Bacillus megaterium被覆飼料が松風鏡鯉の成長、消化酵素活性および腸内細菌多様性に及ぼす影響

Abstract

本研究は、Bacillus megaterium被覆飼料の成長成績に及ぼす影響を評価するために行われた。 松風鏡鯉（Cyprinus specularis Songpu）の消化酵素および腸内細菌多様性。 魚に2種類の飼料（対照飼料とB. megateriumコーティング飼料）を1日3回、見かけ上飽和するまで56日間、手作業で給与した。 対照群に比べ、B. megaterium コーティング飼料を補充すると、魚の成長が促進され、飼料要求率が有意に低下した ()。 処理群における前腸アミラーゼおよびリパーゼの活性は、対照群に比べ有意に高かった()。 また、前腸、中腸、後腸のプロテアーゼ活性は、いずれも対照群より高かった()。 ハイスループット法による微生物叢の16S rDNA遺伝子の配列解析の結果、腸内細菌叢の多様性と存在量は、松風ミラーの成長に伴い増加することが示された。 B. megateriumでコーティングした餌を与えたソウギョは、腸内のBacillusとLactococcusの割合が属レベルで増加し、いずれも対照群に比べ有意に高かった()。 これらの結果は、B. megateriumの飼料添加が松風鏡鯉の成長と消化酵素活性を改善し、その主要な腸内細菌叢の有益な属組成を豊かにすることを示唆するものである

1. はじめに

魚は、動物性タンパク質の主な食事源の一つとして、人間の食物構造において非常に重要な役割を果たす。 しかし、近年、ホルモン、抗生物質、過剰な微生物などの安全性に対する懸念から、水産物の安全性が水産物の開発を妨げる最大の要因の1つになっている 。 また、高密度集約養殖の急速な発展に伴い、養殖水の環境は日々悪化し、病気の発生や養殖動物の大量死さえも引き起こしています。 養殖動物の健全な成長を確保するために、環境に優しく安全な代替品を見つけることが急務となっています。

抗生物質時代以降の新しい飼料添加物として、プロバイオティクスは飼料用抗生物質の重要な代替品と考えられています。 プロバイオティクスの使用は、水生動物の成長を促進し、その生存率を向上させることができるだけでなく、水生動物の病気の発生率を低減できることが研究によって示されている。 バチルスは、飼育環境でよく見られる腐生菌性のグラム陽性菌です。 水産養殖の分野でのバチルス菌の研究とアプリケーションは、多くの注目を集めている。 水産養殖におけるプロバイオティクスの最初のアプリケーションは、水中の細菌数のバランスをとることによって実施され、それは良い結果を達成しました。 いくつかの研究では、飼料に枯草菌を添加すると、水生動物の成長を促進し、その消化酵素の活性と非特異的な免疫力を向上させるだけでなく、腸内細菌叢の構造を改善することができることを示している. 20世紀半ば、中国の学者はバチルス・メガテリウムの研究を始め、主に株のスクリーニング、特に有機物の分解能力、窒素代謝、養殖排水処理におけるプロバイオティクスとしての応用に焦点を当てた.

コイ（Cyprinus carpio）は中国で最も広範囲に養殖されている淡水魚種で、2018年のコイの生産量は296万2218トンである.コイを養殖する場合、コイを養殖する前に、コイを養殖する必要がある.コイを養殖するためには、コイを養殖する前に、コイを養殖する必要がある. コイの品種である松風鏡鯉（Cyprinus specularis Songpu）は、成長が比較的早く、耐病性に優れ、肉質転換率が高く、体表に鱗がほとんどないことから、生産量に占める割合がますます大きくなっています 。 しかし、高密度養殖の拡大・推進、給餌回数の増加、水質汚染などにより、食の安全や品質の問題はますます深刻になっています。

栄養素は水生動物の抵抗力に影響を与える最も重要かつ調節しやすい要因の一つです。 食品微生物学には、食品の品質や安全性に有益な影響と有害な影響の両方を持ち、そのため公衆衛生に懸念がある微生物が含まれている。 本研究では、松風鏡鯉の成長、消化酵素活性、腸内細菌多様性に及ぼすB. megateriumコーティング飼料の効果を評価し、健康で生態的な養殖を実践するための理論的根拠とすることを目的とした

2. 材料および方法

2.1. 2.1. 餌の調製

B. megateriumは当研究室で調製した。 B. megateriumの含有量は. 市販の飼料は中国浙江AIPHA飼料有限公司から購入した. 飼料製品の成分分析の保証値を表1に示す。 B. megateriumの発酵ブロスを市販原料の表面に100ml／kgの割合で均一に噴霧し、その後、噴霧した飼料を涼しい場所に1時間置いた後、実験群飼料として使用した。 対照群には、無調整の市販の飼料を与えた。

