COX-1:n lisäksi: aspiriinin vaikutukset verihiutaleiden biologiaan ja mahdolliset kemopreventiomekanismit

Hiutaleilla on kriittinen rooli hemostaasissa, tromboosissa ja verisuonten eheyden ylläpitämisessä. Verihiutaleiden toiminnan riittämätön säätely voi johtaa epätarkoituksenmukaiseen verenvuotoon, kun taas liiallinen toiminta johtaa tromboosiin ja akuutteihin iskeemisiin tapahtumiin. Hyytymisprosessia säätelevät kalvon pinnan glykoproteiinit ja reseptorit, jotka laukaisevat hyytymiskaskadin eksogeenisten vaikuttajien, kuten adenosiinidifosfaatin (ADP), tromboksaani A2:n (TXA2), serotoniinin, kollageenin, trombiinin ja adrenaliinin, sitoutumisen jälkeen. Verihiutaleiden aggregaation perussekvenssi tapahtuu kolmessa vaiheessa: käynnistyminen, laajentuminen ja stabiloituminen. Aloitusvaiheessa verihiutaleet kiinnittyvät altistuneisiin von Willebrand -tekijä (vWF)/kollageenikomplekseihin ja pysyvät verisuonivaurion ja -vasteen kohdalla riittävän kauan käynnistääkseen kollageenin lisäaktivaation. Amplifikaatiolle on ominaista erittymisen ja aggregaation toinen aalto, ja sitä tehostaa edelleen trombiinin, adenosiinidifosfaatin (ADP) ja tromboksaani A2:n (TXA2) verihiutaleiden välityksellä tapahtuva vapautuminen. Toinen aalto merkitsee myös laajentumisvaihetta, jossa vasta saapuneet verihiutaleet kiinnittyvät alkuperäiseen verihiutaleen monokerrokseen. Proteiinireseptorin ja efektorin vuorovaikutuksen jälkeen aktivoituneet verihiutaleet jatkavat aggregoitumista muodostaen siltoja pintaglykoproteiinien, fibrinogeenin, fibriinin ja vWF:n välillä aktivoituneisiin glykoproteiineihin. Tämä stabiloitumisvaihe sisältää myöhempiä signalointitapahtumia verihiutaleiden tulpanmuodostuksessa, joka mahdollistaa verihiutaleaggregaatin vakiintumisen estääkseen sen hajoamisen leikkausvoimien vaikutuksesta kiertävässä veressä.

Signalointi verihiutaleiden aggregaatiossa alkaa verihiutaleiden pinnalla olevien reseptorien aktivoitumisella agonistien, kuten kollageenin, trombiinin, ADP:n, TXA2:n ja adrenaliinin, avulla. Näiden GPCR-reseptorien aktivoituminen johtaa fosfolipaasi A2:n aktivoitumiseen, joka pilkkoo fosfotidyylikoliinia ja muita kalvon fosfolipidejä vapauttaen arakidonaattia glyserolirungon C2-asemasta. Arakidonaatti voidaan muuntaa erilaisiksi prostaglandiineiksi (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α,), jotka välittävät tulehdusta edistävää vastetta. Lisäksi tromboksaanit, kuten TXA2, aiheuttavat verihiutaleiden vapautumista, aggregaatiota ja hyytymistä sekä vahvistavat verihiutaleiden aktivoitumista. Prostaglandiiniendoperoksidisyntaasi-1 (PGSH-1)/syklo-oksygenaasi-1 (COX-1) suorittaa syklo-oksygenaasi- ja peroksidaasireaktioiden alkuvaiheen muuttaakseen arakidonihapon esiastemetaboliiteiksi, prostaglandiini G2:ksi ja prostaglandiini H2:ksi. Näistä muodostuu kemiallisesti muita prostaglandiineja, kuten TXA2, joka välittää suurimman osan verihiutaleiden aiheuttamasta vasteesta. Yhteenveto verihiutaleiden aktivoitumisen aikana tapahtuvista signaalitapahtumista on esitetty kuvassa 3.

