseptisk fysiologisk saltlösning (1 : 4). Alla prover förvarades omedelbart vid -80 °C i en frys för bestämning av matsmältningsenzymer. Ytterligare fem fiskar togs också slumpmässigt från varje akvarium. Ytorna på fiskarna desinficerades med 75 % alkohol innan fiskarna togs in i ett bioklart rum. Efter ytterligare desinfektion öppnades bukhålan, tarmens utsida torkades av med 75 % alkohol och tvättades fyra gånger med sterilt vatten, varefter tarmkanalen samlades in för utvärdering av den slutliga tarmmikrofloran.

2.4. Bestämning av matsmältningsenzymer

För att mäta immunitetsindexen homogeniserades de sammanslagna för-, mellan- och baktarmen manuellt i en glashomogenisator med 0,86 % NaCl (/) för att få ett 10 % homogenat. Efter centrifugering (4000 rpm, 10 minuter) vid 4 °C erhölls supernatanten, som huvudsakligen består av rå enzymvätska. Aktiviteterna av amylas, proteas och lipas i för-, mellan- och bakgut analyserades spektrofotometriskt med hjälp av diagnostiska reagenskit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Kina).

2.5. 16S rRNA-genförstärkning och Illumina-sekvensering

Mikrobiellt DNA extraherades från tarmproverna med hjälp av E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Den slutliga DNA-koncentrationen och reningen bestämdes med en NanoDrop 2000 UV-vis-spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA), och DNA-kvaliteten bestämdes genom 1 % agarosgelelektrofores. De hypervariabla V4-V5-regionerna i bakteriens 16S rRNA-gener amplifierades med primrarna 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCCGCGG-3) och 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) med hjälp av ett PCR-system för termocykler (GeneAmp 9700, ABI, USA). PCR:erna genomfördes med hjälp av följande program: PCR-metoderna utfördes med följande program: 3 minuters denaturering vid 95 °C, 27 cykler med 30 sekunder vid 95 °C, 30 sekunder för glödgning vid 55 °C och 45 sekunder för förlängning vid 72 °C, samt en slutlig förlängning vid 72 °C i 10 minuter. De resulterande PCR-produkterna extraherades från en 2 % agarosgel och renades ytterligare med hjälp av ett AxyPrep DNA-gelextraktionskit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) och kvantifierades med hjälp av QuantiFluor™-ST (Promega, USA) i enlighet med tillverkarens protokoll. Renade amplikoner sammanfördes i ekvimolära mängder och sekvenserades i parvis () på en Illumina MiSeq-plattform (Illumina, San Diego, USA) i enlighet med standardprotokollen från Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, Kina) .

2.6. Statistisk analys

Operationella taxonomiska enheter (OTU) klustrades med en gräns för 97 % likhet med hjälp av UPARSE (version 7.1, http://drive5.com/uparse/) med en ny ”greedy”-algoritm som samtidigt utför chimärfiltrering och OTU-klustring. Taxonomin för varje 16S rRNA-gensekvens analyserades med algoritmen RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) mot SILVA 16S rRNA-databasen med en konfidensgräns på 70 %. Chao- och ACE-skattningsindexen valdes för att identifiera samhällets rikedom, och Shannon- och Simpson-indexen användes för att identifiera samhällets mångfald . Alla dessa index i våra prover beräknades med QIIME (version 1.7.0) och förbereddes för visning med R-programvaran (version 2.15.3). De statistiska analyserna utfördes med det statistiska programpaketet SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Uppgifterna uttrycks som tre upprepningar. Uppgifterna utsattes för envägs ANOVA, och när skillnader konstaterades rangordnades medelvärdena med hjälp av Duncans multipla jämförelsetest. Skillnader ansågs vara signifikanta vid .

3. Resultat

3.1. Effekten av den B. megaterium-belagda dieten på fiskens tillväxt

Som framgår av tabell 2 var vikttillväxten och den specifika tillväxten i behandlingsgruppen (71,03 %, 0,42 % dag-1) signifikant ökad jämfört med kontrollgruppens (52,75 %, 0,33 % dag-1, ) och foderomvandlingsfaktorn i behandlingsgruppen (1,28) var signifikant lägre än i kontrollgruppen (2,23, ). Ingen dödlighet observerades under de 56 dagarna av utfodringsförsöket.

