A Biotage ügyfeleink érdekes és változatos háttérrel rendelkeznek, a magasan képzett szintetikus kémikusoktól kezdve a természetes termékek kémiájának szakértőin át egészen azokig, akik még csak most kezdik az útjukat a kémiával. A kromatográfia “művészetében” eltöltött több mint 40 éves pályafutásom során azt tapasztaltam, hogy e kiváló emberek közül sokan nem értik a kromatográfiás alapelveket. Ez a megértés hiánya, úgy vélem, csak az alaptantervüknek köszönhető, ahol az elválasztástudományt eszközként használják a laboratóriumi munka során, de a keverék összetevőinek elválasztása (vagy nem elválasztása) mögött meghúzódó elveket talán nem magyarázzák el, nem értik meg és nem tanulmányozzák hatékonyan.
A kromatográfiának négy alapvető típusa van, többek között:
- Gáz-folyadék kromatográfia (GC)
- Folyadék-folyadék kromatográfia (LLC)
- Folyadék-szilárd kromatográfia (LSC)
- Size exclusion/gel permeation chromatography (SEC/GPC)
Ebben a bejegyzésben a folyadék-szilárd kromatográfiára fogok koncentrálni.
Folyadék-szilárd kromatográfia
A fent említett technikák közül ez a legnépszerűbb, mivel a félig illékony és nem illékony vegyületek elválasztására alkalmas. Mivel a vegyületek elválasztó oszlopról történő eluálásához nincs szükség hőre (mint a GC esetében), a folyadék-szilárd kromatográfiához különböző polaritású, egymással keverhető oldószer vagy oldószerkeverék használata szükséges ahhoz, hogy a minta kémiai összetevői elváljanak egymástól.
Az LSC-nél a mintát szilárd hordozóra vagy állófázisra töltik. A minta komponensei kötődnek az állófázishoz, de különböző mértékben. Az állófázissal való kölcsönhatás mértéke szabályozza az elválasztás sebességét és hatékonyságát. Tehát minél nagyobb a vonzás az állófázishoz, annál hosszabb időre van szükségük a vegyületeknek az eluáláshoz. Az erősen kötött vegyületek eluálásának elősegítése érdekében az oldószer arányának idővel változnia kell (növekvő erősségű).
Az LSC területén belül számos különböző kromatográfiás technika létezik…
- Papírkromatográfia (PC)
- Vékonyréteg-kromatográfia (TLC)
- Magas…teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC)
- Flash kromatográfia (FC)
- Ioncserélő kromatográfia (IX)
- Affinitás kromatográfia (AC)
- Királis kromatográfia (CC)
- Superkritikus folyadék kromatográfia (SFC)
Ebben a bejegyzésben a flash kromatográfiával foglalkozom, amelynek alapelvei megegyeznek a HPLC-vel. Mindkettő állófázissal töltött oszlopot használ, amelybe a mintát befecskendezzük, és amelyen keresztül az oldószert átpumpáljuk. A flash-kromatográfia azonban nagyobb oszlopokat használ, mint a HPLC, amely többnyire analitikai elválasztási technika.
A flash-kromatográfia egy preparatív kromatográfiás technika, amelynek oszlopai szintén szilárd hordozóval vagy közeggel vannak töltve, amely nagyobb részecskemérettel rendelkezik, mint a HPLC oszlopai. Ezek a hordozó- és oszlopméretbeli különbségek lehetővé teszik, hogy a flash-kromatográfiás oszlopok több vegyületet tisztítsanak grammonként, mint a HPLC.
- A flash-kromatográfia 15 µm-től akár 60 µm-es hordozó részecskéket használ
- A HPLC 1,7 µm-től 10 µm-es hordozó részecskéket használ
Mi történik az oszlopon belül
A legtöbb flash-kromatográfia és HPLC normál fázisú vagy fordított fázisú módszerrel történik. Az e módszertanok közötti különbségek az állófázis kémiájában és a keverék egyes kémiai összetevőinek elválasztására használt oldószerekben rejlenek.
- A normál fázisban nem poláris és mérsékelten oldószereket (pl. hexán és etil-acetát) használnak mozgófázisként, és poláris közeget (pl.pl. szilícium-dioxid) mint állófázis
- A fordított fázis éppen az ellenkezője, poláris oldószereket és nem poláris állófázist használ
Mivel ezek a módszerek egymás “poláris” ellentétei (szójátéknak szánták), a legtöbb vegyület elúciós sorrendje megfordul. Itt történik a kromatográfiás elválasztások mögötti kémia.
Fókuszáljunk most a normálfázisúra.
Normálfázisú kromatográfia
A normálfázisú kromatográfiánál a keveréket (pl. reakcióelegyet, természetes termékkivonatot stb.) alkotó kémiai vegyületeket megfelelő oldószerben feloldjuk és az oszlopba injektáljuk. Amikor a keverék érintkezik a poláros állófázissal, mondjuk szilícium-dioxiddal, a keverék vegyületei és oldószerük a mozgófázissal versenyeznek a szilícium-dioxid kötőhelyeiért. Minél polárisabb a vegyszer, annál erősebben vonzza a szilícium-dioxidot. Ezt a vonzást nevezzük adszorpciónak (más, mint abszorpció).
