Heparin-indukált trombocitopénia (HIT) – Egy ésszerű laboratóriumi megközelítés (remélhetőleg)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: Január 28, 2020

Heparin-indukált trombocitopénia (HIT) – Egy ésszerű laboratóriumi megközelítés (remélhetőleg)

Még 1980-ban kaptam az első kérést egy olyan rendellenesség vizsgálatára, amelyet soha nem tapasztaltam. Intézményünk hematológusa azzal a kéréssel érkezett, hogy megnézze, van-e intézményünkben egy betegnél esetleg heparin-indukált trombocitopénia (HIT). Akkoriban még soha nem hallottam erről a rendellenességről, ezért a régi módszerhez kellett folyamodnom, amikor az Index Medicusban (tényleges könyvekben) kerestem utána. Abban az időben nem találtam semmilyen laboratóriumi eljárást a környékünkön, ezért küldetésbe kezdtem, hogy egy validált módszert szerezzek, hogy segíthessek ennek az orvosnak a témának a kezelésében. Később találtam egy módszert, amely a fénytranszmissziós aggregometriát (LTA) használja. Ez az eljárás normál donor vérlemezkékben gazdag plazmát (PRP) és beteg donor szérumot használt többféle UFH-koncentrációval az aggregációs reakció ellenőrzésére. Ezt egy kétcsatornás LTA Chronolog aggregométerrel végezték. Nem tudom megadni a hivatkozást, mert a Pubmed csak 1983-ig nyúlik vissza a témában.

Aztán meg kellett tanulnom, miről szól a HIT. A HIT egy olyan immunválasz utóhatása, amely ellentmondásos vagy “paradox” reakció. Gyógyszer okozta immuntrombocitopéniát okozhatnak olyan gyógyszerek, mint a kinin és a vancomycin, amelyek azonnali és drasztikus trombocitopéniát (<20 x 109/L) okoznak, ami súlyos vérzést okoz. A valódi HIT-reakcióban szenvedő személy a heparin elkezdése után kezdődően, 5 vagy több nap elteltével elveszítheti a vérlemezkék 50%-át, de vérzéses problémák helyett trombotikus problémák alakulnak ki.

A HIT egy IgG antitestek által okozott immunválaszprobléma. Az antitestek a frakcionálatlan heparin (UFH) és az alacsony molekulasúlyú heparin (LMWH) hatására alakulnak ki. Előfordulása az UFH-terápiára adott válaszként 0,5-5%. LMWH-terápia esetén a HIT előfordulása tizede annak, ami UFH mellett megfigyelhető.

A HIT olyan betegség, amely az orvostól gyors döntéseket igényel a betegre gyakorolt katasztrofális következmények megelőzése érdekében. A 4Ts pontszámot a vérlemezkeszámmal együtt használhatják arra, hogy eligazodjanak a laboratóriumi vizsgálati protokollok elrendelésében: A 4Ts egy, a klinikai gyakorlatban széles körben alkalmazott, a HIT-tel kapcsolatos elővizsgálati pontozási rendszer. Lásd az alábbi táblázatot. A cím a HIT négy jellemzőjére utal:

• Trombocitopénia
• Trombocitopénia időzítése a heparin expozícióhoz képest
• Trombózis vagy a HIT egyéb következményei
• A trombocitopénia egyéb okainak valószínűsége

Táblázat. 4Ts pontszám

.

Jellemző	Score
	2 pont	1 pont	0 pont
Thrombocitopénia	>50%-os csökkenés és trombocita nadír 20-at.100 × 109/L	30%-50%-os csökkenés vagy vérlemezke nadir 10- 1019× 109/L	< 30%-os csökkenés vagy vérlemezke nadir < 10×109/L
A vérlemezkeszám csökkenésének időzítése	Tisztulás az 5-10. napon, vagy ≤1 d, ha a heparin expozíció az elmúlt 30 d-en belül	megegyezik az 5-10. napi eséssel, de nem egyértelmű (pl. hiányzó trombocita számok); 10. nap utáni kezdet; vagy ≤1 napos csökkenés, ha a heparin expozíció 30-100 nappal ezelőtt történt	Trombocita szám csökkenés ≤4 d a közelmúltbeli heparin expozíció nélkül
Trombózis vagy egyéb következmény	Újabb trombózis (megerősített); bőrnekrózis a heparin injekciós helyeken; anafilaktoid reakció az intravénás heparin bolus után; mellékvesevérzés	progresszív vagy ismétlődő trombózis; erythemás bőrelváltozások; trombózis gyanúja, de nem bizonyított	Nincs
A trombocitopénia egyéb okai	Nincs nyilvánvaló	lehetséges	Meghatározatlan

