Biotagen asiakaskunnallamme on mielenkiintoinen ja monipuolinen tausta korkeasti koulutetuista synteettisistä kemisteistä luonnontuotekemian asiantuntijoihin ja niihin, jotka ovat vasta aloittamassa matkaansa kemian parissa. Olen oppinut yli 40-vuotisen urani aikana kromatografian ”taiteen” parissa, että monet näistä hienoista ihmisistä eivät ymmärrä kromatografian periaatteita. Uskon, että tämä ymmärryksen puute johtuu vain heidän perusopintojensa opetussuunnitelmasta, jossa erotusoppia käytetään työkaluna laboratoriotöissä, mutta periaatteita sen takana, miksi seoksen komponentit erottuvat (tai eivät erotu), ei ehkä selitetä, ymmärretä tai tutkita tehokkaasti.
Kromatografian perustyyppejä on neljä, mukaan lukien:
- Kaasu-neste-kromatografia (GC)
- Neste-neste-kromatografia (LLC)
- Neste-kiinteä-kromatografia (LSC)
- Kokoa poissulkeva/geelipermeaatiokromatografia (SEC/GPC)
Tässä postauksessa keskityn neste-kiinteä-kromatografiaan.
Neste-kiinteä-kromatografia
Neste-kiinteä-kromatografia
Neste-kiinteä-kromatografia on edellä mainituista tekniikoista suosituin, koska se on käyttökelpoinen puolihaihtuvien ja haihtumattomien yhdisteiden erottamiseen. Koska lämpöä ei tarvita yhdisteiden eluoimiseksi erotuskolonnista (kuten GC:ssä), neste-kiinteä-kromatografia edellyttää liuottimen tai sekoittuvien liuottimien seoksen käyttöä, joilla on erilainen polariteetti, jotta näytteen kemialliset komponentit saadaan erottumaan toisistaan.
Neste-kiinteä-kiinteä-kromatografiassa näyte ladataan kiinteälle alustalle tai stationäärifaasille. Näytteen komponentit sitoutuvat stationäärifaasiin, mutta eriasteisesti. Vuorovaikutuksen määrä stationäärifaasin kanssa säätelee erotuksen nopeutta ja tehokkuutta. Mitä enemmän vetovoimaa stationäärifaasiin kohdistuu, sitä kauemmin yhdisteiden eluoituminen kestää. Vahvasti sitoutuneiden yhdisteiden eluoitumisen helpottamiseksi liuottimen suhdetta on muutettava (vahvuus kasvaa) ajan myötä.
LSC:n piirissä on useita erilaisia kromatografisia tekniikoita…
- Paperikromatografia (PC)
- Ohytkerroskromatografia (TLC)
- Korkea…suorituskykyinen nestekromatografia (HPLC)
- Flash-kromatografia (FC)
- Ioninvaihtokromatografia (IX)
- Affiniteettikromatografia (AC)
- Kiraalinen kromatografia (CC)
- Superkriittisen nesteen kromatografia (SFC)
Tässä postauksessa keskityn käsittelemään flashkikromatografiaa, jonka periaatteet ovat samat kuin HPLC:n. Molemmissa käytetään pysyvällä faasilla täytettyjä kolonneja, joihin näyte ruiskutetaan ja joiden läpi liuotin pumpataan. Flash-kromatografiassa käytetään kuitenkin suurempia kolonneja kuin HPLC:ssä, joka on lähinnä analyyttinen erotustekniikka.
Flash-kromatografia on preparatiivinen kromatografiatekniikka, jonka kolonnit on myös täytetty kiinteällä alustalla tai väliaineella, jonka hiukkaskoko on suurempi kuin HPLC-kolonnien. Näiden väliaineen ja kolonnin kokoerojen ansiosta flash-kolonnit pystyvät puhdistamaan enemmän yhdisteitä grammaa kohti kuin HPLC.
