Heparininducerad trombocytopeni (HIT) – en förnuftig laboratoriemetod (förhoppningsvis)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Postat: Förhoppningsvis en förnuftig laboratoriemetod

År 1980 fick jag min första begäran om en utredning av en sjukdom som jag aldrig hade upplevt. En hematolog vid vår institution kom in med en förfrågan om att se om en patient vid vår institution kan ha ett fall av heparininducerad trombocytopeni (HIT). Jag hade aldrig hört talas om sjukdomen vid den tidpunkten, så jag var tvungen att använda det gamla sättet att slå upp det i Index Medicus (riktiga böcker) för att få en referens. Jag kunde inte hitta några laboratoriemetoder på den tiden i vårt område, så jag gav mig ut på ett uppdrag att få en metod validerad så att jag kunde hjälpa den här läkaren att behandla detta ämne. Jag hittade senare en metod som använder sig av ljusöverföringsaggregometri (LTA). Vid detta förfarande användes normal blodplättarrik plasma (PRP) från en normal donator och serum från en patientdonator med flera olika koncentrationer av UFH för att kontrollera om det förekom en aggregeringsreaktion. Detta utfördes på en dubbelkanals LTA Chronolog-aggregometer. Jag kan inte ge dig referensen eftersom Pubmed endast går tillbaka till 1983 i ämnet.

Därefter var jag tvungen att lära mig vad HIT handlade om. HIT är efterdyningarna av ett immunsvar som är en motsägelse i termer eller en ”paradox” av reaktioner. Läkemedelsinducerad immuntrombocytopeni kan orsakas av läkemedel som kinin och vankomycin som orsakar en omedelbar och drastisk trombocytopeni (<20 x 109/L), vilket orsakar allvarliga blödningar. En person med en äkta HIT-reaktion kan förlora 50 % av sina trombocyter i början av heparin efter en period på 5 dagar eller mer, men i stället för blödningsproblem utvecklar de trombotiska problem.

HIT är ett immunsvarsproblem som orsakas av IgG-antikroppar. Antikropparna utvecklas som svar på ofraktionerat heparin (UFH) och heparin med låg molekylvikt (LMWH). Förekomsten som svar på UFH-behandling är 0,5-5 %. Vid LMWH-behandling är förekomsten av HIT en tiondel av den som observeras med UFH.

HIT är en sjukdom som kräver att läkaren fattar snabba beslut för att förhindra katastrofala konsekvenser för patienten. De kan använda 4Ts-poängen tillsammans med trombocytantalet för att vägleda dem om de ska beställa laboratorietestprotokoll: 4Ts är ett poängsystem för HIT som används i stor utsträckning i klinisk praxis. Se tabellen nedan. Titeln hänvisar till fyra egenskaper hos HIT:

• Trombocytopeni
• Trombocytopenins tidpunkt i förhållande till heparinexponering
• Trombotisering eller andra följder av HIT
• Sannolikhet för andra orsaker till trombocytopeni

Tabell. 4Ts score

.

Feature	Score
	2 poäng	1 poäng	0 poäng
Thrombocytopeni	>50% minskning och trombocyter nadir 20-100 × 109/L	30%-50% minskning eller trombocyten nadir 10-19× 109/L	< 30% minskning eller plättar nadir < 10×109/L
Tidpunkt för minskningen av antalet blodplättar	Det är tydligt att det börjar dag 5-10, eller ≤1 dag om heparinexponering under de senaste 30 dagarna	Sammanhängande med nedgång dag 5-10, men inte tydlig (t.ex. saknas trombocytantal); debut efter dag 10; eller fall ≤1 dag om heparinexponering för 30-100 dagar sedan	Fall i antal blodplättar ≤4 d utan nyligen genomförd heparinexponering
Trombos eller andra följdsjukdomar	Ny trombos (bekräftad); hudnekros vid injektionsställen för heparin; anafylaktoida reaktioner efter IV heparinbolus; binjureblödning	Progressiv eller återkommande trombos; erythematösa hudförändringar; Trombos misstänkt men inte bevisad	Inte
Andra orsaker till trombocytopeni	Inte uppenbart	Möjligt	Oförutsägbart

Den maximala poängen är 8. En poängsumma på 6-8 indikerar en hög sannolikhet för HIT. Ett resultat på 4-5 indikerar en intermediär förekomst av HIT och ett resultat på 0-3 är en låg sannolikhet för förekomst av HIT.3,4

Om HIT misstänks på grund av ett förhöjt 4Ts-resultat kommer laboratoriet att hjälpa läkaren att ställa en korrekt diagnos. Detta kan åstadkommas med hjälp av ett antal analyser. De brukar falla in i två klasser: immunologiska och funktionella. I följande information diskuteras de tester som oftast används vid laboratorietestning av sjukdomen.