2.2. 飼育実験

中国黒龍江省黒龍江水産研究所虎蘭実験場（北緯45.97°、東経126.63°）より松風鏡鯉（Cyprinus specularis Songpu）（体重 ）を入手した。 この魚は実験に先立ち、14日間実験室の環境に順応させ、実験用対照飼料に順応させた。 その後、健康な松風鏡鯉90匹を選び、無作為に2群（対照群、実験群）に振り分けた。 各処理は3回に分けて行い、各複製は15匹とした。 対照群には、市販の飼料を与えた。 処理群には、B. megateriumでコーティングされた市販の飼料を与えた。 1日の給餌量は、松風鏡鯉の体重の3％で、1日3回、08 : 00、12 : 00、19 : 00に給餌した。 全実験期間は56日間であった。 実験期間中、実験室の水は1週間に1回、水量の1/3を入れ替えた。 水質は実験期間中毎日測定し（YSI professional plus, Ohio State, USA）、水温は18～25℃で、エアコンプレッサーで24時間酸素を供給した。 魚の体重は給餌試験開始時と終了時の両方で測定した。

2.3. サンプル採取

摂餌実験前に、仮設水槽から無作為に10尾を採取し、初期体重を測定した。 その後、腸管を採取し、初期腸内細菌叢を測定した(初期群)。 56日間の給餌実験終了時、最後の給餌から約24時間後に、すべての魚に75mg/lの濃度で水中に希釈したMS-222で麻酔をかけた。 これらの魚は、重量増加率（WGR）、比成長率（SGR）、および飼料転換率（FCR、表2）を決定するために、数え、計量した.

全魚の最終体重を得た後、各水槽から5匹を無作為に選び、氷盤に置いて迅速に解剖した。 前腸、中腸、後腸などの組織サンプルを無菌ハサミで採取し、無菌生理食塩水で洗浄後、重量を測定し、無菌生理食塩水（1：4）でホモジネートに調製した。 すべてのサンプルは、消化酵素測定のため、直ちに-80℃の冷凍庫で保存した。 また、各水槽から無作為に5匹をサンプリングした。 魚の表面は75％アルコールで消毒した後、バイオクリーンルームに搬入した。 さらに消毒後、腹腔を開き、腸の外側を75％アルコールで拭き取り、滅菌水で4回洗浄した後、腸管を採取して最終的な腸内細菌叢を評価した

2.4. 消化酵素の測定

免疫指数を測定する前に、プールした前腸、中腸、後腸を0.86% NaCl (/) を入れたガラスホモジナイザーで手動で均質化し、10%のホモジネートを得た。 4℃で遠心分離（4000rpm、10分）した後、粗酵素液を主成分とする上清を得た。 前腸、中腸、後腸のアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼの活性を診断試薬キット（中国、南京建成生物工学研究所）を用いて分光光度法で分析した

2.5. 16S rRNA Gene Amplification and Illumina Sequencing

E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) を用いて、メーカーのプロトコルに従って腸内試料から微生物DNAを抽出した。 最終的なDNA濃度と精製度はNanoDrop 2000 UV-vis spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA)で測定し、DNA品質は1%アガロースゲル電気泳動で決定した。 細菌16S rRNA遺伝子のV4-V5超可変領域は、サーモサイクラーPCRシステム（GeneAmp 9700, ABI, USA）を用いて、プライマー515F（5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3）および907R（5-CPGTCAATTCMTTTRAGTTT-3）により増幅させた。 PCRは以下のプログラムを用いて行った。 95℃での変性3分、95℃での30秒、55℃でのアニーリング30秒、72℃での伸長45秒を27サイクル行い、最終伸長は72℃で10分行った。 得られたPCR産物を2%アガロースゲルから抽出し、さらにAxyPrep DNAゲル抽出キット (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) を用いて精製し、製造元のプロトコルに従ってQuantiFluor™-ST (Promega, USA) を用いて定量を行った。 精製したアンプリコンを等モル量でプールし、Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd.の標準プロトコルに従ってIllumina MiSeq platform (Illumina, San Diego, USA) でペアエンドシーケンス () を行った。 (上海、中国）.