A maximális pontszám 8. A 6-8-as pontszám a HIT nagy valószínűségét jelzi. A 4-5-ös pontszám a HIT közepes mértékű jelenlétét jelzi, a 0-3-as pontszám pedig a HIT jelenlétének alacsony valószínűségét.3,4

Ha a HIT gyanúja emelkedett 4Ts pontszám alapján merül fel, a laboratórium segít az orvosnak a pontos diagnózis felállításában. Ezt többféle vizsgálattal is el lehet végezni. Ezek általában két osztályba sorolhatók: immunológiai és funkcionális. Az alábbiakban a betegség laboratóriumi vizsgálatában leggyakrabban alkalmazott vizsgálatokat tárgyaljuk.

A HIT laboratóriumi diagnosztikai vizsgálata

HIT Immunoassay: PF4/heparin ellenes antitestek kimutatására szolgáló vizsgálatok

Enzim immunoassay (EIA) (IgG kimutatása)

EIA (polispecifikus antitestek kimutatása)

Ezek a módszerek általában PF4-függőek, nagy érzékenységgel. A HIT alanyok 97%-ban pozitívak lesznek a szilárd fázisú készletekkel. Ezek széles körben elérhetőek a kereskedelemben. A módszereket általában tételesen tesztelik a módszer hosszadalmassága miatt. A gyengén pozitív eredmények azonban alacsony specificitásúak lehetnek. A pozitivitásra vonatkozó irányelveket minden laboratóriumi környezetben fel kell állítani.

– IgG-specifikus kemilumineszcens próba (CLIA)

-A kemilumineszcens immunpróba (CLIA) egy gyors automatizált eljárás, amely PF4/polyvinil-szulfonáttal (PVS) bevont mágneses részecskék segítségével kimutatja az anti-PF4/heparin antitesteket. Az inkubációt, a mágneses elválasztást és egy mosási lépést követően izoluminollal jelölt antihumán IgG antitestből álló nyomjelzőt adunk hozzá, amely a részecskéken lévő anti-PF4/heparin antitestekhez kötődik. Egy második inkubáció, mágneses elválasztás és mosás fejezi be a reakciót. A mért anti-PF4/heparin antitestek koncentrációjával arányos OD-értéket kapunk. A vizsgálatot általában igény szerint, körülbelül 30 perces átfutási idővel végzik el. Egy vizsgálatban, amelyben ezt a módszert az arany standard szerotonin-felszabadulási teszttel (SRA) hasonlították össze, a tesztek korrelációja kiemelkedő volt a specificitás és az érzékenység tekintetében (98,8/97,0%).6

– Latex immunturbidometriás teszt (LIA) a (HIT-re).

A LIA-t immunoassay-nak minősítik. Abban különbözik a legtöbb más immunoassaytól, például az EIA-tól, hogy a PF4/heparin-reaktív antitestek jelenléte a beteg plazmájában a HIT-et imitáló monoklonális antitesttel való versengés révén a részecskeagglutináció gátlását eredményezi. Ennek megfelelően az LIA-t “funkcionalizált immunvizsgálatnak” nevezték el, ami elméletileg azt sugallja, hogy olyan diagnosztikai specificitást biztosíthat, amely a magasan specifikus funkcionális vizsgálat, az SRA, és a kevésbé specifikus PF4-függő EIA-módszerek között helyezkedik el. Ez egy könnyen automatizálható eljárás, amelynek átfutási ideje körülbelül 20 perc. A vizsgálatok 97,4%-os érzékenységet és 91,2%-os specificitást mutattak ki.7

Laterális áramlásos vizsgálat (STiC):

A laterális áramlásos immunoassay-próbák a PF4/polyanion-komplexek elleni IgG antitesteket mutatják ki egy értékelő kártyán, amelyen az eredményeket vizuálisan olvassák le. A 10 perces inkubációs idővel ez egy gyors módszer a HIT jelenlétének meghatározására.