Aspiriini moduloi verihiutaleiden aktiivisuutta ja biologiaa-syklo-oksygenaasin esto

Aspiriini estää verihiutaleiden aggregaatiota ja prostaglandiinien vapautumista . Varhaiset tutkimukset, joissa käytettiin asetaattikarbonyylihiilen kohdalla 14C:llä radioleimattua aspiriinia, osoittivat <0,1 % 14C-radiomerkistä päätyi verihiutaleisiin ja että aktiivisuus liittyi pääasiassa kolmeen proteiiniin . Vaikka assosiaatio oli palautumaton, mikä viittaa kovalenttisen sidoksen muodostumiseen, sen todettiin olevan kyllästettävissä biologisesti merkityksellisissä pitoisuuksissa vain yhden 85 kDa:n proteiinin osalta. Kahden muun liukoisen verihiutaleproteiinin asetylaatio ei ollut tyydyttävää, mikä viittaa siihen, että aspiriinista riippuvainen asetylaatio verihiutaleissa on sekä spesifistä että epäspesifistä. Asetyloidun 85 kDa:n entsyymin todettiin myöhemmin olevan prostaglandiiniendoperoksidisyntaasi-1 (PTGS-1/COX-1). Verihiutaleiden COX-1:n estäminen asetyylinsiirrolla on peruuttamatonta, ja esto säilyy koko verihiutaleen 10 päivän eliniän ajan.

COX-1 on bifunktionaalinen entsyymi, joka ilmentyy konstitutiivisesti useimmissa kudoksissa, ja se suorittaa kaksi erilaista ja peräkkäistä reaktiota spatiaalisesti erillisillä, mutta mekanistisesti toisiinsa kytkeytyneillä aktiivisilla alueilla. Normaaleissa soluissa COX-1 on membraanisidonnainen ja upotettu endoplasmisen retikulumin luminaalipinnalle sekä ydinkuoren sisä- ja ulkopinnoille. Verihiutaleet ovat kuitenkin anukleaattisia solufragmentteja, ja sen sijaan ne ilmentävät COX-1-proteiineja tiheässä tubulaarisessa kalvojärjestelmässä, joka syntyy demarkaattisesta kalvojärjestelmästä verihiutaleiden biogeneesin aikana. Tällä tiheällä tubulaarisella kalvojärjestelmällä on tärkeä rooli verihiutaleiden aktivoitumisessa, ja se on verihiutaleiden eikosanoidisynteesin pääpaikka. 85 kDa:n COX-1-homodimeeri sisältää 576 jäämää, ja se on glykosyloitunut eri lysiinisivuketjuissa. Vaikka COX-1 on yksi niistä harvoista proteiineista, jotka on yhdistetty aspiriinin estoon sen aktiivisessa kohdassa, on tärkeää huomata, että lysiinijäämien glykosylaatio tehostaa muiden jäämien asetylaatiota, ja tässä tapauksessa COX-1:n aktiivisen kohdan seriinin . Kukin COX-1:n rakenteellinen alayksikkö sisältää kolme taittumisaluetta: epidermisen kasvutekijän alue, kalvoa sitova alue ja katalyyttinen aktiivinen alue. Katalyyttinen domeeni sisältää syklooksygenaasi-kohdan, joka suorittaa arakidonihapon di-hapettumisen hydroksyyliendoperoksidiksi prostaglandiini G2:ksi (PGG2), kun taas viereinen peroksidaasin aktiivinen kohta suorittaa PGG2:n pelkistämisen PGH2:ksi. Kalvoaktiivisen domeenin vastapäätä, katalyyttisen domeenin sisällä, on peroksidaasin aktiivinen alue, jonka matalaan rakoon on sitoutunut hemi-kofaktori. Hemiryhmä on välttämätön tyrosyyliradikaalin aktivoimiseksi syklooksygenaasin aktiivisessa kohdassa arakidonihapon lipidiperoksidaatiota varten. Syklooksygenaasin aktiivinen alue sijaitsee hemiä sitovaa peroksidaasikohdetta vastapäätä kalvoa sitovasta domeenista lähtevän tunnelin yläosassa. Arakidonihappo sitoutuu tähän kohtaan, jolloin substraatin karboksylaatti siirtyy uudelleen paikalleen dioksigenaatiota varten. Rakennetutkimukset lampaan COX-1:stä, jota on käsitelty 2-bromiasetoksibentsoehapolla, viittaavat siihen, että arakidonihapon sitoutuminen aktiivisen paikan syklooksygenaasipäähän ja siten arakidonihapon kaksoishapettuminen estyvät seriini 530:n asetylaation seurauksena .

Aktiivisen paikan seriinin asetylaatiolla aspiriinilla tapahtuva COX-1:n peruuttamaton inhibitio vähentää dramaattisesti prostaglandiinien biosynteesiä. Verihiutaleissa COX-1:tä ei voida nopeasti regeneroida, ja näin ollen COX-1:n aktiivisuus voidaan palauttaa vain uuden verihiutaleen biogeneesin avulla. Tromboksaani A2:n, prostaglandiini E2:n ja prostasykliinin (PGI2) synteesi vaikuttaa voimakkaimmin aspiriinilla käsitellyissä verihiutaleissa, mikä johtaa hyytymismekanismin puutteeseen , vähentyneeseen mahalaukun limakalvon eritykseen, lisääntyneeseen mahahappojen aiheuttamaan ärsytykseen sekä muuttuneeseen patofysiologiseen hyytymiseen ja verisuonten laajenemiseen/ supistumiseen.