2.6. 統計解析

キメラフィルタリングとOTUクラスタリングを同時に行う新規の「貪欲」アルゴリズムを持つUPARSE（バージョン7.1、http://drive5.com/uparse/）を用いて、類似度97％のカットオフでOTU（Operational Taxonomic Units）をクラスタリングしました。 各16S rRNA遺伝子配列の分類は、SILVA 16S rRNAデータベースに対してRDP Classifierアルゴリズム（http://rdp.cme.msu.edu/）により、信頼度閾値70%で解析した。 群集の豊かさにはChaoとACE estimator indexを、群集の多様性にはShannonとSimpson indexを選択した。 これらの指標はすべて QIIME (version 1.7.0) で計算し、R ソフトウェア (version 2.15.3) で表示できるように準備した。 統計解析は、統計ソフトパッケージSPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)を用いて実施した。 データは3つの反復のものとして表される。 データは一元配置分散分析にかけられ、差異が見出された場合、ダンカンの多重比較検定を用いて平均値を順位付けした。 差は.

3で有意とした。 結果

3.1. B. megaterium被覆飼料の魚類成長への影響

表2に示すように、処理群の体重増加率および比成長率（71.03%, 0.42% day-1, ）は対照群のそれ（52.75%, 0.33% day-1, ）と比較して著しく増加し、処理群の飼料転換率（1.28）は対照群のそれ（2.23, ）より著しく低いことが確認された。 56日間の給餌試験中、死亡率は認められなかった。

3.2. B.megaterium被覆飼料の消化酵素活性に及ぼす影響

B.megaterium被覆飼料の消化酵素活性に及ぼす影響について表3に示す。 処理群の前腸アミラーゼ活性は対照群に比べ有意に高かった()。 処理群の中腸アミラーゼ活性および後腸アミラーゼ活性は、対照群に比べ有意に高かったが、有意差はなかった()。 投与群の前腸、中腸および後腸のプロテアーゼ活性は対照群より高かったが、有意差はなかった()。 投与群の前腸リパーゼ活性は対照群に比べ有意に高かった()。 中腸および後腸のリパーゼ活性は対照群とほぼ同じであり、有意な差は認められなかった()。

3.3. B. megateriumをコーティングした飼料が腸内細菌の多様性と豊富さに及ぼす影響

松風ミラーの腸内細菌の多様性は、ハイスループットシークエンスによって決定された。 初期群試料から検出されたOTUの平均数は63であった。 56日後、対照群と処理群で検出されたOTUの平均数はそれぞれ114と196であった。 すべてのサンプルのカバレッジインデックスは0.97以上であり、高い検出率が得られていることがわかる。 表4に示すように、松風鏡鯉の腸内細菌叢の豊富さを反映するChao指数およびACE指数は、56日後の処理群で対照群および初期群に比べ有意に高かった()。 腸内群集多様性のShannon指数は、処理群で対照群よりも有意に高かった()。 腸内生物群集の多様性に関するSimpson indexは、処理群では対照群に比べ有意に低かった()。 上記4つの指標について、対照群と初期群との間に有意差はなかった()。

3.4. B. megaterium-コーティング食が松風鏡鯉の腸内主要微生物叢の組成と変化に及ぼす影響

図1に示した統計では、門レベルで1％以上の腸内微生物の豊かさを主要微生物叢として取り上げた。 初期グループの腸内では、実験開始前はフソバクテリア（86.36％）とバクテロイデット（8.60％）が支配的な門であったが、実験開始後はフソバクテリアとバクテロイデット（8.60％）が支配的になった。 56日間の給餌試験後、各グループで主要な腸内細菌叢の数が増加した。 対照群では、Fusobacteria（86.36%）、Bacteroidetes（14.4%）、Firmicutes（2.42%）、Proteobacteria（1.37%）が主な門派であった。 処理群では、Firmicutes（69.15%）、Proteobacteria（23.8%）、Bacteroidetes（4.65%）、Actinobacteria（1.43%）が主な門派であった。 表5に示すように、属レベルで0.5%以上の腸内細菌の豊富さを主要な微生物叢とみなして統計計算を行った。 初期群では主要腸内細菌は5属のみであった。 56日間の給餌試験後、処理群では主要な腸内細菌は11属に増加した。 初期群の松風鏡鯉の腸内に最も多く存在した微生物はCetobacteriumであった。 56日間の飼育試験後も、対照群に最も多く存在する微生物はCetobacteriumであった。 対照群では、Bacillus、Lactococcus、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Psychrobacter、Brocothrix、Myroides、Arthrobacter、Flavobacterium、Comamonadaceae_unclassified、Yersiniaという11属が優勢であった。 B. megateriumでコーティングした餌を与えた松風鏡コイは、腸内のBacillusとLactococcusの割合が属レベルで増加し、いずれも対照群に比べ有意に高かった()。