3.2. Effekten av den B. megaterium-belagda kosten på matsmältningsenzymaktivitet

Effekterna av den B. megaterium-belagda kosten på matsmältningsenzymaktiviteten visas i tabell 3. Amylasaktiviteten i förloppet i behandlingsgruppen var signifikant högre än i kontrollgruppen (). Amylasaktiviteten i mellangärdet och bakgärdet i behandlingsgruppen var signifikant högre än i kontrollgruppen, men det fanns inga signifikanta skillnader (). Proteasaktiviteterna i för-, mellan- och bakgut i behandlingsgruppen var högre än i kontrollgruppen, men det fanns inga signifikanta skillnader (). Lipasaktiviteten i förgotten i behandlingsgruppen var signifikant högre än i kontrollgruppen (). Lipasaktiviteten i mellangärdet och bakgärdet i behandlingsgruppen var i princip densamma som i kontrollgruppen, och det fanns inga signifikanta skillnader ().

3.3. Effekten av en diet med B. megaterium-beläggning på den intestinala mikrobiella mångfalden och rikedomen

Den intestinala mikrobiella mångfalden hos Songpu-spegelkarparna bestämdes med hjälp av sekvensering med hög genomströmning. Det genomsnittliga antalet OTU:er som upptäcktes från det första gruppprovet var 63. Efter 56 dagar var det genomsnittliga antalet OTU:er som upptäcktes i kontroll- och behandlingsgrupperna 114 respektive 196. Täckningsindexet för alla prover var över 0,97, vilket tyder på en hög detektionsgrad. Som framgår av tabell 4 var Chao- och ACE-indexen, som återspeglar rikedomen i den intestinala mikrofloran hos Songpu-spegelkarpfen, betydligt högre i behandlingsgruppen efter 56 dagar än i kontroll- och utgångsgrupperna (). Shannon-indexet för mångfalden i tarmsamhället i behandlingsgruppen var signifikant högre än i kontrollgruppen (). Simpson-indexet för tarmsamhällets mångfald i behandlingsgruppen var signifikant lägre än i kontrollgruppen (). Det fanns inga signifikanta skillnader för de ovan nämnda fyra indexen mellan kontroll- och utgångsgrupperna ().

3.4. Effekten av B. megaterium-belagd diet på sammansättning och förändringar i den huvudsakliga mikrofloran i tarmen hos Songpu-spegelkarp

En tarmmikrobiell rikedom på mer än 1 % på fylumnivå togs som huvudmikroflora för den statistik som presenteras i figur 1. Det dominerande fylumet i tarmen hos den ursprungliga gruppen var främst Fusobakterier (86,36 %) och Bacteroidetes (8,60 %) innan försöket inleddes. Efter det 56 dagar långa utfodringsförsöket ökade antalet av den huvudsakliga tarmmikrofloran i varje grupp. I kontrollgruppen var de dominerande fylerna Fusobacteria (86,36 %), Bacteroidetes (14,4 %), Firmicutes (2,42 %) och Proteobacteria (1,37 %). I behandlingsgruppen var de dominerande fylerna Firmicutes (69,15 %), Proteobacteria (23,8 %), Bacteroidetes (4,65 %) och Actinobacteria (1,43 %). En tarmmikrobiell rikedom på mer än 0,5 % på genusnivå betraktades som den huvudsakliga mikrofloran för de statistiska beräkningarna, som visas i tabell 5. Det fanns endast 5 släkten av de viktigaste tarmmikroorganismerna i den ursprungliga gruppen. Efter 56 dagars utfodringsförsök ökade de viktigaste tarmmikroorganismerna till 11 släkten i behandlingsgruppen. Den vanligaste mikroorganismen i tarmen hos Songpu-spegelkarp i den första gruppen var Cetobacterium. Efter 56 dagars utfodringsförsök var den vanligaste mikroorganismen i kontrollgruppen fortfarande Cetobacterium. I kontrollgruppen var de 11 dominerande släktena Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified och Yersinia. Songpu-spegelkarpar som utfodrades med en diet belagd med B. megaterium uppvisade ökade proportioner av intestinal Bacillus och Lactococcus på genusnivå, som båda var signifikant högre än i kontrollgruppen ().

4. Diskussion

Probiotika som Bacilli har använts i stor utsträckning inom vattenbruket. Vissa studier har visat att tillsats av olika stammar av Bacillus spp. till larvfoder har uppnått goda resultat och har en god främjande effekt på fiskelarvernas tillväxt . Tillsatsen av bakterier (stam CA2) som fodertillskott till xeniska larvkulturer av ostronet Crassostrea gigas förbättrade konsekvent larvernas tillväxt under olika årstider . Manipulering av mikrobiota med hjälp av probiotika har rapporterats som en värdefull metod för vattenbruk för att kontrollera eller hämma patogena bakterier och för att förbättra tillväxtprestanda och aktiviteten hos matsmältningsenzymer . I jämförelse med den obehandlade kontrollgruppen var slutvikten och viktökningen betydligt större hos räkor som utfodrades med en blandning av två probiotiska stamdieter . I den här studien fann man att en B. megaterium-belagd diet ökade vikttillväxten och den specifika tillväxten och minskade foderomvandlingskvoten, vilket tyder på att B. megaterium-belagda dieter kan främja tillväxten hos Songpu-spegelkarp. Liknande resultat hittades hos havskatt Clarias sp., där tillsatsen av B. megaterium PTB 1,4 i fodret avsevärt förbättrade tillväxten. Liknande resultat hittades också hos Penaeus monodon, för vilken högre FCR- och SGR-värden erhölls efter tillsats av Bacillus cereus .