COX-2 on 60-prosenttisesti identtinen COX-1:n kanssa aminohappojen tasolla, ja niiden kolmiulotteiset rakenteet ovat melkeinpä päällekkäisiä. COX-2 on indusoituva, ja sen ilmentymistä tehostavat samat prostaglandiinit, joita COX-1 syntetisoi verihiutaleissa ja epiteelisoluissa. COX-2 yliekspressoituu megakaryosytopoeesin aikana, ja se on tunnistettu kroonista myelooista leukemiaa ja polysytemia veraa sairastavien potilaiden poikkileikkausluukudosnäytteistä. Toisessa tutkimuksessa luonnehdittiin COX-2:n ilmentymistasoja verihiutaleissa suhteessa COX-1:een mittaamalla suoraan mRNA-tasoja . Havaittiin, että verihiutaleet ilmentävät COX-2:ta tasoilla, jotka ovat verrattavissa joihinkin pahanlaatuisiin epiteelisoluihin, vaikkakin huomattavasti alhaisemmilla tasoilla kuin verihiutaleiden COX-1. COX-2:n asetylaatio endoteeli- ja epiteelisoluissa estää PGI2:n ja PGE2:n biosynteesiä, joilla on erilaisia vaikutuksia myöhempiin prosesseihin, kuten tulehdukseen. Vaikka COX-1:n ja COX-2:n aspiriinivälitteinen esto johtaa erilaisiin profiileihin prostaglandiinien biosynteesin estämisessä, eston perusta molemmissa tapauksissa on prostaglandiinien endoperoksidisyntaasin esto ja siitä seuraava monifunktionaalisen prostaglandiini H2:n määrän väheneminen. COX-3:n rooli verihiutaleiden biologian yhteydessä on edelleen tuntematon.

Asperiinin COX:ää estävä vaikutus riippuu annetusta annoksesta. Pienet annokset, jotka vaihtelevat 75-300 mg:n välillä, johtavat verihiutaleiden TXA2-tuotannon selektiiviseen estoon tukahduttamatta prostasykliiniä (PGI2), joka on yleinen verihiutaleiden antagonisti ja verisuonia laajentava aine. PGI2:n oletetaan olevan peräisin pääasiassa verisuonten COX-2:sta, mikä viittaa siihen, että COX-2:n esto on vähäistä pienillä annoksilla. Suuremmilla annoksilla (>1200 mg) on analgeettisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia, jotka liittyvät COX-1:n ja COX-2:n patofysiologiseen estoon. On tärkeää huomata, että COX-2 voi myös käyttää arakidonihappoa lipoksiinien, erityisesti 15-hydroksieikosatetraeenihapon (15-HETE) synteesiin. Tämän biosynteettisen reitin odotetaan säilyvän koskemattomana myös COX-2:n asetyloinnin jälkeen. Tämä COX-toiminnan erilainen estäminen voidaan osittain selittää aspiriinin suhteellisella estävällä teholla. Vaikka aspiriinia pidetään tyypillisesti epäspesifisenä COX:n estäjänä, se on erittäin selektiivinen COX-1:lle ja COX-2:lle. Kuten Blanco ym. toteavat, aspiriinin IC50-arvo COX-1:lle on noin 3,5 μM, kun taas IC50-arvo COX-2:lle on noin 30 μM. Vaikka molempien entsyymien aspiriinille reagoivat aktiiviset alueet ovat homologisia, COX-2:n Ser-516:n asetylointi johtaa katalyyttisen aktiivisuuden vain osittaiseen estoon. Kun otetaan huomioon seerumin saavutettavissa oleva pitoisuus pienillä annoksilla (~7 μM), on epätodennäköistä, että COX-2 on yli 5 % asetyloitunut, kun taas verihiutaleista peräisin oleva COX-1 on todennäköisesti >70 % asetyloitunut . Tämä viittaa siihen, että säännöllinen matala-annoksinen aspiriini ylläpitää poikkeuksetta COX-1:n estoa verenkierrossa olevissa verihiutaleissa, ja sen vaikutus perifeerisen COX-2:n estoon on minimaalinen. Taulukossa 1 on yhteenveto pienen ja suuren annoksen aspiriinin vaikutuksista COX-aktiivisuuteen veressä ja kudoksissa.