Az abszorpció az, ami akkor történik, amikor egy szivacs vagy papírtörlő kölcsönhatásba lép egy folyadékkal. Az adszorpció fizikai és kémiai kölcsönhatások kombinációja, ahol a szilícium-dioxid poláris felülete kémiailag megköti a vele érintkező kémiai összetevőket, főként a hidrogénkötésnek és a van der Walls-erőknek nevezett jelenségeknek köszönhetően.
Amikor bármilyen vegyi anyag száraz szilícium-dioxiddal lép kölcsönhatásba (ahogyan azt egy új flash-oszlopnál használják), adszorpció következik be. Ez a kölcsönhatás hőt szabadít fel, ami problémákat okozhat a vegyület stabilitásában és a kromatográfiás eredményekben. Emiatt a szilícium-dioxid oszlopokat a minta bevezetése előtt általában alacsony polaritású oldószerrel egyensúlyba hozzák (előnedvesítik). Az alacsony polaritású oldószerek (pl. hexán, heptán, ciklohexán) gyenge oldószerek, és nem jól adszorbeálódnak a szilika vagy más poláros közegek által.
A szilika felületi kémiája hidroxilcsoportok (szilanolok) és szil-éterek keveréke, 1. ábra. Ezek a funkciós csoportok polárisak, feltételezhetően negatív töltésűek, és elektronhiányos vegyületeket adszorbeálnak. Az aromás vegyületek pi-felhői az adszorpció során hidrogénkötést tudnak kialakítani a szilícium-dioxid hidroxilcsoportjaival.1
1. ábra. A kromatográfiás szilícium-dioxid kémiája szilanolok és szil-éter funkcionalitások keverékéből áll. Ezek a részek hidrogénkötés/adszorpció révén kötődnek a vegyi anyagokhoz.
A jó mintakomponens-kötés (adszorpció) biztosításához a tisztítandó mintát vagy gyenge oldószerben kell feloldani és az oszlopba tölteni (folyékony töltés), vagy erősebb (poláros) oldószerrel kell feloldani, inert közeggel (pl. szilícium-dioxid, diatómaföld) keverni, szárítani és egy másik, a tisztítóoszlophoz sorban elhelyezett oszlopba tölteni (száraz töltés). A száraz betöltés kiküszöböli a folyékony betöltés során felmerülő számos problémát, különösen a poláros oldószerben oldott minta esetében.
A minta betöltése után a mozgófázisú oldószerek bevezetése következik. Az elválasztás eléréséhez azonban a mintakomponenseknek különböző sebességgel kell desorbálódniuk az állófázisból. Bár ez állandó polaritású oldószerrel is elérhető (izokratikus elúció), jobb tisztítás jellemzően olyan mozgófázis használatával érhető el, amely alacsony polaritással indul, és idővel növeli a polaritását. Ezt nevezzük gradiens elúciónak.
Gradiens esetén az alacsony polaritású oldószerben jobban oldódó vegyületek (alacsonyabb polaritású vegyületek) deszorbálódnak először és haladnak át az oszlopon. Ahogy a mobilfázis oldószerének polaritása növekszik, az adszorbeált vegyületek az egyre polárosabb mobilfázisban való oldhatóságuk alapján különböző sebességgel deszorbálódnak a hordozóról, 2. ábra.
2. ábra. Fent – Izokratikus elúció (állandó mobilfázis-polaritás) esetén a vegyületek lassabban deszorbálódnak, mint gradiens alkalmazásakor (lent). A gradiens elúció általában jobb elválasztást/tisztítást biztosít, mint az izokratikus elúció.
A normálfázisú kromatográfia érdekes jellemzője, hogy ha egy vegyület egyszer deszorbálódik a közegből, soha többé nem adszorbeálódik, mert az egyre polárosabb mobilfázis előnyösen adszorbeálódik helyette.
A vegyületek közötti polaritásbeli (kötőerősségbeli) különbségek lehetnek olyan finomak, mint egy másik funkciós csoport hozzáadása, funkciós csoport elhelyezkedésbeli különbségek (Parida, 2006), mint egy aromás gyűrűn, vagy olyan markánsak, mint teljesen eltérő szerkezetű vegyületek, 3. ábra.
3. ábra. Különböző polaritású vegyületek elkülönítése a funkciós csoport típusa és a molekulán való elhelyezkedése alapján. Elúciós sorrendben – naftalin (nincs poláris funkcionalitás), 1-nitronaftalin, o-nitroanilin, m-nitroanilin, p-nitroanilin. A nitroanilinek csak a nitrofunkciós csoportnak az aminhoz viszonyított elhelyezkedésében különböznek.
Összefoglalva tehát, a normálfázisú kromatográfiás elválasztások a vegyületek polaritásának (nyilvánvaló és finom) különbségein, az állófázishoz való vonzódásukon és a mozgófázisban való oldhatóságukon alapulnak. A legjobb tisztítási eredmények elérése érdekében az oldószeres felderítés TLC segítségével ajánlott.
Ha többet szeretne megtudni a flash-kromatográfiáról, töltse le a Sikeres flash-kromatográfia című fehér könyvünket.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
