A COX-1-en túl: az aszpirin hatása a vérlemezkék biológiájára és a kemoprevenció lehetséges mechanizmusai

A vérlemezkék kritikus szerepet játszanak a hemosztázisban, a trombózisban és az erek integritásának fenntartásában. A vérlemezke-aktivitás nem megfelelő szabályozása nem megfelelő vérzéshez, míg a túlzott aktivitás trombózishoz és akut ischaemiás eseményekhez vezethet. A véralvadási folyamatot membránfelszíni glikoproteinek és receptorok szabályozzák, amelyek a véralvadási kaszkádot exogén effektorok, például adenozin-difoszfát (ADP), tromboxán A2 (TXA2), szerotonin, kollagén, trombin és adrenalin megkötését követően indítják be. A vérlemezke-aggregáció alapvető szekvenciája három lépésben zajlik: iniciáció, extenzió és stabilizáció. Az iniciációs szakaszban a vérlemezkék az exponált von Willebrand-faktor (vWF)/kollagén-komplexekhez kötődnek, és elég sokáig maradnak az érsérülés és válaszreakció helyén ahhoz, hogy a kollagén további aktivációt váltson ki. Az erősödést a szekréció és az aggregáció második hulláma jellemzi, és tovább fokozza a trombin, az adenozin-difoszfát (ADP) és a tromboxán A2 (TXA2) vérlemezkék által közvetített felszabadulása. A második hullám egyúttal a trombocita-extenziós fázist is jelzi, amelyben az újonnan érkező vérlemezkék a kezdeti vérlemezke-monoréteghez tapadnak. A fehérje-receptor-effektor kölcsönhatást követően az aktivált vérlemezkék tovább aggregálódnak, hidakat képezve a felszíni glikoproteinek, a fibrinogén, a fibrin és a vWF között az aktivált glikoproteinekhez. Ez a stabilizációs fázis magában foglalja a vérlemezke-dugó kialakulásának későbbi jelátviteli eseményeit, amely lehetővé teszi a vérlemezke-aggregátum konszolidációját, hogy megakadályozza annak szétszóródását a keringő vérben lévő nyíróerők által.

A vérlemezke-aggregációban a jelátvitel a vérlemezke felszínén lévő receptorok agonisták, például kollagén, trombin, ADP, TXA2 és adrenalin által történő aktiválásával kezdődik. Ezeknek a GPCR-receptoroknak az aktiválása a foszfolipáz A2 aktiválásához vezet, amely foszfotidilkolint és más membránfoszfolipideket hasít, felszabadítva a glicerin gerinc C2 pozíciójából arachidonátot. Az arachidonát különböző prosztaglandinokká (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α,) alakulhat át, amelyek a gyulladásos választ közvetítik. Ezenkívül a tromboxánok, mint például a TXA2, a keringő vérlemezkék aktivációjának felerősítése mellett vérlemezkék felszabadulását, aggregációját és alvadását indukálják. A prosztaglandin endoperoxid-szintáz-1 (PGSH-1)/ciklooxigenáz-1 (COX-1) végzi a kezdeti ciklooxigenáz és peroxidáz reakciókat, hogy az arachidonsavat a prekurzor metabolitokká, prosztaglandin G2-vé és prosztaglandin H2-vé alakítsa. Ezek kémiai feldolgozásával más prosztaglandinok keletkeznek, köztük a TXA2, amely a vérlemezkék által kiváltott válasz nagy részét közvetíti. A vérlemezkeaktiváció során lejátszódó jelátviteli események összefoglalása a 3. ábrán látható.