Aspiriinista riippuvainen verihiutaleiden vuorovaikutusproteiinien asetylaatio veressä

Hiutaleet ilmentävät erilaisia pintareseptoreita, joiden avulla ne voivat olla vuorovaikutuksessa plasman ja veren valkuaisaineiden, taudinaiheuttajien, taudinaiheuttajiin liittyvien tuotteiden ja tulehtuneen endoteelin kanssa. Pintareseptorit ovat ratkaisevan tärkeitä verihiutaleiden tarttumiselle vahingoittuneeseen verisuonistoon, hyytyvän trombin muodostumiselle ja aktivoitumiselle useiden metabolisten efektoreiden kautta. Verihiutaleiden ja muiden systeemisessä verenkierrossa olevien veriproteiinien välinen vuorovaikutus on ratkaisevan tärkeää hyytymisreaktion toteuttamisen ja ratkaisemisen kannalta. Mielenkiintoista on, että monet näistä proteiineista muuttuvat myös aspiriinin vaikutuksesta.

Fibrinogeeni

Farr ja työtoverit tunnistivat vuonna 1968 fibrinogeenin aspiriinin asetylaatiokohteeksi. Fibrinogeenia esiintyy liukoisena proteiinina plasmassa sekä solunsisäisenä kalvoihin assosioituneena proteiinina verihiutaleissa . Fibrinogeenin osuus verihiutaleiden kokonaisproteiinista on 3-10 prosenttia (lähes 25 prosenttia on α-granulaatioissa), ja se vapautuu verihiutaleiden aktivoituessa. Fibrinogeenin on raportoitu asetyloituvan in vitro ja in vivo aspiriinin vaikutuksesta, jolloin muodostuu ε-N-asetyylilysiinijohdannaisia, ja keskimäärin kolme fibrinogeenin jäännöstä muuttuu. Asetyloitunut fibrinogeeni lisää fibriinihyytymien alttiutta lyysiin .

Albumiini

Albumiinin modifikaatio aspiriinin asetylaatiolla on tunnettu jo yli puoli vuosisataa . Useissa Farrin ja työtovereiden tutkimuksissa on arvioitu mahdollisia konformaatiovaikutuksia, jotka asetyyliryhmän lisäys albumiiniin saa aikaan . Kirjallisuudessa eniten käsitelty seerumin albumiinin modifikaatio keskittyy lysiinijäämien asetylaatioon . Ihmisen seerumin albumiinin on myös havaittu vaikuttavan verihiutaleiden hyytymismekanismeihin vaikuttamalla kalsiumin säätelyyn .

Hemoglobiini

Veriplasman ja verenkierron kenties tärkeimmällä komponentilla, hemoglobiinilla, tapahtuu aspiriini-riippuvaista asetylaatiota in vitro, ja sen oletetaan kokevan samankaltaisia modifikaatioita suurilla aspiriiniannoksilla in vivo . Tutkimukset hemoglobiinin asetylaatiosta aspiriinin vaikutuksesta ovat osoittaneet, että proteiinien glykoituminen vähenee, ja korkeiden glukoosipitoisuuksien läsnä ollessa hemoglobiinin asetylaatio aspiriinin vaikutuksesta lisääntyy, ja tämä vaikutus on havaittu myös seerumin albumiinissa. Aspiriini pystyy asetyloimaan erilaisia hemoglobiinin α- ja β-ketjujen lysiinijäämiä vaikuttamatta sen rakenteelliseen konformaatioon tai hapen sidonta- ja kuljetustoimintoihin . Hemoglobiini pystyy käynnistämään verihiutaleiden aggregaation vuorovaikutuksen kautta GP1βα:n kanssa, joka on yksi monista verihiutaleiden pintareseptoriproteiineista. Suhteellisen alhaiset hemoglobiinipitoisuudet kykenevät myös aiheuttamaan verihiutaleiden aggregaatiota, vaikka aspiriinin aiheuttaman hemoglobiinin asetyloinnin vaikutusta hemoglobiinin ja verihiutaleiden välisiin vuorovaikutuksiin ei tunneta .

Asperiinin vaikutus verihiutaleiden vapautumiseen: vaikutukset syöpään

Syklooksygenaasin esto ja samanaikainen tromboksaanin biosynteesin väheneminen johtavat verihiutaleiden vähentyneeseen aggregaatioon, P-selektiinin ilmentymiseen ja heikentyneeseen hyytymistoimintaan. Sen lisäksi, että aspiriini vaikuttaa verihiutaleiden aggregaatioon, sen on osoitettu muuttavan myös verihiutaleissa ilmentyvien ja erittyvien proteiinien profiilia. Monet näistä proteiineista osallistuvat hyytymisreaktion välittämiseen ja immuunisolujen rekrytointiin vammakohtaan. Monilla verihiutaleiden ”vapautuvassa” proteiinissa esiintyvillä proteiineilla voi kuitenkin olla myös tärkeä rooli angiogeneesin ja kasvainten kasvun edistämisessä.

