Delta-Delta Ct method or Livak method is most preferred method for qPCR data analysis.The Delta-Delta Ct method or Livak method is the most preferred method for qPCR data analysis. しかし、この方法は、ある条件を満たした場合にのみ使用することができますので、講義ノートを参照して、これらの条件が満たされていることを確認してください。 そうでない場合は、Pfaffl 法と呼ばれるより一般的な方法がある。 Livak法の手順は以下の通りです。
すべての計算を含むExcelファイルは、BlackboardのqPCR analysisフォルダにあります。
正常細胞と腫瘍細胞の生のCt（閾値に達するまでのサイクル数）（それぞれ3複製）があります。
正規化¶
最初に、目的の遺伝子（p53）とハウスキーピング遺伝子（GAPDH）の相対差について計算する必要があります。
∆Ct = Ct (gene of interest) – Ct (housekeeping gene)
コントロールサンプル（正常細胞）の平均¶
腫瘍（処置）とコントロール（正常細胞）を比較します。 まず、3つのコントロール（正常）サンプルの∆Ctを平均化する必要があります。
正常の△Ctの平均値に対する△Ctを計算する。 cells¶
∆Ct = ∆Ct (Tumor sample) – ∆Ct (normal average)
この正常サンプルも同様に行うことができます。 列番号の前に$記号、生文字（矢印）でセルを固定する。
Fold gene expression for each sample¶
必ず負の∆Ctを2のべき乗まで上げてください。
Fold gene expression = 2^-(∆∆Ct)
Overall fold change¶
腫瘍サンプルと正常サンプルで平均fold changeが算出できる。
Log変換
T検定などのパラメトリック統計検定には最終遺伝子発現を対数（任意の基数）変換することを推奨しています。
ここでは2^-(⊿⊿Ct)をlog 10に変換しています。
T-test¶
データが正規分布しない場合パラメトリック検定を使用すると間違った結論に至るので注意しなければならない。
Normal と tumor のサンプルについて、2^-(△△Ct) 値の log 10 を指定する。 2尾検定（2番）と不等分散（3番）を用いる。
結果のP値は0.05より小さいので、帰無仮説を棄却し、2標本の平均は0.05水準で有意に異なる。
