PMC

Jos halutaan tietää, reagoiko potilaan kasvain tiettyyn hoitomalliin, on tutkittava kyseisen ihmiskasvaimen, ei hiiren kasvaimen, vastetta terapiaan

Ihmissyövän tutkimiseen on kehitetty lukuisia hiirimalleja. Näillä malleilla tutkitaan tekijöitä, jotka osallistuvat pahanlaatuiseen transformaatioon, invaasioon ja metastaasiin, sekä tutkitaan hoitovastetta. Yksi yleisimmin käytetyistä malleista on ihmisen kasvaimen ksenograft. Tässä mallissa ihmisen kasvainsoluja siirretään joko ihon alle tai siihen elintyyppiin, josta kasvain on peräisin, immuunipuutteisiin hiiriin, jotka eivät hylkää ihmissoluja. Ksenotransplanttia hyväksyvät helposti esimerkiksi atyymiset nude-hiiret, vakavasti immuunipuutteiset (SCID) hiiret tai muut immuunipuutteiset hiiret (Morton ja Houghton, 2007). Riippuen injektoitujen solujen määrästä tai siirretyn kasvaimen koosta kasvain kehittyy 1-8 viikon (tai joissakin tapauksissa 1-4 kuukauden tai pidemmän ajan) aikana, ja vastetta sopiviin hoitomuotoihin voidaan tutkia in vivo. Toinen eläinmallityyppi ihmisen syövän tutkimiseen on geneettisesti muunnettu hiirimalli (GEM-malli). Näiden hiirten geneettistä profiilia muutetaan siten, että yksi tai useampi geeni, jonka uskotaan osallistuvan transformaatioon tai pahanlaatuisuuteen, mutatoituu, poistetaan tai yliekspressoituu; tämän jälkeen näiden geenien muuttamisen vaikutusta tutkitaan ajan mittaan, ja näiden kasvainten terapeuttisia vasteita voidaan seurata in vivo. Sekä atyymisiä alastomia hiiriä että hiiren ksenograft-malleja, joissa käytetään ihmisen kasvainsolulinjoja, on käytetty vuosikymmenien ajan lisäämään ymmärrystä kasvaimen kasvuun vaikuttavista tekijöistä; viimeaikaiset tiedot kasvaimen mikroympäristön keskeisestä vaikutuksesta kasvaimen etenemiseen ja kasvuun ovat kuitenkin johtaneet siihen, että on alettu turvautua yhä enemmän GEM-kasvainmalleihin, joissa käytetään immuuniyliherkkiä (immunokompetentteja) hiiriä, sekä primaaristen ihmisen kasvaimen ksenotransplantaattien käyttöön humanisoiduissa hiirimallinnuksissa. Itse asiassa ksenograft-malleja pidetään usein huonompina kuin GEM-malleja. Tässä artikkelissa toivon voivani osoittaa, että kummallakin mallilla on käyttötarkoituksensa syövän diagnostiikassa ja prekliinisissä hoitomuodoissa.

Viime aikoina on ehdotettu useita kriteerejä ihmisen syöpien GEM-malleille: (1) hiirillä on oltava sama mutaatio, joka esiintyy ihmisen kasvaimissa; (2) mutaatioiden on oltava suunniteltuja endogeenisen lokuksen sisällä, eikä niitä saa ilmentää transgeeninä; (3) mutatoituneiden geenien on oltava hiljaisia embryogeneesin ja varhaisen postnataalisen kehityksen aikana, paitsi perinnöllisten pediatristen kasvainten malleissa; (4) mutaatioiden on sijaittava tietyissä kohdekudoksissa valikoiduissa solutyypeissä; (5) mutaatioiden on esiinnyttävä rajoitetussa solumäärässä. Muita ”toivottuja ominaisuuksia” ovat, että kasvaintyypin ja anatomopatologian olisi oltava mahdollisimman samankaltaisia kuin ihmiskasvaimissa havaitut, ja että kasvaimen kehityksen olisi tapahduttava samojen tai samankaltaisten ”preneoplastisten” vaiheiden kautta (M. Barbacid, Keystone Symposium on Inflamation, Microenvironment and Cancer, 2008, ja henkilökohtainen tiedonanto). Toinen tärkeä kriteeri, jota on vaikea saavuttaa GEM-malleissa, on se, että isännän ja kasvaimen ympäristön olisi oltava mallissa toistettavissa. Vaikka hiirten kasvainmallit, joissa käytetään GEM-malleja, ovat erittäin hyödyllisiä arvioitaessa yhden tai kahden geenin tietyn mutaation, deletion tai geenin monistumisen vaikutuksia hiirten kasvaimen etenemisen aikana, ne eivät yleensä pysty täysin jäljittelemään ihmisen kasvainten geneettistä monimutkaisuutta. Esimerkiksi ihmisillä pahanlaatuisissa melanoomissa ja muissa kasvaintyypeissä, joilla on samankaltainen geneettinen heterogeenisuus, esiintyy runsaasti aneuploidiaa, ja geenien spesifinen lisääntyminen tai häviäminen vaihtelee valtavasti solusta toiseen saman kasvaimen sisällä. Näin ollen, vaikka tässä mallissa on merkittäviä vahvuuksia, siinä on myös luontaisia heikkouksia, jotka voivat vaikuttaa merkittävästi näiden hiirien käyttöön ennustettaessa potilaan vastetta hoidolle.

