Biotage の顧客は、高度な合成化学者、天然物化学の専門家、化学の道を歩み始めたばかりの人など、興味深く多様な経歴を持つ人たちです。 クロマトグラフィーの「アート」において40年以上のキャリアを持つ私が学んだことは、これらの優れた人々の多くが、クロマトグラフィーの原理を理解していないことです。 この理解不足は、研究室での作業で分離科学をツールとして使用するものの、なぜ混合物の成分が分離する（または分離しない）かの原理を効果的に説明、理解、研究しない、中核となる学習カリキュラムに起因すると私は考えています。
クロマトグラフィーには、次の4つの基本的な種類があります。
- 気体-液体クロマトグラフィー（GC）
- 液体-液体クロマトグラフィー（LLC）
- 液体-固体クロマトグラフィー（LSC）
- サイズ排除/ゲル浸透クロマトグラフィー（SEC/GPC）
この記事では、液体-固体クロマトグラフィーについて取り上げます。
液体-固体クロマトグラフィー
これは半揮発性および不揮発性化合物の分離に有用であるため、上記の技術の中で最もよく知られています。 分離カラムから化合物を溶出させるために熱を必要としないため（GCの場合）、液-固クロマトグラフィーでは、試料の化学成分を互いに分離させるために、極性の異なる溶媒または混和溶媒を使用することが必要です。 試料の成分は固定相に結合するが、その程度はさまざまである。 固定相との相互作用の大きさが、分離速度や分離効果を左右する。 つまり、固定相への吸着力が強ければ強いほど、化合物の溶出に要する時間は長くなる。 それらの強く結合した化合物を溶出しやすくするために、溶媒の比率を時間と共に変化させる（強さを増す）必要があるのです。
LSCの領域には、いくつかの異なるクロマトグラフィー技術があります…
- ペーパークロマトグラフィー（PC）
- 薄層クロマトグラフィー（TLC）
- 高精度高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
- フラッシュクロマトグラフィー（FC）
- イオン交換クロマトグラフィー（IX）
- アフィニティクロマトグラフィー（AC）
- キラルクロマトグラフィー（CC）
- 超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）
この記事ではフラッシュクロマトグラフィーについて取り上げます。 の原理はHPLCと同じです。 どちらも固定相を充填したカラムを使用し、そこに試料を注入して溶媒を送液します。 フラッシュクロマトグラフィーは分取クロマトグラフィー技術で、カラムにはHPLCカラムよりも大きな粒子径を持つ固体支持体または媒体が充填されています。 これらの媒体とカラムサイズの違いにより、フラッシュカラムはHPLCよりも媒体1gあたりより多くの化合物を精製できます。
- フラッシュクロマトグラフィーは15 μmから最大60 μmの媒体粒子を使用します
- HPLCは1.7 μmから10 μmの媒体を使用します
What Happens Inside the Column
、ほとんどのフラッシュクロマトグラフィーおよびHPLCでは順相または逆相を使用して実施されています。 これらの方法の違いは、固定相の化学的性質と、混合物の個々の化学成分を分離するために利用される溶媒にあります。逆相はその逆で、極性溶媒と非極性固定相を使用します
これらの方法は互いに「極性」の反対であるため、ほとんどの化合物の溶出順序が逆になります（シャレです）。
順相クロマトグラフィー
順相クロマトグラフィーでは、混合物（例：反応混合物、天然物エキスなど）を構成する化学化合物を適切な溶媒に溶解し、カラムに注入します。 混合物が極性固定相（例えばシリカ）に接触すると、混合物の化合物とその溶解溶媒が移動相とシリカの結合部位を巡って競合する。 極性の高い化合物ほど、シリカに強く引き寄せられる。 この引力は吸着（吸収とは異なる）と呼ばれます。
スポンジやペーパータオルが液体と相互作用するときに起こるのが吸着です。 吸着は、物理的および化学的な相互作用の組み合わせであり、シリカの極性表面が、接触する化学成分を化学的に結合します。これは、主に水素結合とファンデルワールス力として知られる現象によるものです。 この相互作用により熱が発生し、化合物の安定性やクロマトグラフィーの結果に問題が生じる可能性があります。 このため、シリカカラムは通常、サンプル導入前に低極性溶媒で平衡化（プリウエット）されます。 低極性溶媒（ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなど）は弱い溶媒で、シリカなどの極性媒体にはあまり吸着しません。
シリカの表面化学は、水酸基（シラノール）とシリルエーテルの混合である（図1）。 これらの官能基は極性を持ち、負に帯電し、電子不足の化合物を吸着すると考えられている。 芳香族化合物のπクラウドは、吸着時にシリカの水酸基と水素結合することができる1
図1. クロマトグラフィー用シリカの化学組成は、シラノールとシリルエーテル官能基の混合物から構成されています。 これらの部位は、水素結合/吸着によって化学物質と結合します。
試料成分の結合を確実にするために、精製する試料を弱い溶媒に溶かしてカラムに充填するか（液体充填）、より強い（極性）溶媒に溶かして不活性媒体（シリカ、珪藻土など）と混ぜ、乾燥してから精製カラムに並べて別のカラムに充填します（乾燥充填）。 ドライローディングでは、液体試料、特に極性溶媒に溶解した試料を使用する際に生じる多くの問題が解消されます。 しかし、分離を達成するためには、試料成分が異なる速度で固定相から脱離する必要があります。 これは、極性が一定の溶媒（アイソクラティック溶出）でも可能ですが、極性が低い状態からスタートし、時間とともに極性が高くなるような移動相を用いると、より精製度の高い溶出が可能となります。 これはグラジエント溶出と呼ばれています。
グラジエントでは、極性の低い溶媒に溶解度の高い化合物（低極性化合物）が最初に脱離し、カラムを通過していきます。 移動相溶媒の極性が高くなると、吸着した化合物は、極性が高くなる移動相への溶解度により、異なる速度で媒体から脱離する。
図2. 上図-アイソクラティック溶出（移動相の極性が一定）では、グラジエントを使用した場合（下図）よりも化合物の脱離が遅くなる。
順相クロマトグラフィーの興味深い特徴は、極性が高くなる移動相が優先的に吸着するため、一度媒体から脱離した化合物が再び吸着することがないことです。
化合物間の極性（結合力）の違いは、異なる官能基の付加、芳香環上の官能基の位置の違い（Parida, 2006）、またはまったく異なる構造を持つ化合物のように微妙に異なることがあります（図3.9715>
図3． 官能基の種類と分子上の位置から極性の異なる化合物を分離する。 溶出順に、ナフタレン（極性官能基なし）、1-ニトロナフタレン、o-ニトロアニリン、m-ニトロアニリン、p-ニトロアニリン。 ニトロアニリンは、アミンに対するニトロ官能基の位置のみが異なります。
つまり、順相クロマトグラフィーによる分離は、化合物の極性の違い（明白なものと微妙なものの両方）、固定相への吸着、移動相への溶解性に基づいて行われます。 最高の精製結果を得るには、TLCを使用した溶媒スカウトをお勧めします。
フラッシュクロマトグラフィーの詳細については、ホワイトペーパー「Successful Flash Chromatography」をダウンロードしてご覧ください。 https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