Az aszpirin modulálja a vérlemezkék aktivitását és biológiáját – ciklooxigenáz gátlás

Az aszpirin gátolja a vérlemezke aggregációt és a prosztaglandin felszabadulást . Az acetát-karbonil szénatomon 14C-vel sugárzott aszpirinnel végzett korai vizsgálatok azt mutatták <, hogy a 14C sugárzási jel 0,1%-át a vérlemezkék felvették, és hogy az aktivitás túlnyomórészt három fehérjéhez kapcsolódott . Bár a társulás irreverzibilis volt, ami kovalens kötés kialakulására utal, biológiailag releváns koncentrációban csak egyetlen 85 kDa fehérje esetében bizonyult telíthetőnek. A másik két oldható vérlemezkefehérje nem telítődő acetilációt mutatott, ami arra utal, hogy az aszpirinfüggő acetiláció a vérlemezkékben egyszerre specifikus és nem specifikus. Később kiderült, hogy az acetilált 85 kDa enzim a prosztaglandin endoperoxid-szintáz-1 (PTGS-1/COX-1) . A trombocita COX-1 acetilátvitel általi gátlása irreverzibilis, és a gátlás a trombocita 10 napos élettartama alatt fennmarad.

A COX-1 egy bifunkcionális enzim, amely a legtöbb szövetben konstitutívan expresszálódik, és két különböző és egymást követő reakciót hajt végre a térben különböző, de mechanisztikailag összekapcsolt aktív helyeken. Normális sejtekben a COX-1 membránhoz kötött, és az endoplazmatikus retikulum luminális felszínébe, valamint a magburkolat belső és külső felszínébe ágyazódik. A vérlemezkék azonban magnélküli sejtdarabok, és ehelyett a COX-1 fehérjéket a sűrű csöves membránrendszerben expresszálják, amely a vérlemezke biogenezis során a demarkátus membránrendszerből származik. Ez a sűrű tubuláris membránrendszer fontos szerepet játszik a vérlemezkék aktiválásában, és a vérlemezkékben az eikozanoid-szintézis fő helye . A 85 kDa tömegű COX-1 homodimer 576 maradékot tartalmaz, és különböző lizin-oldalláncoknál glikozilált. Bár a COX-1 azon kevés fehérjék egyike, amelyet aszpirin gátlással hoztak összefüggésbe az aktív helyén, fontos megjegyezni, hogy a lizinmaradványok glikozilációja fokozza más maradékok acetilációját, és ebben az esetben a COX-1 aktív helyén lévő szerinét . Minden COX-1 szerkezeti alegység három hajtogatási domént tartalmaz: egy epidermális növekedési faktor domént, egy membránkötő domént és egy katalitikus aktív centrumot. A katalitikus domén egy ciklooxigenáz-helyet tartalmaz, amely az arachidonsav di-oxigénezését végzi el a prosztaglandin G2 (PGG2) hidroxil-endoperoxidjának képzése céljából, míg a szomszédos peroxidáz aktív hely a PGG2 PGH2-vé történő redukcióját végzi el. A membránaktív doménnel szemben, a katalitikus doménen belül található a peroxidáz aktív centrum, amely egy sekély hasadékhoz kötött hem kofaktorral rendelkezik. A heme-csoport elengedhetetlen a ciklooxigenáz aktív helyén lévő tirozilgyök aktiválásához az arachidonsav lipidperoxidációjához. A hemet megkötő peroxidáz-központtal szemben, a membránkötő doménből kiinduló alagút tetején található a ciklooxigenáz aktív helye. Az arachidonsav ezen a helyen kötődik, ami a szubsztrát karboxilátjának átpozícionálását eredményezi a di-oxigénezéshez . A 2-bromoacetoxi benzoesavval kezelt juh COX-1 szerkezeti vizsgálatai arra utalnak, hogy az arachidonsav kötődése az aktív centrum ciklooxigenáz végéhez, és következésképpen az arachidonsav kettős oxigenizációja az 530-as szerin acetilációjának eredményeként gátolt .

A COX-1 visszafordítható gátlása az aktív centrum szerinjének aszpirin acetilációjával drámaian csökkenti a prosztaglandin bioszintézist. A vérlemezkékben a COX-1 nem tud gyorsan regenerálódni, és következésképpen a COX-1 aktivitása csak új vérlemezke-biogenezissel állítható helyre. A tromboxán A2, a prosztaglandin E2 és a prosztaciklin (PGI2) szintézise a legsúlyosabban érintett az aszpirinnel kezelt vérlemezkékben, ami az alvadási mechanizmus hiányát , a gyomornyálkahártya csökkent szekrécióját, a gyomorsavak által okozott fokozott irritációt, valamint megváltozott patofiziológiai alvadást és értágulást/szűkületet eredményez.