Jos halutaan tietää, reagoiko potilaan kasvain tiettyyn hoitomalliin, on tutkittava kyseisen ihmiskasvaimen, ei hiirikasvaimen, vastetta hoidolle. Tässä voi olla apua ihmisen kasvaimen ksenograftista atyymisillä nude-hiirillä, SCID-hiirillä tai ei-lihavuusdiabeettisilla (NOD)/SCID-humanisoiduilla hiirillä (kuva 1). Vaikka jotkin immuunijärjestelmän osat puuttuvat, kun valitaan nude- tai SCID-hiirimallit, athymic nude -hiirissä B-solut, dendriittiset solut ja granulosyytit ovat kaikki suhteellisen ehjiä, ja sekä luonnollisten tappajasolujen (NK-solujen) aktiivisuus että kasvaimia tuhoavat makrofagit lisääntyvät kompensatorisesti näissä hiirissä. Lisäksi voidaan väittää, että siihen mennessä, kun nämä metastaattiset leesiot poistetaan kirurgisesti tai niistä otetaan koepala, kasvain on jo välttynyt immuunivalvonnalta ja immuunisolujen suorittamalta solujen tappamiselta. Tässä pääkirjoituksessa käsittelen ihmisen kasvaimen ksenotransplantaattien etuja ja haittoja verrattuna GEM-malleihin menetelmänä, jolla voidaan analysoida potilaiden kasvainten mahdollisia vasteita hoidolle (kuva 1).

Miehen kasvaimen ksenotransplantaattien käyttämisessä lääkkeisiin saatavien terapeuttisten vasteiden tutkimiseen on useita keskeisiä etuja: (1) voidaan käyttää todellista ihmisen kasvainkudosta, jossa näkyy ihmisen kasvainpopulaatiossa esiintyvien geneettisten ja epigeneettisten poikkeavuuksien monimutkaisuus; (2) ihmisen kasvainksenotransplantaatteja voidaan käyttää apuna yksilöllisten molekyyliterapeuttisten lähestymistapojen kehittämisessä; (3) ihmisen kasvainbiopsiasta saadaan muutamassa viikossa tuloksia hoitovasteesta, kun taas GEM-mallien kehittyminen ennen lääkehoitoon ryhtymistä vaatii usein jopa vuoden ajan; (4) useita hoitomuotoja voidaan testata yhdestä ainoasta kasvainbiopsiasta; (5) kudosmikrosirujen ja geneettisten mikrosirujen tiedot voidaan saada helposti ihmisen biopsiasta ja ksenotransplanttikudoksesta ennen lääkehoitoa ja sen jälkeen kattavaa analyysia varten, ennen kuin potilaalle annetaan hoitoa, joka ei välttämättä tehoa; (6) ortotooppiset ksenotransplantaatit voidaan sijoittaa tarkoituksenmukaisesti jäljittelemään elinympäristöä, jossa kasvain kasvaa, niin että kasvaimen vaikutusta sen mikroympäristöön voidaan muokata, vaikkakin tiettyjä T-solupopulaatioita lukuun ottamatta; (7) ihmisen kasvaimen mikroympäristöstä peräisin oleva strooma voidaan sisällyttää ksenotransplantaattiin, jotta se jäljittelisi täydellisemmin ihmisen kasvaimen mikroympäristöä; ja (8) ksenotransplantaatit, joissa käytetään NOD/SCID-hiiriä, jotka on ”humanisoitu” injektoimalla perifeeristä verta tai luuydinsoluja, mahdollistavat lähes täydellisen immuunivasteen uudelleenmuodostamisen kasvainta vastaan. Ihmisperäisiä solulinjoja käyttävät ksenotransplantaatit, joilla testataan lääkevasteita, eivät useinkaan korreloi kliinisen aktiivisuuden kanssa potilailla (Kerbel, 2003). Sitä vastoin, kun primaarikasvaimia käytetään ortotooppisena ksenograftina, vasteen ennustearvo on vahvempi, varsinkin kun käytetään kliinisesti merkityksellistä lääkeannostusta (Johnson ym., 2001; Kerbel, 2003; Scholz ym., 1990). Hoitovastetta voidaan arvioida kolmella eri tavalla: vaikutus kasvaimen kasvunopeuteen, vaikutus kasvaimen kutistumiseen/regressioon ja eloonjääminen. Lääkkeen vaikutuksen kasvaimen kasvunopeuteen tai sytostaasiin on raportoitu usein ennustavan kliinistä vastetta paremmin kuin kasvaimen kutistumisen/regression (Kelland, 2004). Lisäksi ihonalaiset kasvainmallit, jotka eivät ole ortotooppisia eivätkä edusta sopivia paikkoja ihmisen kasvaimille, eivät ole ennustavia, kun niitä käytetään testattaessa vasteita syöpälääkkeille (Killion ym., 1998). Ortotooppisten mallien haasteena ihonalaisiin malleihin verrattuna on se, että kasvaimen kasvua on vaikea seurata. Uusien magneettikuvaus- (MRI) ja mikrokuvantamistekniikoiden viimeaikainen kehitys voi kuitenkin minimoida tämän ongelman.

