Vår kundkrets på Biotage har intressanta och varierande bakgrunder, från högkvalificerade syntetiska kemister till experter på naturproduktkemi och till dem som precis har börjat sin resa med kemi. Vad jag har lärt mig under min över 40-åriga karriär inom kromatografins ”konst” är att många av dessa fina människor saknar förståelse för kromatografiska principer. Jag tror att denna brist på förståelse endast beror på deras grundläggande studieprogram där separationsvetenskap används som ett verktyg under laborationer, men där principerna bakom varför komponenterna i en blandning separeras (eller inte separeras) kanske inte förklaras, förstås eller studeras på ett effektivt sätt.
Det finns fyra grundläggande typer av kromatografi:
- Gas-vätskekromatografi (GC)
- Vätskekromatografi (LLC)
- Vätskekromatografi i fast form (LSC)
- Storleksuteslutningskromatografi/gelpermeationskromatografi (SEC/GPC)
För det här inlägget kommer jag att fokusera på vätskekromatografi i fast form.
Vätske-fast-kromatografi
Detta är den mest populära av de tekniker som nämns ovan eftersom den är användbar för separationer av halvflyktiga och icke-flyktiga föreningar. Eftersom värme inte krävs för att eluera föreningar från en separationskolonn (som med GC), kräver vätske-fast-kromatografi användning av ett lösningsmedel eller en lösningsmedelsblandning av blandbara lösningsmedel med olika polaritet för att få provets kemiska komponenter att separeras från varandra.
Med LSC laddas provet på ett fast stöd eller en stationär fas. Provets komponenter binds till den stationära fasen, men i olika grad. Mängden interaktion med den stationära fasen styr separationshastigheten och effektiviteten. Ju mer attraktion till den stationära fasen desto längre tid behöver föreningarna för att eluera. För att hjälpa till att eluera dessa starkt bundna föreningar måste lösningsmedelsförhållandet förändras (ökande styrka) med tiden.
Inom LSC finns flera olika kromatografiska tekniker…
- Papperskromatografi (PC)
- Tunnskiktskromatografi (TLC)
- Hög-performance liquid chromatography (HPLC)
- Flashkromatografi (FC)
- Ionbyteskromatografi (IX)
- Affinitetskromatografi (AC)
- Kiralkromatografi (CC)
- Kromatografi i överkritisk vätska (SFC)
I det här inlägget kommer jag att fokusera på flashkromatografi, vars principer är desamma som för HPLC. Båda använder kolonner fyllda med en stationär fas i vilka provet injiceras och genom vilka lösningsmedlet pumpas. Flashkromatografi använder dock större kolonner än HPLC, som främst är en analytisk separationsteknik.
Flashkromatografi är en preparativ kromatografisk teknik vars kolonner också är fyllda med ett fast stöd eller medium som har en större partikelstorlek än HPLC-kolonnerna. Dessa skillnader i media- och kolonnstorlek gör det möjligt för flashkolonner att rena mer förening per gram media än HPLC.
- Flashkromatografi använder 15 µm till så höga som 60 µm mediapartiklar
- HPLC använder 1,7 µm till 10 µm mediapartiklar
Vad som händer inne i kolonnen
De flesta flashkromatografier och HPLC utförs med hjälp av antingen normalfas- eller omvänd fasmetodik. Skillnaderna mellan dessa metoder ligger i den stationära fasens kemi och de lösningsmedel som används för att separera en blandnings enskilda kemiska komponenter.
- Normalfas använder opolära och måttligt lösningsmedel (t.ex. hexan och etylacetat) för den mobila fasen och ett polärt medium (t.ex.t.ex. kiseldioxid) som stationär fas
- Umvänd fas är precis tvärtom och använder polära lösningsmedel och en opolär stationär fas
Med tanke på att dessa metoder är ”polära” motsatser till varandra (ordvitsen är avsedd), är elueringsordningen för de flesta föreningar omvänd. Det är här kemin bakom kromatografiska separationer sker.
Låt oss fokusera på normalfas för tillfället.
Normalfas-kromatografi
Med normalfas-kromatografi löses de kemiska föreningar som ingår i en blandning (t.ex. reaktionsblandning, naturproduktens extrakt etc.) i ett lämpligt lösningsmedel och injiceras i kolonnen. När blandningen kommer i kontakt med den polära stationära fasen, låt oss säga kiseldioxid, konkurrerar blandningens föreningar och deras upplösningslösningsmedel med den rörliga fasen om kiseldioxidens bindningsställen. Ju mer polär kemikalien är, desto starkare attraheras den av kiseldioxiden. Denna attraktion kallas adsorption (skiljer sig från absorption).