Aspiriinin on osoitettu estävän interleukiini 7:n (IL-7) vapautumista verihiutaleista, joita on stimuloitu trombiinireseptoria aktivoivalla peptidillä (SFLLRN). Aspiriinia käyttävillä terveillä potilailla havaittiin myös merkittävästi alhaisempi plasman IL-7 . Tämän pro-inflammatorisen sytokiinin on osoitettu olevan avainasemassa sekä B- että T-solujen kypsymisessä . IL-7:llä on myös osoitettu olevan sekä pro- että antituumorivaikutuksia, joista jälkimmäinen johtuu pääasiassa apoptoosin estämisestä BCL2:n säätelyn kautta. Verihiutaleet ovat myös pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF:n ja angiopoetiini-1:n, lähde, ja on jonkin verran näyttöä siitä, että säännöllinen aspiriinin käyttö vähentää molempien tekijöiden pitoisuutta plasmassa, vaikka on epäselvää, johtuuko tämä pelkästään verihiutaleiden vapautumisesta . Tätä tukee kliininen tutkimus, jossa aspiriinihoito näytti suosivan yleistä antiangiogeenistä tasapainoa rintasyöpää sairastavilla naisilla, jotka saivat tamoksifeeniä, mitä arvioitiin plasman VEGF-pitoisuuksien vähenemisellä ja trombiinireseptorivälitteisen TSP-1:n ja VEGF:n vapautumisen vähenemisellä verihiutaleista .

Coppinger ym. tekivät massaspektrometriaan perustuvan proteomitutkimuksen tutkiakseen tarkemmin verihiutaleiden vapautuvan proteosyyttiraaka-aineen koostumuksen koostumusta aspiriinihoidon funktiona . Tässä tutkimuksessa ihmisen verihiutaleiden käsittely matala-annoksisella aspiriinilla (20 μM) sen jälkeen, kun niitä oli stimuloitu kollageenilla, SFLLRN:llä tai ADP:llä, johti laajaan vähenemiseen vapautuvasta proteiinista löytyvän proteiinin määrässä, vaikkakin tämän vähenemisen laajuus riippui käytetystä agonistista. Aspiriinihoidon havaittiin myös vähentävän kasvua säätelevän kasvutekijän (GRO), verihiutaleista peräisin olevan kasvutekijän (PDGF), angiogeniinin, RANTES:n ja onkostatiini M:n (OSM) pitoisuuksia verihiutaleiden releasaatissa erityisesti kollageenistimulaation jälkeen. Vaikka nämä ja muut verihiutaleista peräisin olevat sytokiinit (esim, CXCL4 ja CTGF ), ovat kriittisiä verisuonten korjautumisen säätelyssä, niillä on myös rooli kasvainten synnyn, angiogeneesin ja etäpesäkkeiden synnyn vauhdittajina.

Asperiinin asetylooman määrittely

Kuten edellä on todettu, asperiinin tiedetään asetyloivan monenlaisia solunsisäisiä ja solunulkoisia proteiinikohteita erityisesti sivuketjujen ja N-terminaalisten aminoryhmien kohdalla. Valitettavasti ei ole tehty kattavia proteomitutkimuksia, joissa olisi erityisesti käsitelty kysymystä siitä, mitä verihiutaleproteiineja COX-entsyymien lisäksi aspiriini asetyloi tai mikä on näiden ei-kanonisten asetylaatioiden biologinen merkitys. Tässä jaksossa tarkastelemme aiempia proteomitutkimuksia, joissa on pyritty tunnistamaan aspiriinin välittämän asetylaation ei-kanonisia kohteita, ja pyrimme suhteuttamaan ne verihiutaleiden proteomiikan nykytilaan.