A COX-2 aminosav szinten 60%-ban azonos a COX-1-el, és háromdimenziós szerkezetük szinte egymásra hasonlítható. A COX-2 indukálható, és expresszióját ugyanazok a prosztaglandinok fokozzák, amelyeket a COX-1 szintetizál a vérlemezkékben és a hámsejtekben. A COX-2 a megakariocitopoeosis során felülreprezentálódik, és a krónikus myeloid leukémiában és polycythemia verában szenvedő betegek keresztmetszeti csontvelőmintáiban azonosították . Egy másik tanulmány az mRNS-szintek közvetlen mérésével jellemezte a COX-2 expressziós szintjét a vérlemezkékben a COX-1-hez viszonyítva . Azt találták, hogy a vérlemezkék a COX-2-t néhány rosszindulatú hámsejthez hasonló szinten expresszálják, bár jelentősen alacsonyabb szinten, mint a vérlemezke COX-1-et. A COX-2 acetilálása az endotél- és hámsejtekben gátolja a PGI2 és a PGE2 bioszintézisét, amelyek különböző hatással vannak a downstream folyamatokra, például a gyulladásra. Bár a COX-1 és a COX-2 aszpirin által közvetített gátlása a prosztaglandin bioszintézis gátlásának eltérő profilját eredményezi, a gátlás alapja mindkét esetben a prosztaglandin endoperoxid-szintáz blokkolása és a multifunkcionális prosztaglandin H2 szintjének következményes csökkenése. A COX-3 szerepe a trombocita biológiával összefüggésben továbbra sem ismert.

Az aszpirin COX-gátló hatása a beadott dózistól függ. Az alacsony dózisok, a 75 és 300 mg közöttiek, a vérlemezkék TXA2-termelésének szelektív gátlását eredményezik anélkül, hogy elnyomnák a prosztaciklin (PGI2), egy gyakori vérlemezke-antagonista és értágító hatású anyagot. A PGI2 várhatóan főként az érrendszeri COX-2-ből származik, ami arra utal, hogy a COX-2 gátlása minimális az alacsony dózisú rendszerben. Az emelt dózisok (>1200 mg) fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal rendelkeznek, olyan tulajdonságokkal, amelyek a COX-1 és COX-2 patofiziológiai gátlásához kapcsolódnak. Fontos megjegyezni, hogy a COX-2 is felhasználhatja az arachidonsavat a lipoxinok, különösen a 15-hidroxi-eicosatetraénsav (15-HETE) szintéziséhez. Ez a bioszintetikus útvonal várhatóan a COX-2 acetilálása után is érintetlen marad. A COX-aktivitás differenciált gátlása részben az aszpirin relatív gátló erejével magyarázható. Bár az aszpirint általában nem specifikus COX-gátlónak tekintik, a COX-1 és a COX-2 között igen szelektív. Amint azt Blanco és munkatársai látták, az aszpirin IC50 értéke a COX-1 esetében körülbelül 3,5 μM, míg a COX-2 esetében körülbelül 30 μM. Míg a két enzim aszpirinreaktív aktív centrumai homológok, a COX-2 Ser-516-jának acetilálása a katalitikus aktivitás csak részleges gátlását eredményezi. Tekintettel az alacsony dózisban elérhető szérumkoncentrációra (~7 μM), nem valószínű, hogy a COX-2 több mint 5%-ban acetilált, míg a vérlemezke-eredetű COX-1 valószínűleg >70%-ban acetilált . Ez arra utal, hogy a rendszeres, alacsony dózisú aszpirin változatlanul fenntartja a COX-1 gátlását a keringő vérlemezkékben, minimális hatással a perifériás COX-2 gátlására. A kis és nagy dózisú aszpirin vérben és szövetekben a COX-aktivitásra gyakorolt hatásának összefoglalása az 1. táblázatban látható.