4. 考察

バチルスなどのプロバイオティクスは、養殖に広く使用されている。 いくつかの研究では、仔魚の飼料にバチルス属の様々な菌株を添加することで良い結果が得られ、魚の仔魚の成長に対して良い促進効果があることが示されている 。 カキCrassostrea gigasの異種仔魚培養に餌料として細菌（CA2株）を添加すると、1年の異なる季節に一貫して仔魚の成長が促進された。 プロバイオティクスを用いた微生物相の操作は、病原性細菌を制御または抑制し、成長性能と消化酵素の活性を改善するために、水産養殖に適した方法であると報告されている。 また，2種類のプロバイオティクス菌株を混合した飼料を与えたエビは，無処理対照群に比べ，最終体重および体重増加率が有意に大きかった． 本研究では、B. megateriumをコーティングした飼料は、体重増加率と比成長率を高め、飼料要求率を低下させることが明らかになり、B. megateriumコーティング飼料が松風鏡鯉の成長を促進することができることが示された。 同様の結果はナマズ Clarias sp.でも認められ、B. megaterium PTB 1.4 を飼料に添加すると、成長率が有意に向上した . 同様の結果はPenaeus monodonでも見られ、Bacillus cereusを添加した後に高いFCRとSGR値が得られた。

プロバイオティクス細菌は消化酵素を生産することができ、魚が飼料栄養を利用し消化するのを助ける。 植物性タンパク質飼料にB.megateriumを添加すると、腸の形態発達を促進し、消化酵素の活性を高めることができる. プロバイオティクスをコイに適用し、成長成績と消化酵素活性を調べたところ、すべてのプロバイオティクス処理群の平均消化酵素活性が対照群と有意に異なることが示された . 本研究では、B. megaterium コーティング飼料は、消化酵素活性、特に前腸、中腸、後腸のアミラーゼとプロテアーゼの活性に正の重要な影響を及ぼした。 同様の結果はティラピアでも見られ、Bacillus NP5を飼料に添加したところ、食物の消化と成長に改善が見られた 。 プロバイオティクスを含む飼料で得られた高いレベルの酵素活性は、タンパク質、デンプン、脂肪、セルロースの消化を改善し、このことは、プロバイオティクスを添加した飼料で観察された優れた成長を説明するかもしれない。 消化酵素は、魚が飼料中の栄養素を分解して消化するのを助け、魚が飼料中の栄養素を吸収しやすくします。

ハイスループット配列決定の進歩により、メタゲノム試料の広範なカタログが実現し、海、土壌、人体などさまざまなソースからの微生物種の多様性に関する洞察が得られました。 これらの研究では、系統関係を決定するための16S rRNA遺伝子配列決定と、詳細な種および遺伝子構成を予測するためのより包括的なショットガンシーケンスの両方を使用しています . 豊かさ指数と多様性指数は、サンプル中の微生物の多様性と複雑さを検出するための重要な指数である . 本研究では、松風鏡鯉の成長に伴い、腸内微生物の多様性と豊かさが増加し、松風鏡鯉の腸内細菌叢の豊かさを反映するChaoおよびACE指数は、処理群では対照群よりも有意に高かった。 また、腸内群集多様性のShannon指数は、処理群が対照群に比べ有意に高かった。 同様に、Bacillus subtilisを添加した飼料をブラントスノウトブレイクの稚魚に与えた場合にも、腸内細菌叢の構造が変化することが示された . 飼料へのプロバイオティクスの添加は、Litopenaeus vannameiの腸管内の元の微生物叢の数と構造を変更し、Litopenaeus vannameiの腸管内の微生物群集の間の複雑な相互作用を促進することもできる。

この研究では、B. megateriumでコーティングした飼料を与えた松風鏡コイは腸内のバチルスおよびラクトコックスの属レベルで割合が増え、いずれもコントロールグループより著しく高いことを示した。 この結果は、松風鏡コイの腸内の主要な微生物相の構成と割合をB. megateriumコーティング飼料で変化させることができることも示している。 結論として、B. megateriumコーティング飼料の使用は、魚の成長を著しく高め、飼料転換率を低下させ、消化酵素の活性を改善し、主要腸内細菌叢の有益な属組成を豊かにできる。

データの有無

すべてのデータは記事で提供されており、これ以上アップロードするデータはない。

Conflicts of Interest

著者は開示すべき利益相反がないことを宣言する。

Acknowledgements

この研究は中央レベル非営利科学研究機関特別資金（No. HSY202005M）、黒龍江省自然科学基金（No.QC2018038）、中国漁業科学院中央公益科学機関基礎研究基金（No.2017HY-ZD0507、2019XT0502、2020TD56）、中国国家重点R&D計画（No.4302>D Program of China） による。 2019YFD0900302）、農業農村部淡水水産生物技術・育種重点実験室、中国漁業科学院黒龍江水産研究所（No.FBB2017-04）

である。