On tehty lukuisia proteomitutkimuksia, joissa on pyritty määrittelemään joukko proteiineja, jotka fysiologiset aspiriinipitoisuudet asetyloivat fysiologisilla aspiriinipitoisuuksilla eri solulinjoissa. Bhat ja työtoverit tunnistivat 33 soluproteiinia, jotka aspiriini asetyloi sen jälkeen, kun ne oli rikastettu anti-asetyylilysiini-vasta-aineella . Massaspektrometrinen analyysi tunnisti asetyloituja sytoskeletaalisia ja metabolisia entsyymejä, mukaan lukien glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi (G6PD), laktaattidehydrogenaasi, enolaasi, pyruvaattikinaasi ja transketolaasi, vaikkakin vain G6PD:n aspiraattivälitteinen asetylaatio inhiboitui merkittävästi in vitro. Tämä viittaa siihen, että aspiriini saattaa estää virtauksen pentoosifosfaattireitin kautta, vaikka lisätutkimukset ovat tarpeen tämän vahvistamiseksi. Tämä ryhmä osoitti myös, että aspiriini asetyloi p53:a, mikä johtaa lisääntyneeseen DNA-sitoutumiseen, p21Cip:n ilmentymiseen ja apoptoottisen solukuoleman tehostumiseen kamptotetsiinin läsnä ollessa. Vaikka nämä vaikutukset on osoitettu useissa kasvainsolulinjoissa, p53:n puuttuminen verihiutaleiden proteomista sekä funktionaalisen genomin puuttuminen verihiutaleista viittaavat siihen, että p53:n asetylaatiolla on minimaalinen vaikutus verihiutaleiden biologiaan.

Viimeaikaiset edistysaskeleet korkean läpimenotehon proteomiikassa yhdistettynä aktiivisuuteen pohjautuviin koettimiin ovat johtaneet satojen oletettujen aspiriinivälitteisten asetylaatioiden tunnistamiseen. Eräässä lähestymistavassa aspiriinin asetyyliryhmä korvattiin pentiinihapolla, jolloin saatiin aikaan alkyniä sisältävä aspiriinijohdannainen (AspAlk) . Toisin kuin aspiriini, AspAlk:n suorittama asetyylinsiirto johtaa atsidireaktiivisen alkyynin sisällyttämiseen kohtiin, jotka aspiriini tavallisesti asetyloi. AspAlk:n inkuboinnin jälkeen elävien HCT-15-solujen kanssa AspAlk:n asetyloimat proteiinit merkittiin biotiinilla kuparikatalysoidun atsidi-alkyyni-sykladition (CuAAC) avulla ja eristettiin streptavidiinipulldownilla. LC-MS-analyysin jälkeen kirjoittajat pystyivät tunnistamaan 120 proteiinia, joissa AspAlk-asetylaatio oli rikastunut merkittävästi DMSO-kontrolleihin verrattuna. Tässä tutkimuksessa eniten rikastuneita proteiiniluokkia olivat proteiinisynteesiin ja -foldaukseen osallistuvat proteiinit, sytoskelettiproteiinit ja metaboliset entsyymit. Myös histoniasetylaatiota havaittiin ja se vahvistettiin biokemiallisesti. Shen, Lin ja työtoverit laajensivat tätä työtä hiljattain julkaistussa käsikirjoituksessa, jossa he käyttivät happoa leimautuvaa biotiiniasidia helpottamaan AspAlk-modifioitujen proteiinien talteenottoa biotiinikonjugaation ja streptavidiinipulldownin jälkeen. Tämän strategian avulla tunnistettiin yli 500 asetyloitua proteiinia. Kohdeluettelon polkuanalyysi osoitti merkittävää asetylaatiota mTOR-reitillä, joka ohjaa monia keskeisiä solutoimintoja, kuten proteiinisynteesiä ja autofagiaa. Kirjoittajat validoivat alkuperäiset proteomihavainnot osoittamalla, että sekä HCT116-kolorektaalisolujen että hiiren alkion fibroblastien aspiriinihoito vähensi de novo -proteiinisynteesiä ja indusoi autofagiaa. Aspiriinin aiheuttama autofagian induktio on erityisen kiinnostavaa, kun otetaan huomioon äskettäinen tutkimus, joka osoittaa, että autofagia on välttämätöntä verihiutaleiden normaalille toiminnalle ja että se stimuloituu verihiutaleiden stimulaation aikana. Lisäksi toimiva autofaginen koneisto on välttämätön verihiutaleiden antikoagulanttiaktiivisuudelle, kuten on osoitettu hiirimalleissa, joissa verihiutaleiden Atg7 on poistettu käytöstä. Vaikka aspiriinivälitteisen asetylaation ja verihiutaleiden autofagian indusoimisen välinen toiminnallinen suhde on edelleen epäselvä, pentoosifosfaattireitin (PPP) estäminen G6PD:n eston avulla tai mitokondriohengityksen häiritseminen malaattidehydrogenaasin ja/tai isositraattidehydrogenaasin asetylaation avulla voi lisätä solunsisäistä oksidatiivista kuormitusta, joka on tunnetusti laukaiseva tekijä autofagialle . Vaihtoehtoisesti on runsaasti näyttöä chaperonien, erityisesti lämpösokkiproteiinien ja peptidyyliprolyyli-isomeraasien aspiriinivälitteisestä asetylaatiosta, joka voi heikentää proteiinien asianmukaista taittumista ja laukaista virheellisesti taittuneiden proteiinien autofagisen poistamisen.