A vérlemezkékkel kölcsönható fehérjék aszpirinfüggő acetilációja a vérben

A vérlemezkék számos felszíni receptort fejeznek ki, amelyek lehetővé teszik számukra a plazma- és vérfehérjékkel, kórokozókkal, kórokozóval kapcsolatos termékekkel és a gyulladt endotéliummal való kölcsönhatást. A felszíni receptorok kritikus szerepet játszanak a vérlemezkék sérült érrendszerhez való tapadásában, a véralvadási trombus kialakulásában és számos metabolikus effektoron keresztül történő aktiválásában. A vérlemezkék és más vérfehérjék közötti kölcsönhatás a szisztémás keringésben kritikus fontosságú a véralvadási válasz végrehajtása és feloldása szempontjából. Érdekes módon számos ilyen fehérjét az aszpirin is módosítja.

Fibrinogén

Farr és munkatársai 1968-ban azonosították a fibrinogént, mint az aszpirin acetiláció célpontját. A fibrinogén a plazmában oldható fehérjeként, valamint a vérlemezkékben intracelluláris membrán-asszociált fehérjeként található . A fibrinogén az összes vérlemezkefehérje 3-10%-át teszi ki (közel 25%-a az α-granulátumokban található), és vérlemezkeaktiváláskor szabadul fel. A fibrinogén in vitro és in vivo aszpirinnel acetilálódik, és ε-N-acetil-lizin-származékokat képez, a fibrinogén átlagosan három maradékát módosítva. Az acetilált fibrinogén növeli a fibrinrögök lízisre való érzékenységét .

Albumin

Az aszpirin acetilációval történő albumin-módosítása már több mint fél évszázada ismert . Farr és munkatársai számos tanulmányban értékelték az albuminnak az acetilcsoport hozzáadása által kiváltott lehetséges konformációs hatásokat . A szérumalbumin irodalomban legtöbbet tárgyalt módosítása a lizinmaradványok acetilálására összpontosít . A humán szérumalbuminról azt is megfigyelték, hogy a kalciumszabályozás befolyásolásával befolyásolja a vérlemezkék véralvadási mechanizmusait .

Hemoglobin

A vérplazma miliő talán legfontosabb összetevője, a hemoglobin, in vitro aszpirinfüggő acetiláción megy keresztül, és feltételezhetően in vivo is hasonló módosításokon megy keresztül nagy aszpirindózisok esetén . A hemoglobin aszpirin általi acetilációjával kapcsolatos vizsgálatok kimutatták a fehérje glikációjának csökkenését, és magas glükózkoncentráció jelenlétében a hemoglobin aszpirin általi acetilációja fokozódik , és ezt a hatást a szérumalbuminban is megfigyelték. Az aszpirin képes acetilálni a hemoglobin α- és β-láncának különböző lizinmaradványait anélkül, hogy hatással lenne a hemoglobin szerkezeti konformációjára vagy oxigénmegkötő és transzport funkcióira . A hemoglobin a GP1βα-val, a számos vérlemezkefelszíni receptorfehérje egyikével való kölcsönhatás révén képes trombocitaaggregációt kiváltani. A hemoglobin viszonylag alacsony koncentrációi is képesek trombocita-aggregációt kiváltani, bár a hemoglobin aszpirin általi acetilálásának hatása a hemoglobin és a vérlemezkék közötti kölcsönhatásokra továbbra sem ismert .

Az aszpirin hatása a vérlemezkék felszabadulására: következmények a rák szempontjából

A ciklooxigenáz gátlása és a tromboxán bioszintézis egyidejű csökkenése csökkent trombocita aggregációt, a P-szelektin expresszióját és mérsékelt alvadási funkciót eredményez. A vérlemezkeaggregáció modulálásában betöltött szerepe mellett az aszpirin a vérlemezkékben expresszált és szekretált fehérjék profilját is megváltoztatja. E fehérjék közül sokan részt vesznek a véralvadási válasz közvetítésében és az immunsejtek toborzásában a sérülés helyére . A vérlemezkék “releasate”-jében található számos fehérje azonban fontos szerepet játszhat az angiogenezis és a tumor növekedésének elősegítésében is.