Funkcionális HIT-próbák: A vérlemezkék megkötésére és aktiválására képes antitesteket kimutató tesztek

Serotonin felszabadulási teszt (SRA) – Heparin-indukált vérlemezke-aktivációs teszt (HIPA) – Trombocita aggregációs teszt (PAT) – Áramlási citometrián alapuló tesztek.

Serotonin felszabadulási teszt (SRA): HIT megerősítő teszt

Ez a módszer a vérlemezkéket aktiváló antitesteket mutatja ki. Az SRA a vérlemezkékből felszabaduló radioaktívan jelölt szerotonint méri.9,10 A pozitív eredményhez > 20% szerotonin felszabadulás szükséges alacsony dózisú UFH mellett és < 20% felszabadulás magas UFH szint jelenlétében. Ezt a módszert a múltban általánosan elismerték a megerősítő vizsgálatok arany standardjának. Érzékenysége és specificitása 95%-os. Az SRA felveszi a trombocitaaktiváló antitestek kimutatását. Ez rendelkezik a legnagyobb érzékenységgel/specifikussággal a klinikai HIT esetében. Az SRA jóval nagyobb diagnosztikus specificitással is rendelkezik, mint az EIA. Az SRA-t nem szabad szűrővizsgálatként elvégezni korábbi pozitív EIA-eredmény nélkül. Ez segít kizárni a hamis pozitív SRA kérdését. Ha egy pozitív SRA-val rendelkező alanyi mintában negatív EIA-t találnak, ez “vörös zászlós figyelmeztetés” kell, hogy legyen, hogy az SRA-módszert értékelni kell.

Az SRA információt adhat arról is, hogy a HIT szérumminta heparin hiányában is erős trombocita-választ produkálhat. A heparin-független trombocita-aktiváció a HIT rendkívül súlyos jelenlétére figyelmeztet. Ez a lelet jelezheti a késleltetett kezdetű HIT-et és az erős pozitív HIT-et fogyasztási koagulopátia jelenlétével, amely mikrovaszkuláris trombózis kockázatával járhat.

A vizsgálat összetett, drága és időigényes. Normál donor vérlemezkékre van szükség (nehéz standardizálni az egyéni normális donorreakciók miatt). Ezért ez egy viszonylag nem standardizált teszt, amelyet nem használnak széles körben.9,10

Heparin-indukált trombocita aktivációs teszt (HIPA):

Ez a módszer egy mosott trombocita aktivációs teszt, amelyet jellemzően csak Európában végeznek. Ezt a vizsgálatot vérlemezke-aggregációval végzik, és vizuálisan határozzák meg a vérlemezke-aktivációs végpontot.10 Ehhez képest az SRA-t úgy végzik, hogy a vérlemezkéket rázógépben vizsgálják, és 60 percig reagálnak. A HIPA abban különbözik, hogy kevert trombocitákat használ, és 45 percen keresztül 5 perces időközönként vizuálisan olvassa le.

Egyes vizsgálók megfigyelték, hogy a HIPA módszer érzékenyebb a trombocitaaktiváló antitestek kimutatására, mint az SRA eljárás. Ez az eredmény azonban lehet, hogy nem patogén antitesteket vesz fel, ami a diagnózis specifitásának csökkenéséhez vezet.6

Hrombocita-aggregációs vizsgálatok

(LTA: fénytranszmissziós aggregometria)/WB: teljes vér aggregometria):

A fénytranszmissziós aggregometria (LTA) aggregometria volt az első olyan vizsgálat, amelyet a HIT antitestekre adott minőségi trombocita-válasz meghatározására használtak. Úgy végzik, hogy normál donor PRP-t és beteg PRP-t helyeznek egy küvettába, amelyet kevergetnek. A keverékhez különböző koncentrációban heparint adunk, és 15 percig figyeljük az aggregációt. Ha egy minta aggregációt mutat, magasabb heparin-koncentrációt adunk hozzá, hogy meghatározzuk azt a pontot, ahol az aggregáció gátolva van. Ez egy pozitív vagy negatív minőségi eredmény meghatározását jelenti: negatív, gyenge pozitív vagy erős pozitív (0, 2, 3). Ezt a vizsgálatot ma már nem használják az ezzel járó munkaigény és a viszonylag alacsony érzékenység miatt.11