- Flash-kromatografiassa käytetään 15 µm:stä jopa 60 µm:n suuruisia väliainepartikkeleita
- HPLC:ssä käytetään 1,7 µm:stä 10 µm:n suuruisia väliainepartikkeleita
Mitä tapahtuu kolonnin sisäpuolella
Suurimmaksi osaksi flash-kromatografiassa ja myöskin HPLC:ssä käytetään joko normaali-faasista- tai käänteis-faasista – menetelmää. Näiden menetelmien väliset erot ovat stationäärifaasikemiassa ja liuottimissa, joita käytetään seoksen yksittäisten kemiallisten komponenttien erottamiseen.
- Normaalifaasissa käytetään liikkuvan faasin apuna poolittomia ja kohtalaisesti liukenevia liuottimia (esim. heksaania ja etyyliasetaattia) ja polaarinen väliaine (esim.esim. piidioksidi) stationäärifaasina
- Reversed-phase on juuri päinvastainen menetelmä, jossa käytetään polaarisia liuottimia ja epäpolaarista stationäärifaasia
Niin kuin nämä menetelmät ovat toistensa ”polaarisia” vastakohtia (sanaleikki on tarkoitettu), useimpien yhdisteiden eluutiojärjestys on käänteinen. Tässä tapahtuu kromatografisten erotusten taustalla oleva kemia.
Keskitytään nyt normaalifaasiin.
Normaalifaasikromatografia
Normaalifaasikromatografiassa seoksen (esim. reaktioseos, luonnontuoteuute jne.) sisältämät kemialliset yhdisteet liuotetaan sopivaan liuottimeen ja ruiskutetaan kolonniin. Kun seos koskettaa polaarista stationäärifaasia, vaikkapa piidioksidia, seoksen yhdisteet ja niiden liuotin kilpailevat liikkuvan faasin kanssa piidioksidin sitoutumispaikoista. Mitä polaarisempi kemikaali on, sitä voimakkaammin se vetää piidioksidia puoleensa. Tätä vetovoimaa kutsutaan adsorptioksi (eri asia kuin absorptio).
Adsorptiota tapahtuu, kun sieni tai paperipyyhe on vuorovaikutuksessa nesteen kanssa. Adsorptio on fysikaalisten ja kemiallisten vuorovaikutusten yhdistelmä, jossa piidioksidin polaarinen pinta sitoo kemiallisesti kemialliset komponentit, joiden kanssa se on kosketuksissa, useimmiten vetysidokseksi ja van der Wallsin voimiksi kutsuttujen ilmiöiden ansiosta.
Kun jokin kemikaali on vuorovaikutuksessa kuivan piidioksidin kanssa (kuten uudessa flash-pylväässä käytetään), tapahtuu adsorptiota. Tämä vuorovaikutus vapauttaa lämpöä, mikä voi aiheuttaa ongelmia yhdisteen stabiilisuudessa ja kromatografisissa tuloksissa. Tästä syystä silikakolonnit tyypillisesti tasapainotetaan (esikostutetaan) matalapolarisella liuottimella ennen näytteen syöttämistä. Vähäpolaariset liuottimet (esim. heksaani, heptaani, sykloheksaani) ovat heikkoja liuottimia, eivätkä ne adsorboidu hyvin piidioksidiin tai muihin polaarisiin väliaineisiin.
Piidioksidin pintakemia on hydroksyyliryhmien (silanolien) ja silyylieetterien sekoitus, kuva 1. Nämä funktionaaliset ryhmät ovat polaarisia, niiden ajatellaan olevan negatiivisesti varautuneita, ja ne adsorboivat elektronipuutteisia yhdisteitä. Aromaattisten yhdisteiden pi-pilvet voivat adsorption aikana sitoutua vetysidoksella piidioksidin hydroksyyliryhmiin.1
Kuva 1. Kromatografisen piidioksidin kemia koostuu silanolien ja silyylieetterifunktioiden seoksesta. Nämä osat sitoutuvat kemikaaleihin vetysidoksen/adsorption avulla.