Laboratoriediagnostiska tester för HIT

HIT Immunoassay: Tester för att påvisa anti-PF4/heparinantikroppar

Enzymimmunoassays (EIA) (påvisar IgG)

EIA (påvisar polyspecifika antikroppar)

Dessa metoder är vanligen PF4-beroende med hög känslighet. HIT-personerna kommer att testa 97 % positivt med fastfaskit. Dessa är allmänt tillgängliga i handeln. Metoderna är vanligen satsvis testade på grund av den långa tiden för denna metod. Svagt positiva resultat kan dock ha låg specificitet. Riktlinjer för positivitet bör fastställas i varje laboratoriemiljö.

– IgG-specifik kemiluminiscentanalys (CLIA)

-En kemiluminiscent immunoassay (CLIA) är ett snabbt automatiserat förfarande som påvisar anti-PF4/heparin-antikroppar med hjälp av magnetpartiklar som är belagda med PF4/polyvinylsulfonat (PVS). Efter inkubation, magnetisk separation och ett tvättsteg tillsätts ett spårämne bestående av en isoluminol-märkt antihuman IgG-antikropp, som binder till anti-PF4/heparin-antikropparna på partiklarna. Reaktionen avslutas med en andra inkubation, magnetisk separation och tvättning. En OD-avläsning erhålls som är proportionell mot den uppmätta koncentrationen av anti-PF4/heparin-antikroppar. Testerna utförs vanligen på begäran med en svarstid på cirka 30 minuter. I en studie där man jämförde denna metod med guldstandarden serotonin release assay (SRA) var testkorrelationerna enastående när det gäller specificitet och sensitivitet (98,8/97,0 % respektive).6

– Latex immunoturbidometric assay (LIA) för (HIT).

LIA klassificeras som ett immunoassay. Det skiljer sig från de flesta andra immunoassays, t.ex. EIA, genom att närvaron av PF4/heparinreaktiva antikroppar i patientplasma resulterar i en hämning av partikelagglutination genom konkurrens med en HIT-mimiknande monoklonal antikropp. Följaktligen har LIA kallats en ”funktionaliserad immunoassay”, vilket i teorin antyder att den kan ge en diagnostisk specificitet som ligger mellan den högspecifika funktionella analysen, SRA, och de mindre specifika PF4-beroende EIA-metoderna. Detta är ett lätt automatiserat förfarande med en genomströmningstid på cirka 20 minuter. Studier har visat en känslighet på 97,4 % och en specificitet på 91,2 %.7

Lateral flow Assay (STiC):

Lateral flow immunoassays påvisar IgG-antikroppar mot PF4/polyanionkomplex som finns i ett utvärderingskort där resultaten avläses visuellt. Med en inkubationstid på 10 minuter är detta en snabb metod för att fastställa förekomsten av en HIT.

Funktionella HIT-analyser: Test som påvisar antikroppar som kan binda och aktivera trombocyter

Serotonin release assay (SRA) – Heparininducerat trombocytaktiveringstest (HIPA) – Trombocytaggregationstest (PAT) – Flödescytometribaserade test.

Serotonin release assay (SRA): HIT-konfirmerande test

Med denna metod påvisas trombocyteraktiverande antikroppar. SRA mäter det radiomärkta serotonin som frisätts från trombocyter.9,10 För ett positivt resultat krävs > 20 % frisättning av serotonin med låg dos UFH och < 20 % frisättning i närvaro av höga UFH-nivåer. Denna metod har tidigare allmänt erkänts som guldstandard för bekräftande testning. Den har en sensitivitet och specificitet på 95 %. SRA plockar upp detektion av trombocytaktiverande antikroppar. Den har högst sensitivitet/specificitet för klinisk HIT. SRA har också en mycket högre diagnostisk specificitet än EIA. SRA bör inte utföras utan ett tidigare positivt EIA-resultat som ett screeningtest. Detta hjälper till att utesluta problemet med ett falskt positivt SRA-resultat. Om ett negativt EIA-resultat hittas i ett prov från en försöksperson med ett positivt SRA-resultat bör detta vara en ”röd flagga som varnar” för att SRA-metoden måste utvärderas.

SRA kan också ge information om huruvida ett HIT-serumprov kan ge ett starkt trombocytrespons i avsaknad av heparin. Den heparinoberoende trombocytaktiveringen är en varning för en extremt allvarlig förekomst av HIT. Detta fynd kan indikera fördröjd HIT och starkt positiv HIT med förekomst av konsumerande koagulopati med risk för mikrovaskulär trombos.