Az aszpirinről kimutatták, hogy gátolja az interleukin 7 (IL-7) felszabadulását a trombinreceptor aktiváló peptiddel (SFLLRN) stimulált vérlemezkék által. Az aszpirint szedő egészséges betegeknél is szignifikánsan alacsonyabb plazma IL-7 értéket mutattak ki. Ez a pro-inflammatorikus citokin bizonyítottan kulcsszerepet játszik mind a B-, mind a T-sejtek érésében . Az IL-7-ről azt is kimutatták, hogy egyszerre van pro- és antitumor hatása, ez utóbbi főként az apoptózis gátlásából fakad a BCL2 szabályozásán keresztül. A vérlemezkék a pro-angiogén faktorok, köztük a VEGF és az angiopoetin-1 forrása is, és van némi bizonyíték arra, hogy a rendszeres aszpirinhasználat csökkenti mindkét faktor plazmakoncentrációját, bár nem világos, hogy ez pusztán a vérlemezkék felszabadulásának függvénye-e . Ezt támasztja alá egy klinikai vizsgálat, amelyben az aszpirin terápia úgy tűnt, hogy a tamoxifent kapó emlőrákos nőknél az általános antiangiogén egyensúlynak kedvez, amit a plazma VEGF szintjének csökkenése és a TSP-1 és VEGF trombin receptor által közvetített felszabadulása a vérlemezkékből értékelt.

Coppinger és munkatársai tömegspektrometrián alapuló proteomikai vizsgálatot végeztek, hogy tovább vizsgálják a vérlemezke-felszabadulás összetételét az aszpirin kezelés függvényében. Ebben a vizsgálatban a humán vérlemezkék kis dózisú aszpirinnel (20 μM) történő kezelése a kollagénnel, SFLLRN-nel vagy ADP-vel történő stimulációt követően a releasate-ban található fehérje mennyiségének széleskörű csökkenését eredményezte, bár ennek a csökkenésnek a mértéke az alkalmazott agonistától függött. Az aszpirin kezelés a növekedést szabályozó növekedési faktor (GRO), a vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF), az angiogenin, a RANTES és az onkosztatin M (OSM) szintjének csökkenését is eredményezte a vérlemezke releasátumban, különösen a kollagénnel történő stimulációt követően. Míg ezek és más vérlemezke-eredetű citokinek (pl, CXCL4 és CTGF ), kritikus fontosságúak az érrendszeri javítás szabályozásában, szerepet játszanak a tumorigenezis, az angiogenezis és az áttétképződés irányításában is.

Aszpirin acetilómájának meghatározása

Amint fentebb említettük, az aszpirinről ismert, hogy számos intracelluláris és extracelluláris fehérje célpontot acetilál, különösen az oldallánc- és N-terminális aminocsoportokon. Sajnos nem készültek olyan átfogó proteomikai vizsgálatok, amelyek kifejezetten azzal a kérdéssel foglalkoztak volna, hogy a COX enzimeken kívül mely vérlemezkefehérjéket acetilálja az aszpirin, illetve hogy ezeknek a nem kanonikus acetilációknak milyen biológiai szerepe van. Ebben a fejezetben az aszpirin által közvetített acetiláció nem kanonikus célpontjainak azonosítására irányuló korábbi proteomikai vizsgálatokat tekintjük át, és megpróbáljuk ezeket a trombocita-proteomika jelenlegi helyzetével összefüggésbe hozni.

Számos proteomikai vizsgálat született, amelyek megpróbálták meghatározni az aszpirin fiziológiás koncentrációi által a különböző sejtvonalakban acetilált fehérjék halmazát. Bhat és munkatársai 33 aszpirin által acetilált sejtfehérjét azonosítottak anti-acetil lizin antitesttel történő dúsítás után . Az ezt követő tömegspektrometriás elemzés a citoszkeletális és metabolikus enzimek, köztük a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD), a laktát-dehidrogenáz, az enoláz, a piruvát-kináz és a transzketoláz acetilezését azonosította, bár csak a G6PD-t gátolta jelentősen az aszpirin által közvetített acetilezés in vitro. Ez arra utal, hogy az aszpirin gátolhatja a pentóz-foszfát útvonalon keresztüli áramlást, bár ennek megerősítéséhez további vizsgálatokra van szükség. Ez a csoport azt is kimutatta, hogy az aszpirin acetilálja a p53-at, ami fokozott DNS-kötődést, a p21Cip expresszióját és az apoptotikus sejthalál fokozódását eredményezi kamptotecin jelenlétében . Bár ezeket a hatásokat több tumorsejtvonalon is kimutatták, a p53 hiánya a vérlemezke-proteomban, valamint a funkcionális genom hiánya a vérlemezkékben arra utal, hogy a p53 acetilációnak minimális hatása lesz a vérlemezkék biológiájára.