– A teljes vér (WB) trombocita aggregometria normál donor vérlemezkék és a beteg teljes vérének vagy szérumának keverékét használja, a használt aggregométertől függően. Ha ez az információ nem ismert, a donornak O vércsoportúnak kell lennie. A teljes véradó(ka)t előminősíteni kell (HIT pozitív minta felhasználásával), hogy a minta reagáljon az antitesttel. A WB-módszertől függően a mintát normál 3,2%-os nátrium-citrátos csőbe vagy speciális hirudingyűjtő csőbe lehet venni. Mindkét módszer az impedancia-aggregometria egy formáját alkalmazza. Mindkét módszer esetében a heparint és a vérmintákat inkubálják, és az aggregációt impedancia-aggregometriával figyelik meg. Az aggregációs reakciót mutató mintákat ezután magasabb heparinkoncentrációval kezelik, amíg nem állapítanak meg aggregációt. A WB vérlemezke-aggregometriát kvantitatív vizsgálatnak tekintik, és 0-3 közötti értékeket adnak meg, attól függően, hogy a megfigyelt aggregáció csökkentéséhez milyen heparinkoncentrációra van szükség.11

Áramlási citometria a HIT jelenlétének megállapítására

A HIT áramlási citometriás értékelésére a vérlemezke P-szelektin expressziós vizsgálatot (PEA) használják. Amint azt korábban tárgyaltuk, a SRA módszer az “arany standard” a megerősítő vizsgálatra, hogy felismerje a PF4-et felismerő antitesteket a heparin jelenlétében lévő kompexben. Néhány heparinnal kezelt, HIT jelenléte nélkül kezelt betegnél pozitív lehet az antitestek kimutatása. Az SRA általában csak speciális referencialaboratóriumokban áll rendelkezésre. A módszer időigényes, technikailag igényes és kiterjedt. A gyors átfutási idő nem lehetséges, ami tovább késlelteti a diagnózist a HIT jelenlétére vonatkozóan, amely azonnali kezelést igényel az esetleges életveszélyes problémák megelőzése érdekében. Egy nemrégiben végzett vizsgálatban az SRA-módszert az áramlási citometriás rendszert használó PEA-technikával összehasonlítva értékelték. A vizsgálatok a PF4-függő P-szelektin expressziós vizsgálatot a PEA-t használják. Egy retrospektív vizsgálatot végeztek 91 alany tárolt szérummintáin. Minden vizsgált beteg rendelkezett korábbi HIT 4Ts információval, amely a következőket tartalmazta: trombocitopénia, a vérlemezkeszám-vesztés időpontja, trombózis diagnózisa és a trombocitopénia bármely más esete. Minden olyan alany, akinek a 4Ts pontszáma közepes volt, és a PF4 EIA tesztje emelkedett, OD ≥2,0 vagy a 4Ts pontszáma emelkedett, és a PF4 EIA tesztje alacsonyabb, OK ≥1,0 volt, HIT pozitívnak minősült; a többi mintát HIT negatívnak minősítették.

A vizsgálatban a PEA magasabb diagnosztikus eredményt mutatott (görbe alatti terület 0,92 vs. 0,82;P-0,02), mint az SRA. A 16 PEA-pozitív és SRA-negatív szérummintából tizenegy volt HIT-pozitív. A szerzők megállapították, hogy más tanulmányok, amelyekben hasonló vérlemezke-markerrel rendelkező mintákat és sorozatosan hígított, megerősített HIT-diagnózissal rendelkező alanyoktól származó mintákat használtak, kimutatták, hogy a PEA érzékenyebb, mint a thSRA a vérlemezke-aktiváló antitestek tekintetében.

Ezért arra a következtetésre jutottak, hogy a PEA-t egyszerűbb elvégezni, és az eredmények pontosabb eredményt mutatnak a HIT meglétének diagnosztizálásakor.13