Absorption är vad som sker när en svamp eller pappershandduk interagerar med en vätska. Adsorption är en kombination av fysiska och kemiska interaktioner där kiseldioxidens polära yta kemiskt binder de kemiska komponenter som den kommer i kontakt med, mestadels på grund av fenomen som kallas vätebindning och van der Walls-krafter.
När någon kemikalie interagerar med torr kiseldioxid (som används i en ny flashkolonn) uppstår adsorption. Denna interaktion frigör värme, vilket kan orsaka problem med stabiliteten hos föreningar och kromatografiska resultat. Av denna anledning är kiseldioxidkolonnerna vanligtvis ekvilibrerade (förvättade) med ett lågpoligt lösningsmedel innan provet introduceras. Lågpoliga lösningsmedel (t.ex. hexan, heptan, cyklohexan) är svaga lösningsmedel och adsorberas inte så bra av kiseldioxid eller andra polära medier.
Kiseldioxidens ytkemi är en blandning av hydroxylgrupper (silanoler) och silyletrar (figur 1). Dessa funktionella grupper är polära, anses vara negativt laddade och adsorberar elektronfattiga föreningar. Aromatiska föreningars pi-vågor kan vätebindas med kiseldioxidens hydroxylgrupper under adsorptionen.1
Figur 1. Kromatografisk kiseldioxids kemi består av en blandning av silanoler och silyleterfunktionaliteter. Dessa enheter binder till kemikalier genom vätebindning/adsorption.
För att säkerställa en god bindning (adsorption) av provets beståndsdelar måste det prov som ska renas antingen lösas upp och fyllas på i kolonnen i ett svagt lösningsmedel (vätskefyllning) eller lösas upp i ett starkare (polärt) lösningsmedel, blandas med ett inert medium (t.ex. kiseldioxid, kiselgur, kiselalger), torkas och packas i en annan kolonn som placeras i linje med reningskolonnen (torrfyllning). Torrfyllning eliminerar många problem som uppstår vid användning av flytande fyllning, särskilt när provet är löst i ett polärt lösningsmedel.
Efter fyllning av provet introduceras lösningsmedlen i den rörliga fasen. För att uppnå en separation måste emellertid provkomponenterna desorbera från den stationära fasen med olika hastighet. Även om detta kan uppnås med hjälp av ett lösningsmedel med konstant polaritet (isokratisk eluering), uppnås vanligtvis bättre rening med hjälp av en mobil fas som börjar med låg polaritet och ökar sin polaritet med tiden. Detta kallas gradienteluering.
Med en gradient desorberas de föreningar med högre löslighet i lösningsmedlet med låg polaritet (föreningar med lägre polaritet) först och passerar genom kolonnen. När polariteten hos lösningsmedlet i den mobila fasen ökar desorberas adsorberade föreningar från medierna med olika hastighet baserat på deras löslighet i den alltmer polära mobila fasen, figur 2.
Figur 2. Överst – Vid isokratisk eluering (konstant polaritet i mobilfasen) desorberas föreningar långsammare än vid användning av en gradient (nederst). Gradienteluering ger vanligtvis en bättre separation/rening än isokratisk eluering.
En intressant egenskap hos normalfas-kromatografi är att när en förening väl desorberas från medierna adsorberas den aldrig igen eftersom den alltmer polära rörliga fasen företrädesvis adsorberar i dess ställe.
Skillnader i polaritet (bindningsstyrka) mellan föreningar kan vara så subtila som tillägg av en annan funktionell grupp, skillnader i placering av funktionella grupper (Parida, 2006) som på en aromatisk ring, eller så distinkta som föreningar med helt olika strukturer, figur 3.
Figur 3. Separering av föreningar med olika polaritet baserat på typ av funktionell grupp och placering på molekylen. I elutionsordning – naftalen (ingen polär funktionalitet), 1-nitronaftalen, o-nitroanilin, m-nitroanilin, p-nitroanilin. Nitroanilinerna skiljer sig endast åt genom den funktionella nitrogruppens placering i förhållande till aminen.
Så, för att sammanfatta, separationer i normalfas-kromatografi baseras på skillnader i föreningens polaritet (både uppenbara och subtila), deras attraktion till den stationära fasen och deras löslighet i den rörliga fasen. För att erhålla de bästa reningsresultaten rekommenderas lösningsmedelsskanning med hjälp av TLC.
Intresserad av att lära sig mer om flashkromatografi kan du ladda ner vårt whitepaper – Successful Flash Chromatography.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