A nagy áteresztőképességű proteomika újabb eredményei, párosulva az aktivitásalapú szondákkal, több száz feltételezett aszpirin által közvetített acetiláció azonosításához vezettek. Az egyik megközelítésben az aszpirin acetilcsoportját pentinsavval helyettesítették, hogy egy alkin-tartalmú aszpirin-származékot (AspAlk) hozzanak létre . Az aszpirinnel ellentétben az AspAlk által végzett acetilátvitel egy azid-reaktív alkin beépülését eredményezi az aszpirin által normális esetben acetilezett helyeken. Az AspAlk élő HCT-15 vastagbélsejtekkel történő inkubációját követően az AspAlk által acetilezett fehérjéket rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció (CuAAC) segítségével biotinnal jelölték, és sztreptavidin pulldown segítségével izolálták. Az LC-MS-elemzést követően a szerzők 120 olyan fehérjét tudtak azonosítani, amelyekben az AspAlk acetilációja jelentősen feldúsult a DMSO-kontrollhoz képest. Ebben a vizsgálatban a fehérjék legjobban feldúsult osztályai a fehérjeszintézisben és -hajtogatásban, a citoszkeletális fehérjékben és a metabolikus enzimekben részt vevő fehérjék voltak. Hiszton acetilációt is megfigyeltek és biokémiailag megerősítettek. Ezt a munkát Shen, Lin és munkatársai egy nemrégiben megjelent kéziratban kibővítették, akik sav-labil biotin-azidot használtak az AspAlk-módosított fehérjék visszanyerésének megkönnyítésére a biotin konjugációt és a streptavidin pulldown-t követően. Ez a stratégia több mint 500 acetilezett fehérje azonosítását eredményezte. A célpontok listájának útvonal-elemzése jelentős acetilációt jelzett az mTOR útvonalon belül, amely számos kulcsfontosságú sejtfunkciót, többek között a fehérjeszintézist és az autofágiát szabályozza. A szerzők validálták a kezdeti proteomikai megfigyeléseket, amikor kimutatták, hogy mind a HCT116 kolorektális sejtek, mind az egér embrionális fibroblasztok aszpirin kezelése csökkentette a de novo fehérjeszintézist és autofágiát indukált. Az autofágia aszpirin általi indukciója különösen érdekes annak fényében, hogy egy nemrégiben végzett tanulmány szerint az autofágia elengedhetetlen a vérlemezkék normális működéséhez, és a vérlemezke-stimuláció során felszabályozódik. Továbbá, a funkcionális autofágikus gépezet elengedhetetlen a vérlemezkék véralvadásgátló aktivitásához, amint azt olyan egérmodellek mutatják, amelyekben a vérlemezkék Atg7-ét kiütötték. Bár az aszpirin által közvetített acetiláció és a vérlemezke autofágia indukciója közötti funkcionális kapcsolat továbbra is tisztázatlan, a pentóz-foszfát útvonal (PPP) G6PD blokkolással történő gátlása vagy a mitokondriális légzésnek a malát-dehidrogenáz és/vagy izocitrát-dehidrogenáz acetilációjával történő megzavarása növelheti az intracelluláris oxidatív terhelést, ami az autofágia ismert kiváltója . Alternatívaként számos bizonyíték van a chaperonok, különösen a hősokkfehérjék és a peptidil-prolil izomerázok aszpirin által közvetített acetilációjára, ami károsíthatja a megfelelő fehérje-összehajtást és kiválthatja a rosszul hajtogatott fehérjék autofágikus eltávolítását.

