A Delta-Delta Ct módszer vagy Livak-módszer a qPCR-adatok elemzésének legkedveltebb módszere. Azonban csak bizonyos kritériumok teljesülése esetén használható. kérjük, olvassa el az előadás jegyzetét, hogy megbizonyosodjon arról, hogy ezek a kritériumok teljesülnek. Ha nem, akkor az általánosítottabb módszer az úgynevezett Pfaffl-módszer. Kérjük, olvassa el a kiegészítő olvasmányanyagot, hogy további információkat kapjon erről a módszerről.
Itt vannak a Livak-módszer lépései:
Az Excel-fájl az összes számítással a Blackboardon található qPCR analízis mappában található.
Megvan a nyers Ct (a küszöbérték eléréséhez szükséges ciklusok száma) a normál és a tumorsejtekre (3 ismétlés mindegyikre).
Normalizálás¶
Először is ki kell számolni a relatív különbséget az érdeklődésre számot tartó gén (p53) és a házőrző gén (GAPDH) között.
∆Ct = Ct (érdekes gén) – Ct (házőrző gén)
A kontroll minták (normál sejtek)¶
Mivel összehasonlítjuk a tumorunkat (kezelés) a kontrollhoz (normál sejtek), először átlagolnunk kell a 3 kontroll (normál) minta ∆Ct értékét.
Kalkuláljuk ki a ∆∆Ct-t a ∆Ct normál átlagához viszonyítva. sejtek¶
∆∆Ct = ∆Ct (daganatos minta) – ∆Ct (normál átlag)
Ezt a normál minták esetében is elvégezheti. Használjon $ jeleket az oszlopszám és a nyers betű (nyilak) előtt a cella rögzítéséhez.
Kétszeres génexpresszió minden egyes mintára¶
GYőződjön meg róla, hogy a negatív ∆∆Ct-t a kettő hatványára emeli.
Kétszeres génexpresszió = 2^-(∆∆Ct)
Általános hajtásváltozás¶
A daganatos és normál mintákra egyaránt kiszámíthatja az átlagos hajtásváltozást. E kettő hányadosa a daganatos és normál minták közötti hajtásváltozás.
Log transzformáció¶
A parametrikus statisztikai tesztek, például a T-próba elvégzéséhez tanácsos a végleges génexpressziós eredményeket log értékekre (bármely logbázis) transzformálni. Ezáltal az adatok eloszlása szimmetrikus lesz.
Itt a 2^-(∆∆Ct) értéket log 10-re változtattuk.
T-test¶
A parametrikus tesztek használatakor óvatosnak kell lenni, ha az adatok nem normális eloszlásúak, ez téves következtetésekhez vezethet.
Válassza ki a 2^-(∆∆Ct) értékek log 10 értékét normál és daganatos mintákra a jelzett módon. Használjuk a kétfarkú tesztet (2-es szám) és feltételezzük az egyenlőtlen varianciát (3).
A kapott P-érték kisebb, mint 0,05, ezért elutasítjuk a nullhipotézist, és a két minta átlaga szignifikánsan különbözik 0,05 szinten.