Toisessa hiljattain julkaistussa proteomitutkimuksessa, jonka tekivät Tatham ja työtoverit, käytettiin 3H-merkittyä aspiriinia tunnistamaan massiivispektrometriamenetelmällä aspiriinivälitteisiä asetylaatiokohtiin liittyviä kohtia HeLa-soluissa . Tässä lähestymistavassa tritioidun aspiriinin käyttö johtaa +3 Da:n massasiirtymään suhteessa normaaliin asetaattiin ja mahdollistaa tarkemman erottelun aspiriinivälitteisen asetylaation ja endogeenisen asetylaation välillä. Tämä lähestymistapa paljasti yli 12 000 aspiriinivälitteistä asetylaatiota yli 3700 ainutlaatuisessa proteiinissa. Mielenkiintoista on, että monien asperiinin asetyloimien proteiinien havaittiin olevan asetyloituja myös ilman asperiinia, mikä viittaa siihen, että asperiini ”vahvistaa” olemassa olevia proteiinien asetylaatiokohtia. Tämän tutkimuksen tekijät havaitsivat myös, että useimmissa tapauksissa aspiriini asetyloi <1 % kaikkien tietyn proteiinin asetylaatiokohtien kokonaismäärästä, mikä viittaa siihen, että epäspesifisen aspiriinivälitteisen asetylaation stoikiometria voi olla riittämätön merkittävien biologisten vaikutusten aikaansaamiseksi ilman endogeenisen deasetylaasitoiminnan farmakologista estämistä.

Tässä tutkimuksessa osoitettiin myös histoniproteiinien merkittävää asetylaatiota, jossa suurin osa aspiriinivälitteisestä asetylaatiosta tapahtui histoniytimessä eikä N-terminaalisissa hännissä. Histonien asetylaatiota on havaittu useissa proteomitutkimuksissa, ja se ei ole jokseenkin yllättävää, kun otetaan huomioon histonien nukleofiilisten lysiinijäämien suuri osuus, joilla on merkittävä rooli sähköstaattisessa DNA:n sitoutumisessa. Histoniasetylaatiolla on kriittinen rooli DNA:n sitoutumisessa, ja se on tunnettu epigeneettinen mekanismi geeniekspression säätelyssä. Vaikka verihiutaleet ovat anukleaatteja, aiemmissa transkriptomitutkimuksissa on tunnistettu histonispesifisiä transkriptejä verihiutaleissa, erityisesti H2A, H2B, H3 ja H4 . Vaikka histonien asetylaatio aspiriinin vaikutuksesta on osoitettu vakuuttavasti, on tärkeää huomata, että histonien ilmentymistä ei ole vahvistettu verihiutaleissa. Pikemminkin on oletettu, että histonitranskriptien esiintyminen verihiutaleissa on artefakti, joka johtuu verihiutaleita synnyttävien megakaryosyyttien poikkeavasta solujen kiertokulusta . Vielä tärkeämpää on, että histonien rooli ekspression kontrolloinnissa DNA-tasolla puuttuu anukleaattisissa verihiutaleissa.

Asperiinin vaikutukset verihiutaleiden aineenvaihduntaan

Hiutaleiden aineenvaihdunta on ensisijaisesti oksidatiivista toisin kuin neutrofiilien, jotka ovat ensisijaisesti glykolyyttisiä . Anaerobisen glykolyysin esto ei vähennä ATP:tä eikä estä verihiutaleiden toimintaa. On osoitettu, että trikarboksyylihappokierron (TCA) entsyymien ja elektroninsiirtoketjun (ETC) komponenttien asetylaatio on yleinen säätelymenetelmä erityisesti aineenvaihduntaan osallistuville entsyymeille, kuten malaattidehydrogenaasille hiiliaineenvaihdunnassa , rasva-aineenvaihdunnan säätelyssä ja ureakierrossa ammoniakin detoksifikaatiossa . Tästä seuraa, että TCA-syklin entsyymien ja ETC-komponenttien asetylaatiolla voi olla merkittävä vaikutus verihiutaleiden bioenergetiikkaan. Aspiriinin asetylaatiota koskevissa proteomitutkimuksissa on johdonmukaisesti havaittu, että aspiriinivälitteinen asetylaatio koskee malaattidehydrogenaasia, joka säätelee siirtymistä hiilihydraatti- ja rasvahapposynteesin välillä, ja isositraattidehydrogenaasia, jota säädellään mitokondrioissa deasetylaatiolla sirtuiiniproteiinien (Sirt3- ja Sirt5-proteiinien) kautta . Sirtuin-deasetylaasiaktiivisuus liittyy useisiin TCA-entsyymeihin mitokondriomatriisissa, ja sen uskotaan säätelevän antioksidanttiregeneraatiota, TCA-virran säätelyä ja anapleuroosia . Vaikka tätä katsausta laadittaessa ja painettaessa emme ole tietoisia mistään tutkimuksista, joissa käsiteltäisiin suoraan metabolisten entsyymien aspiriinivälitteisen asetylaation laajuutta tai aspiriinin vaikutusta metaboliavirtoihin, proteomitodisteet viittaavat siihen, että tämä voi olla tärkeä aspiriinin ei-kanoninen vaikutus verihiutaleiden biokemiaan.