Hiiren ksenotransplantaattimallin käyttöön liittyy useita muita haittoja ja haasteita syövän hoitovasteiden seurannassa ja/tai ennustamisessa. Ortotooppiset kasvainmallit ovat aikaa vieviä, kalliita ja teknisesti haastavia. Lisäksi jos käytetään athymisia nude- tai SCID-hiiriä, lymfosyyttivälitteinen vaste kasvaimeen menetetään, eli nude-hiiret menettävät tietyt T-soluvasteet ja SCID-hiiret menettävät sekä T- että B-soluvasteet. Nämä immunologiset puutteet voidaan kuitenkin periaatteessa suurelta osin korjata siirtämällä ihmiskasvaimia ”humanisoituihin” NOD/SCID-hiiriin. Tämä vähentää huomattavasti monia ortotooppisten ihmiskasvainten ksenograft-mallien haittoja terapeuttisen vasteen tutkimisessa. Immuunijärjestelmän täydellinen palauttaminen ”humanisoidussa hiiressä” ei kuitenkaan ole mahdollista, koska HLA-luokan I- ja II-valintaelementtien palauttaminen T-solupopulaatioihin on edelleen haaste (Bernard ym., 2008). Lisäksi näiden kokeiden suorittamiseksi vastasyntyneet hiiret on säteilytettävä, minkä jälkeen niihin on istutettava ihmisen napanuoraverestä peräisin olevia ihmisen CD34+ hematopoieettisia kantasoluja. Napanuoraverestä hankkimisen, vastasyntyneiden hiirten säteilyttämisen ja NOD/SCID-hiirten inhimillistyneen fenotyypin todentamisen ajoitus siirron jälkeen tekee tästä menettelystä melko hankalan, mutta erittäin arvokkaan.

Ksenograft-mallin haittapuolista huolimatta kliinisen hoitovasteen ennustamisessa ksenotransplantaatiomalliin liittyy useita merkittäviä onnistumisia. Esimerkiksi multippelin myelooman solulinjojen syngeenisiin hiiriin siirretyt ksenograftit reagoivat proteasomin estäjään bortezomibiin/VELCADE®, joka on osoittautunut erittäin lupaavaksi multippelin myelooman hoidossa (LeBlanc ym., 2002; Moreau ym., 2008; Oyajobi ja Mundy, 2003). Bortetsomibin ja melfaleenin yhdistelmä osoittautui ensimmäisen kerran tehokkaaksi multippelin myelooman hoidossa prekliinisissä ksenotransplantaattitutkimuksissa, ja tämä johti menestykseen kliinisissä tutkimuksissa, minkä jälkeen sitä suositeltiin uudeksi kliinisen hoidon standardiksi yli 65-vuotiaille multippelia myeloomaa sairastaville potilaille (Mateos ym., 2006; Mitsiades ym., 2003). Herceptinin osoitettiin tehostavan paklitakselin ja doksorubisiinin kasvainvastaista tehoa HER2/neu:ta yliekspressoivia ihmisen rintasyövän ksenotransplantaatteja vastaan, ja tämä johti myöhemmin menestyksekkäisiin kliinisiin tutkimuksiin (Baselga ym., 1998; Sporn ja Bilgrami, 1999). Vaskulaarisen endoteelin kasvutekijän reseptoriin 2 (VEGFR2) kohdistuvat neutraloivat vasta-aineet yhdessä paklitakselin kanssa osoittautuivat tehokkaiksi kasvaimen kasvun estämisessä ja metastaattisen leviämisen estämisessä ortotyyppisessä ksenotransplantaattimallissa (Davis ym., 2004). Tätä pohjatyötä seurasi bevasitsumabin kehittäminen, joka on humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine, joka kohdistuu verisuonten endoteelin kasvutekijään A (VEGF-A). Bevakitsumabi oli tehokas vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa paksusuolen ja munuaisten karsinooman hoidossa, ja se sai FDA:n hyväksynnän vuonna 2004 (Hurwitz ym., 2004; Yang ym., 2003). Lisäksi hiiren ksenograft-mallit ovat käyttökelpoisia kohdehoitojen toksisuuden ennakoimiseksi ja toisissa tapauksissa mahdollisten ennakoivien biomarkkereiden tunnistamiseksi kohdemuutosta varten. Vaikka nämä ovat vain muutamia esimerkkejä ksenograft-tutkimusten menestyksekkäästä käytöstä, on selvää, että monien ihmiskasvaintyyppien osalta hiiren ortotyyppisistä ksenograft-tutkimuksista, joissa on käytetty ihmiskasvaimia, saadut tiedot ovat johtaneet tietoihin, jotka on siirretty menestyksekkäisiin kliinisiin tutkimuksiin.