A Tatham és munkatársai által nemrégiben végzett másik proteomikai vizsgálatban 3H-jelölt aszpirin segítségével tömegspektrometriával azonosították a HeLa sejtekben az aszpirin által közvetített acetiláció helyeit . Ebben a megközelítésben a tritiált aszpirin használata +3 Da tömegeltolódást eredményez a normál acetáthoz képest, és lehetővé teszi az aszpirin által közvetített acetiláció és az endogén acetiláció pontosabb megkülönböztetését. Ez a megközelítés több mint 12 000 aszpirin-mediált acetilációt mutatott ki több mint 3700 egyedi fehérjében. Érdekes módon az aszpirin által acetilált fehérjék közül sok aszpirin hiányában is acetiláltnak bizonyult, ami arra utal, hogy az aszpirin “felerősíti” a meglévő fehérje acetilációs helyeket. A tanulmány szerzői azt is megállapították, hogy a legtöbb esetben az adott fehérje összes acetilálásra rendelkezésre álló helyének <1%-át acetilálta az aszpirin, ami arra utal, hogy a nem specifikus aszpirin által közvetített acetiláció sztöchiometriája elégtelen lehet ahhoz, hogy az endogén deacetiláz aktivitás farmakológiai blokkolása nélkül jelentős biológiai hatást fejtsen ki.

Ez a vizsgálat a hisztonfehérjék jelentős acetilációját is kimutatta, az aszpirin által közvetített acetiláció többsége a hisztonmagban, nem pedig az N-terminális végekben történt. A hiszton-acetilációt több proteomikai vizsgálatban is megfigyelték, és ez nem meglepő, mivel a hisztonokban nagy a nukleofil lizin-maradékok aránya, amelyek jelentős szerepet játszanak az elektrosztatikus DNS-kötésben. A hiszton acetiláció kritikus szerepet játszik a DNS-kötésben és a génexpresszió szabályozásának jól ismert epigenetikai mechanizmusa . Bár a vérlemezkék anukleárisak, korábbi transzkriptomikai vizsgálatok hiszton-specifikus transzkriptumokat azonosítottak a vérlemezkékben, különösen a H2A, H2B, H3 és H4 . Míg a hiszton acetiláció aszpirin hatására meggyőzően bizonyított, fontos megjegyezni, hogy a hisztonok expresszióját nem igazolták a vérlemezkékben. Ehelyett inkább azt feltételezték, hogy a hiszton-transzkriptumok jelenléte a vérlemezkékben a vérlemezkéket létrehozó megakariociták rendellenes sejtciklusának műterméke . Ennél is fontosabb, hogy a hisztonok szerepe a DNS-szintű expresszió szabályozásában hiányzik az anukleáris vérlemezkékben.

Az aszpirin hatása a vérlemezkék anyagcseréjére

A vérlemezkék anyagcseréje elsősorban oxidatív, ellentétben a neutrofilekkel, amelyek elsősorban glikolitikusak . Az anaerob glikolízis blokkolása nem csökkenti az ATP-t és nem gátolja a vérlemezkék működését sem. Kimutatták, hogy a trikarbonsavciklus (TCA) enzimeinek és az elektrontranszportlánc (ETC) komponenseinek acetilálása gyakori szabályozási módszer, különösen az anyagcserében részt vevő enzimek esetében, mint például a malát-dehidrogenáz a szénanyagcserében , a lipidanyagcsere szabályozásában , és a karbamidciklusban az ammónia méregtelenítésében . Ebből következik, hogy a TCA-ciklus enzimeinek és ETC-komponenseinek acetilációja jelentős hatással lehet a vérlemezkék bioenergetikájára. Az aszpirin acetilációjának proteomikai vizsgálatai következetesen kimutatták a szénhidrát- és zsírsavszintézis közötti váltást szabályozó malát-dehidrogenáz , valamint az izocitrát-dehidrogenáz aszpirin által közvetített acetilációját, amelyet a mitokondriumokban a sirtuin (Sirt3 és Sirt5) fehérjék által történő deacetiláció szabályoz . A Sirtuin deacetiláz aktivitás számos TCA enzimhez kapcsolódik a mitokondriális mátrixban, és feltehetően szabályozza az antioxidáns regenerációt, a TCA fluxus szabályozását és az anapleurozist . Bár a jelen áttekintés elkészítésekor és nyomtatásakor nem tudunk olyan vizsgálatról, amely közvetlenül a metabolikus enzimek aszpirin által közvetített acetilációjának mértékével vagy az aszpirin metabolikus fluxusra gyakorolt hatásával foglalkozott volna, a proteomikai bizonyítékok arra utalnak, hogy ez az aszpirin fontos, nem kanonikus hatása lehet a vérlemezkék biokémiájára.