Hyvän näytekomponenttien sitoutumisen (adsorption) varmistamiseksi puhdistettava näyte on joko liuotettava ja ladattava kolonniin heikkoon liuottimeen (nestemäinen lataus) tai liuotettava vahvempaan (polaariseen) liuottimeen, sekoitettava inerttiin väliaineeseen (esim. piidioksidi, diatomiinimaasälpä), kuivattava ja pakattava toiseen kolonniin, joka on sijoitettu puhdistuskolonnin kanssa samansuuntaiseen linjastoon (kuiva lataus). Kuivalatauksella eliminoidaan monet ongelmat, joita esiintyy nestemäistä latausta käytettäessä, erityisesti jos näyte on liuotettu polaariseen liuottimeen.
Näytteen latauksen jälkeen lisätään liikkuvan faasin liuottimet. Erotuksen aikaansaamiseksi näytekomponenttien on kuitenkin desorboitava stationäärifaasista eri nopeuksilla. Vaikka tämä on mahdollista saavuttaa käyttämällä vakiopolaarista liuotinta (isokraattinen eluutio), parempi puhdistus saavutetaan yleensä käyttämällä liikkuvaa faasia, joka alkaa matalalla polariteetilla ja jonka polariteetti kasvaa ajan myötä. Tätä kutsutaan gradienttieluutioksi.
Gradientin avulla ne yhdisteet, joiden liukoisuus matalan polariteetin liuottimeen on suurempi (alemman polariteetin yhdisteet), desorboituvat ensin ja kulkevat kolonnin läpi. Liikkuvan faasin liuottimen polaarisuuden kasvaessa adsorboituneet yhdisteet desorboituvat väliaineesta eri nopeuksilla perustuen niiden liukoisuuteen yhä polaarisempaan liikkuvaan faasiin, kuva 2.
Kuva 2. Ylhäällä – Isokraattisessa eluoinnissa (liikkuvan faasin vakiopolariteetti) yhdisteet desorboituvat hitaammin kuin gradienttia käytettäessä (alhaalla). Gradienttieluutiolla saavutetaan tyypillisesti parempi erottelu/puhdistus kuin isokraattisella eluutiolla.
Normaalifaasikromatografian mielenkiintoinen ominaisuus on se, että kun yhdiste on kerran desorboitunut väliaineesta, se ei enää koskaan adsorboi, koska yhä polaarisemmaksi muuttuva liikkuva faasi adsorboituu mieluummin sen tilalle.
Yhdisteiden väliset polariteettierot (sitoutumisvoima) voivat olla niinkin hienovaraisia kuin erilaisen funktionaalisen ryhmän lisääminen, funktionaalisten ryhmien sijaintierot (Parida, 2006) kuin aromaattisella renkaalla tai niinkin selviä kuin yhdisteet, joilla on täysin erilainen rakenne, kuva 3.
Kuva 3. Yhdisteiden väliset polariteettierot. Eri polaarisuutta omaavien yhdisteiden erottelu funktionaalisten ryhmien tyypin ja sijainnin perusteella molekyylissä. Eluutiojärjestyksessä – naftaleeni (ei polaarista funktionaalisuutta), 1-nitronaftaleeni, o-nitroaniliini, m-nitroaniliini, p-nitroaniliini. Nitroaniliinit eroavat toisistaan vain nitrofunktionaalisen ryhmän sijainnissa suhteessa amiiniin.
Yhteenvetona voidaan siis todeta, että normaalifaasikromatografiaerotukset perustuvat eroihin yhdisteiden polaarisuudessa (sekä ilmiselvissä että huomaamattomissa), yhdisteiden vetovoimassa pysyvään faasiin ja niiden liukoisuudessa liikkuvaan faasiin. Parhaiden puhdistustulosten saamiseksi suositellaan liuotinetsintää TLC:n avulla.
Jos haluat oppia lisää flash-kromatografiasta, lataa whitepaper – Successful Flash Chromatography.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