Probiotiska bakterier kan producera matsmältningsenzymer som hjälper fisken att använda foderets näringsämnen och smälta dem . Tillsatsen av B. megaterium till växtproteinmåltider kan främja utvecklingen av tarmmorfologin och öka matsmältningsenzymaktiviteten . Undersökningen av probiotika för den vanliga karpen Cyprinus carpio baserat på tillväxtprestanda och matsmältningsenzymaktiviteter visade att de genomsnittliga matsmältningsenzymaktiviteterna i alla probiotiska behandlingsgrupper skiljde sig signifikant från kontrollgrupperna . I den här studien hade en B. megaterium-belagd diet en positiv och viktig effekt på matsmältningsenzymaktiviteterna, särskilt amylas och proteas i för-, mellan- och stjärtspjälken. Liknande resultat hittades också hos tilapia, som visade en förbättring av matsmältningen och tillväxten efter att Bacillus NP5 hade tillsatts i fodret. En högre nivå av enzymaktivitet i foder som innehåller probiotika förbättrade matsmältningen av protein, stärkelse, fett och cellulosa, vilket i sin tur kan förklara den bättre tillväxt som observerades med foder som innehöll probiotika . Matsmältningsenzymer hjälper fisken att bryta ner och smälta näringsämnen i fodret, vilket gör det lättare för fisken att ta upp näringsämnena i fodret .

Framsteg inom sekvensering med hög genomströmning har möjliggjort en omfattande katalog av metagenomprover, vilket ger en inblick i mångfalden av mikrobiella arter från en mängd olika källor, inklusive hav, jord och människokropp. I dessa studier används både 16S rRNA-gensekvensering för att fastställa fylogenetiska relationer och mer omfattande shotgun-sekvensering för att förutsäga den detaljerade art- och gensammansättningen . Rikedoms- och mångfaldsindex är viktiga index för att upptäcka mikroorganismernas mångfald och komplexitet i proverna . I den här studien ökade den mikrobiella mångfalden och rikedomen i tarmen med tillväxten av Songpu-spegelkarp, och Chao- och ACE-indexen, som avspeglar rikedomen i Songpu-spegelkarpens tarmmikroflora, var signifikant högre i behandlingsgruppen än i kontrollgruppen. Dessutom var Shannon-indexet för mångfalden i tarmsamhället i behandlingsgruppen betydligt högre än i kontrollgruppen. På samma sätt visade resultaten också att tarmmikroflorans struktur förändrades när unga trubbnosor utfodrades med foder som kompletterades med olika nivåer av Bacillus subtilis . Tillsats av probiotika i fodret kan också förändra antalet och strukturen hos den ursprungliga mikrofloran i Litopenaeus vannameis tarmkanal och främja de komplexa interaktionerna mellan de mikrobiella samhällena i Litopenaeus vannameis tarmkanal .

I den här studien uppvisade Songpu-spegelkarparna som utfodrades med en diet som var belagd med B. megaterium ökade proportioner av Bacillus och Lactococcus i tarmarna på släktskapsnivå, som båda var signifikant högre än i kontrollgruppen. Resultaten visade också att sammansättningen och proportionerna av den huvudsakliga mikrobiota i tarmen hos Songpu-spegelkarp kan ändras med B. megaterium-belagda dieter. Sammanfattningsvis kan användningen av B. megaterium-belagda dieter avsevärt förbättra fiskens tillväxt och minska foderomvandlingsförhållandet, förbättra aktiviteten hos matsmältningsenzymer och berika den fördelaktiga genussammansättningen hos den huvudsakliga tarmmikrofloran.

Datatillgänglighet

Alla data tillhandahölls i artikeln, och det finns inga fler data som ska laddas upp.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Denna studie finansierades av Central-Level Non-Profit Scientific Research Institutes Special Funds (no. HSY202005M), Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (nr QC2018038), Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (nr 2017HY-ZD0507, 2019XT0502 och 2020TD56), National Key R&D Program of China (nr. 2019YFD0900302) och Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (no. FBB2017-04).