Testet är komplext, dyrt och tidskrävande. Normala donatortrombocyter krävs (svårt att standardisera på grund av individuella normala donatorreaktioner). Därför är det ett relativt ostandardiserat test som inte används i stor utsträckning.9,10

Heparin-inducerad trombocytaktiveringsanalys (HIPA):

Denna metod är en tvättad trombocytaktiveringsanalys som vanligtvis endast utförs i Europa. Denna test utförs genom trombocytaggregation och bestäms visuellt genom en slutpunkt för trombocytaktivering.10 Som jämförelse utförs SRA genom att testa trombocyter i en shaker och reagera i 60 minuter. HIPA skiljer sig genom att man använder omrörda trombocyter och avläser visuellt i intervaller om 5 minuter under 45 minuter.

Vissa utredare har observerat att HIPA-metoden är känsligare för att upptäcka trombocytaktiverande antikroppar än SRA-förfarandet. Detta fynd kan dock vara att man plockar upp icke-patogena antikroppar, vilket leder till att diagnosens specificitet sänks.6

Tester för trombocytaggregation

(LTA: ljusöverföringsaggregometri)/WB: helblodsaggregometri):

Ljusöverföringsaggregometri (LTA) var den första test som användes för att bestämma ett kvalitativt trombocytaggregationsrespondens för HIT-antikroppar. Det utförs genom att placera normalt donator-PRP och patient-PRP i en kuvett som rörs om. Heparin tillsätts till blandningen i olika koncentrationer och aggregeringen övervakas under 15 minuter. Om ett prov uppvisar aggregering tillsätts en högre koncentration av heparin för att fastställa vid vilken punkt aggregeringen hämmas. Detta ges en positiv eller negativ kvalitativ resultatbestämning: negativ, svagt positiv eller starkt positiv (0, 2, 3). Detta test används inte längre på grund av arbetsintensiteten och den relativt låga känsligheten.11

– Vid trombocytaggregometri med helblod (WB) används en blandning av normala donatortrombocyter och patientens helblod eller serum, beroende på vilken aggregometer som används. Om denna information inte är känd bör givaren ha blodgrupp O. Helblodsgivarna bör prekvalificeras (med hjälp av ett HIT-positivt prov) för att säkerställa att provet reagerar på antikroppen. Beroende på WB-metoden kan provet tas i ett vanligt 3,2 % natriumcitratrör eller ett särskilt hirudinprovtagningsrör. Båda metoderna använder en form av impedansaggregometri… För varje metod inkuberas heparin och blodprover och aggregeringen observeras med impedansaggregometri. Alla prover som visar ett aggregeringssvar utmanas sedan med en högre koncentration av heparin tills ingen aggregering konstateras. WB-trombocytaggregometri anses vara en kvantitativ analys och rapporteras som värden från 0-3, beroende på vilken heparinkoncentration som krävs för att minska den observerade aggregeringen.11

Flödescytometri för förekomst av HIT

Det trombocytära P-Selectin Expression Assay (PEA) används för utvärdering av HIT med hjälp av flödescytometri. Som vi diskuterade tidigare är SRA-metoden ”guldstandard” för bekräftande test för att känna igen antikroppar som kan känna igen PF4 i en kompex med närvaro av heparin. Vissa patienter som behandlas med heparin utan förekomst av HIT kan vara positiva för antikropparna. SRA är vanligtvis endast tillgängligt i särskilda referenslaboratorier. Metoden är tidskrävande, tekniskt krävande och expansiv. Det är inte möjligt att få en snabb svarstid, vilket ytterligare fördröjer diagnosen vid förekomst av en HIT som kräver omedelbar behandling för att förhindra eventuella livshotande problem. I en nyligen genomförd studie utvärderades SRA-metoden i förhållande till PEA-tekniken som använder ett flödescytometrisystem. I analysen används den PF4-beroende P-selectin-expressionsanalysen PEA. En retrospektiv studie utfördes på lagrade serumprover från 91 personer. Alla patienter som undersöktes hade tidigare HIT 4Ts-information som omfattade följande: trombocytopeni, tidpunkten för trombocytförlusten, en trombosdiagnos och alla andra fall av trombocytopeni. Alla försökspersoner med en intermediär 4Ts-poäng och ett förhöjt PF4 EIA-test med en OD ≥2,0 eller en förhöjd 4Ts-poäng och ett lägre PF4 EIA-test med en OK på ≥1,0 klassificerades som HIT-positiva; övriga prover klassificerades som HIT-negativa.

I den här studien hade PEA ett högre diagnostiskt resultat (area under kurvan 0,92 vs 0,82;P-0,02) än SRA. Elva av 16 serumprover som var PEA-positiva och SRA-negativa var HIT-positiva. Författarna uppgav att andra studier där man använde prover med liknande trombocytmarkörer och prover som var seriellt utspädda från personer med bekräftade HIT-diagnoser visade att PEA är känsligare än SRA för trombocytaktiverande antikroppar.