Egy másik áramlási citometrián alapuló vizsgálat az IQ Products HITAlertje. Egy 2013-as tanulmányban a HITAlert áramlási citometriás módszerrel protokollt dolgoztak ki a HIT-ek kimutatására egy tercier kórházi laboratóriumi környezetben. Összehasonlították a 4Ts pontszámot a HIT esetleges jelenlétének szűrésére 37 alany esetében. A szérumot a HITAlert áramlási citometriás módszerrel vizsgálták a HIT-antitestek jelenlétére, majd összehasonlították egy antigénvizsgálattal. Az összehasonlító módszerek a részecske gél immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assay és két funkcionális teszt voltak. A Multiplate WBA (az USA-ban és Kanadában nem elérhető) és az SRA módszereket használták. Eredményeik a következők voltak: Az áramlási citometria a 37 beteg közül 14-nél mutatott ki HIT-pozitív eredményt. A 4Ts pontszámban alacsony (8-ból 0), közepes (19-ből 5 0) és magas (10-ből 9). Az SRA-val összehasonlítva az áramlási módszer specificitása 100%-os, szenzitivitása 81%-os volt a HIT jelenlétének azonosítására. Az áramlási citometriás elemzéssel összehasonlítva a WBIA funkcionális teszt szintén 81%-os érzékenységgel és 90%-os specifikussággal rendelkezett. A PaGIA-eljárás azonban csak 20%-os specificitással, de 20%-os érzékenységgel rendelkezett. Az áramlási citometria javította az antigénes eljárás specifitását. Ez leginkább a 4T közepes kockázatú csoportban volt szembetűnő. Ez a protokollban alkalmazott mindhárom funkcionális módszer esetében nyilvánvaló volt. A vizsgálók arra a következtetésre jutottak, hogy a HITAlert áramlási citometriás módszer az érzékenység elvesztése nélkül javíthatja a HIT azonosításának specificitását.12 Ez a vizsgálat csak kutatási célokra szolgál az Egyesült Államokban és Kanadában, diagnosztikai eljárásokhoz nem áll rendelkezésre.

Összefoglaló a HIT kimutatásához

Meg szeretném zárni egy algoritmussal, amely a Cuker et al. által a #14-es hivatkozásban található, és amelyet a HIT diagnózisához ajánlanak. Ez a diagnosztikai algoritmus a közepes/magas 4Ts pontszám, majd immunpróba, majd funkcionális vizsgálat, amely a következőket eredményezi: – Kevés hamis negatív eredmény (elhibázott HIT diagnózis), és – Kevés hamis pozitív eredmény vagy annak hiánya (HIT téves diagnózisa).

Megjegyzés: A nagy valószínűségű csoportba tartozó betegek esetében a 4Ts pontszám és a nagyon erősen pozitív immunpróba (ELISA-érték > 2) alapján nem feltétlenül szükséges funkcionális vizsgálat.0 OD egység).

A HIT jelenlétének gyakorisága egy olyan mellékhatás, amelyet a PF4/heparin komplexeket célzó trombocitaaktiváló antitestek mérsékelnek. A laboratórium felelőssége, hogy meghatározza a megfelelő laboratóriumi vizsgálatokat a heparin által indukált antitestek jelenlétének vagy és a vérlemezkék aktiválására való funkcionális képességének azonosítására. Ezeket a vizsgálatokat időben el kell végezni, hogy segítsék az orvosokat a katasztrofális trombotikus helyzetek megelőzésében.

1. Prince M, Wenham T. Heparin-indukált trombocitopénia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Unfractionated heparin versus low molecular weight heparins for avoiding heparin-induced thrombocytopenia in postoperative patients. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Áttekintés. Frissítve in: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. A 4Ts pontrendszer prediktív értéke a heparin-indukált trombocitopéniára: szisztematikus áttekintés és metaanalízis. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Evaluation of pretest clinical score (4 T’s) for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia in two clinical settings. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Az optikai sűrűségmérések kvantitatív értelmezése PF4-függő enzim immunoassays segítségével. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. A heparin-indukált trombocitopénia laboratóriumi diagnosztikája. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. A heparin-indukált trombocitopénia diagnózisára szolgáló trombocitaellenes 4/heparin faktor enzimhez kötött immunszorbent teszt klinikai értelmezésének javítása a receiver operating characteristic analysis, a rétegspecifikus likelihood ratios és a Bayes-tétel alkalmazásával Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratory testing protocols for heparin-inducd thrombocytopenia (HIT) testing. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. A vérlemezkék szerotonin felszabadulásának vizsgálata. Am J Hematol… 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? A heparin indukálta trombocitopénia laboratóriumi vizsgálatainak átfogó kortárs vizsgálata. Pathology. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital. Blood Coagul and Fibrinolysis. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. Egy új, PF4-függő trombocitaaktivációs teszt azonosítja a heparin által valószínűsített trombocitopéniás/thrombózisban szenvedő betegeket. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).