Asperiinin vaikutus verihiutaleiden lokalisaatioon kasvaimissa

Uutta näyttöä on saatu siitä, että verihiutaleilla itsellään voi olla merkittävä rooli karsinogeneesissä ja erityisesti etäpesäkkeiden kehittymisessä. Hiirten etäpesäkemalleissa, joissa kasvainsoluja ruiskutetaan suoraan verenkiertoon, verenkierrossa olevien verihiutaleiden määrän vähentämiseen tähtäävät strategiat ovat osoittautuneet tehokkaiksi kasvaintaakan vähentämisessä . Muissa metastaattisissa malleissa tehdyissä tutkimuksissa, joissa liukoista fibriiniä ja kasvainsoluja ruiskutettiin yhdessä hyytymisvaikutuksen tehostamiseksi, havaittiin metastaasien lisääntynyt esiintyminen in vivo . Näitä tutkimuksia tukivat in vitro -kokeet, joissa liukoinen fibriini lisäsi verihiutaleiden ja kasvainsolujen välistä vuorovaikutusta viljelyolosuhteissa . Nämä tutkimukset tukevat hypoteesia, jonka mukaan verihiutaleiden aggregaation aktivoituminen lisää odotetun fibriinin lisääntymisen lisäksi verihiutaleiden kiinnittymistä kasvainsoluihin ja helpottaa metastaattista leviämistä. Fibriinin lisäksi lisätutkimuksissa on tarkasteltu trombiinin, PAR-1:n ja hyytymistekijä VII:n (FVII) roolia ja niiden yhteyttä syöpäsolujen elinkelpoisuuden lisääntymiseen , syövän kasvuun ja leviämiseen , kasvaimen pahanlaatuisuuden lisääntymiseen ja etäpesäkkeiden tukemiseen .

Systeemisessä verenkierrossa olevien kasvainsolujen biologian muokkaamisen lisäksi verihiutaleiden on osoitettu olevan myös tärkeässä roolissa kasvainsolujen kasvussa. Eräässä tutkimuksessa osoitettiin, että aspiriini vähensi merkittävästi munasarjasyövän solujen proliferaatioastetta sekä in vitro että in vivo . Samassa tutkimuksessa havaittiin myös, että verihiutaleiden aktivointi voi lisätä proliferaatiota ja kasvainsolujen kasvua kasvainsolujen ja verihiutaleiden yhteisinkuboinnin jälkeen. Verihiutaleiden adheesioreseptorien, kuten GPIβα:n, GPIIβIIIα:n ja P-selektiinin, estäminen ei kuitenkaan vähentänyt verihiutaleiden proliferatiivisia vaikutuksia. Tämä viittaa siihen, että verihiutaleiden erittämillä proteiineilla ja muilla tekijöillä voi olla merkitystä kasvainsolujen kasvun säätelyssä. Esimerkiksi havaittiin, että verihiutaleiden TGF-β1:n vähentäminen vähensi verihiutaleille altistettujen munasarjasyöpäsolujen proliferaatiota . Lisäksi on osoitettu, että aspiriini ehkäisee kolorektaalisyövän etäpesäkkeitä COX-1-mekanismin avulla, johon liittyy TXA2 ja PGE2 , mikä viittaa siihen, että aktivoituneet verihiutaleet voivat tukea etäpesäkkeiden muodostumista COX-1-riippuvaisen prostaglandiinituotannon kautta. Lopuksi on osoitettu, että uusi aspiriini-fosfotidyylikoliinikonjugaatti (Aspirin-PC) häiritsee verihiutaleiden ja kasvainsolujen aiheuttamaa epiteeli-mesenkymaalista siirtymää (EMT) VEGF:n ja tromboksaanin vapautumisen kautta. Tämän formulaation havaittiin myös estävän solujen proliferaatiota ja angiogeneesiä ja lisäävän samalla apoptoosia munasarja- ja kolorektaalisyöpäsolumalleissa .