De drog därför slutsatsen att PEA är enklare att utföra och att resultaten visade på ett mer korrekt resultat när man ska diagnostisera förekomsten av en HIT.13

Ett annat flödescytometribaserat test är HITAlert från IQ Products. I en studie från 2013 utvecklades ett protokoll där man använde flödescytometrimetoden HITAlert för att upptäcka HIT i en laboratoriemiljö på ett sjukhus med tertiär vård. De jämförde 4Ts-poängen för att screena eventuell förekomst av en HIT hos 37 försökspersoner. Serum analyserades för förekomst av HIT-antikroppar med flödescytometrimetoden HITAlert och jämfördes sedan med en antigenanalys. De jämförande metoderna var particle gel immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assay och två funktionella tester. De använde Multiplate WBA-metoden (inte tillgänglig i USA och Kanada) och SRA-metoden. Deras resultat var följande: Flödescytometri visade HIT-positiv hos 14 av de 37 patienterna. I 4Ts poäng av låg (0 av 8), intermediär (5 av 19) och hög (9 av 10). Vid en jämförelse med SRA hade flödesmetoden en specificitet på 100 % och en sensitivitet på 81 % för att identifiera förekomsten av HIT. WBIA-funktionstestet hade också en känslighet på 81 % och en specificitet på 90 % vid jämförelse med flödescytometrianalysen. PaGIA-förfarandet hade dock endast en specificitet på 20 % men en känslighet på 20 %. Flödescytometri har förbättrat specificiteten för det antigena förfarandet. Detta var mest framträdande i 4T-intermediärriskgruppen. Detta var tydligt i alla tre funktionella metoder som användes i protokollet. Utredarna drog slutsatsen att flödescytometrimetoden HITAlert kan förbättra specificiteten för att identifiera en HIT utan att förlora någon känslighet.12 Denna analys är endast avsedd för forskningsändamål i USA och Kanada och är inte tillgänglig för diagnostiska förfaranden.

Sammanfattning för HIT-detektering

Jag vill avsluta med en algoritm som finns i referens #14 av Cuker et al. och som rekommenderas för diagnos av HIT. Det är en diagnostisk algoritm med intermediär/hög 4Ts-poäng, följt av immunoassay, följt av funktionell testning som resulterar i: – Få falskt negativa (missade HIT-diagnoser) och – Få eller inga falskt positiva (felaktiga HIT-diagnoser).

Anmärkning: En funktionell analys kanske inte är nödvändig för patienter i gruppen med hög sannolikhet baserat på deras 4Ts-poäng och en mycket starkt positiv immunoassay (ELISA-värde på > 2.0 OD-enheter).

Förekomsten av HIT-närvaro är en ogynnsam läkemedelsinteraktion som modereras av trombocytaktiverande antikroppar som riktar sig mot PF4/heparinkomplexen. Det är laboratoriets ansvar att fastställa lämpliga laboratorieanalyser för att identifiera förekomsten eller och den funktionella förmågan hos de te heparininducerade antikropparna att aktivera trombocyter. Dessa tester måste utföras i tid för att hjälpa läkare att förhindra katastrofala trombotiska situationer.

1. Prince M, Wenham T. Heparininducerad trombocytopaenia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Unfractionated heparin versus low molecular weight heparins for avoiding heparin-induced thrombocytopenia in postoperative patients. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Översyn. Uppdatering i: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Prediktivt värde av 4Ts scoring system för heparininducerad trombocytopeni: en systematisk genomgång och metaanalys. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Utvärdering av klinisk poängsättning före test (4 Ts) för diagnos av heparininducerad trombocytopeni i två kliniska miljöer. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Kvantitativ tolkning av mätningar av optisk densitet med PF4-beroende enzymimmunoassays. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. Laboratoriediagnos av heparininducerad trombocytopeni. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Förbättring av den kliniska tolkningen av den enzymkopplade immunosorbentanalysen av trombocytfaktor 4/heparin mot trombocyter för diagnos av heparininducerad trombocytopeni genom användning av mottagaroperationskaraktäristisk analys, stratumspecifika sannolikhetskvoter och Bayes teorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratory testing protocols for heparin-inducd thrombocytopenia (HIT) testing. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. Testet för serotoninfrisättning i trombocyter. Am J Hematol. 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? En omfattande samtida undersökning av laboratorietester för heparininducerad trombocytopeni. Pathology. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital…. Blodkoagulation och fibrinolys. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. En ny PF4-beroende trombocytaktiveringsanalys identifierar patienter som sannolikt har heparininducerad trombocytopeni/trombos. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).