Az aszpirin hatása a vérlemezkék lokalizációjára a tumorokban

Új bizonyítékok merülnek fel arra vonatkozóan, hogy maguk a vérlemezkék jelentős szerepet játszhatnak a karcinogenezisben, pontosabban az áttétképződésben. Olyan egér metasztatikus modellekben, ahol a tumorsejteket közvetlenül a keringésbe injektálják, a keringő vérlemezkeszám csökkentésére irányuló stratégiák hatékonynak bizonyultak a tumorterhelés csökkentésében . Más vizsgálatok metasztatikus modellekben, ahol az alvadási hatás fokozása érdekében oldható fibrint és tumorsejteket együttesen injektáltak, az áttétképződés megnövekedett in vivo előfordulását mutatták ki . Ezeket a vizsgálatokat in vitro kísérletek is alátámasztották, ahol az oldható fibrin fokozta a vérlemezkék és a tumorsejtek közötti kölcsönhatásokat tenyésztési körülmények között . Ezek a vizsgálatok alátámasztják azt a hipotézist, hogy a vérlemezke-aggregáció aktiválása a fibrin várható növekedése mellett növeli a vérlemezkék tapadását a tumorsejtekhez, és elősegíti az áttétes terjedést. A fibrin mellett további tanulmányok vizsgálták a trombin, a PAR-1 és a VII. véralvadási faktor (FVII) szerepét , és ezek összefüggését a rákos sejtek életképességének fokozásával , a rák növekedésével és terjedésével , a tumor rosszindulatúságának fokozásával és az áttétképződés támogatásával .

A szisztémás keringésben lévő tumorsejtek biológiájának modulálása mellett a vérlemezkékről is kimutatták, hogy fontos szerepet játszanak a tumorsejtek növekedésében. Egy vizsgálatban kimutatták, hogy az aszpirin jelentősen csökkentette a petefészekrák proliferációs sejtjeinek mértékét mind in vitro, mind in vivo . Ugyanez a tanulmány azt is megállapította, hogy a vérlemezkék aktiválása növelheti a proliferációt és a tumorsejtek növekedését a tumorsejtek és a vérlemezkék együttes inkubációja után. A vérlemezke-adhéziós receptorok, köztük a GPIβα, a GPIIβIIIα és a P-szelektin gátlása azonban nem csökkentette a vérlemezkék proliferatív hatását. Ez arra utal, hogy a vérlemezkék által szekretált fehérjék és más faktorok szerepet játszhatnak a tumorsejtek növekedésének szabályozásában. Megfigyelték például, hogy a trombocita TGF-β1 csökkentése csökkentette a trombocitáknak kitett petefészekráksejtek proliferációját . Továbbá az aszpirin a TXA2-t és PGE2-t magában foglaló COX-1 mechanizmuson keresztül megakadályozza a vastagbélrák áttétképződését, ami arra utal, hogy az aktivált vérlemezkék a COX-1 függő prosztaglandin termelésen keresztül támogathatják az áttétképződést. Végül egy új aszpirin-foszfotidil-kolin konjugátum (aszpirin-PC) a VEGF és a tromboxán felszabaduláson keresztül megzavarja a vérlemezke-tumorsejt indukálta epiteliális-mesenchymális átmenetet (EMT). Azt is megállapították, hogy ez a készítmény gátolja a sejtproliferációt és az angiogenezist, miközben növeli az apoptózist petefészek- és vastagbélrákos sejtmodellekben.