GEM:n edut ovat seuraavat: (1) hiiret ovat immunokompetentteja, jolloin kasvaimen mikroympäristö voidaan peilata mahdollisimman hyvin hiiren kasvainmalliin; (2) ihmisen kasvaimissa esiintyvät erityiset geneettiset poikkeavuudet voidaan jäljentää indusoitavalla tavalla tietyissä ikävaiheissa alkuperäisessä kudostyypissä; (3) kasvaimen etenemisen vaiheita voidaan tutkia ajan mittaan; ja (4) useita terapeuttisia lähestymistapoja voidaan tutkia kasvaimen kehityksen eri vaiheissa. Geneettiset mallit ovat käyttökelpoisia myös humanisoiduissa hiirissä, joissa ihmisen geenit, kuten sytokromi P450 -geenit tai ihmisen kasvainantigeenit, ilmentyvät hiirissä, jotta voidaan seurata lääkemetaboliaa tai immunologisia vasteita kasvaimelle (Talmadge ym., 2007). GEM:n haittapuolia ovat ensinnäkin se, että ihmisen kasvaimen monimutkaisuutta ei voida luotettavasti jäljitellä, ja toiseksi hiirten kasvaimet eivät ole ihmisen kasvaimia, eivätkä ne useinkaan ennusta, mitä ihmisen kasvaimessa tapahtuu terapeuttisen vasteen suhteen. Voimme parantaa monia hiiren kasvaimia, mutta hiiressä saadun vasteen ja kliinisen vasteen välillä ei ole suoraa korrelaatiota.

Yhteenvetona voidaan todeta, että sekä ortotooppinen ihmisen kasvaimen ksenotransplantaatti että GEM-mallit ovat käyttökelpoisia syövän kehittymisen ja hoidon ymmärtämisen lisäämiseksi. Kummallakin on omat vahvuutensa ja rajoituksensa, sillä ortotooppinen ihmisen kasvaimen ksenograft-malli on erinomainen ennustettaessa lääkevastetta ihmisen kasvaimissa ja GEM-malli on paras tutkittaessa tiettyjen geenien roolia kasvaimen kehityksessä ja etenemisessä. Riippumatta siitä, mitä mallia käytetään potilaiden kliinisen vasteen ennustamiseen, on tärkeää, että kasvaimen kasvu hidastuu vähintään 50 prosentilla, jotta voidaan puhua hoitovasteesta, ja että käytetään kliinisesti merkityksellisiä annoksia terapeuttisia aineita ja seurataan elossaoloaikaa. Lisäksi on tärkeää määrittää, palaako kasvaimen kasvu, kun lääkitys lopetetaan, ja jos näin on, onko kasvaimen kasvu nopeampaa, kun hoito keskeytetään, kuin ennen hoidon aloittamista. Jos näin on, vaikka lääkehoitoon on saatu vaste, rebound-ilmiö estää kyseisen lääkehoitomuodon käyttämisen kasvaintyypeissä, joilla on rebound-ilmiö. Yhteenvetona voidaan todeta, että meillä ei ole ihanteellisia hiirimalleja ihmisen kasvaimista, vaan meidän on opittava tulkitsemaan tietojamme käytetyn kokeen rajoitusten puitteissa.