ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）-良識ある検査室でのアプローチ（希望）

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

投稿しました。 2020年1月28日

Heparin-Induced Thrombocytopenia (HIT) – A sensible laboratory approach (hopefully)

1980年に、私は経験したことのない疾患についてのワークアップの依頼に初めて接しました。 私たちの施設の血液内科医が、私たちの施設の患者がヘパリン起因性血小板減少症（HIT）の症例であるかもしれないという依頼を受けに来たのです。 当時、私はこの疾患について聞いたことがなかったので、参考文献としてIndex Medicus（実際の書籍）で調べるという昔ながらの方法をとりました。 当時、私たちの地域では検査方法を見つけることができなかったので、この対象者を治療するためにこの医師の手助けができるよう、検証された方法を手に入れるというミッションに乗り出しました。 その後、光透過式凝集測定法（LTA）を用いた方法を発見しました。 この方法では、正常なドナーの血小板が豊富な血漿（PRP）と患者ドナーの血清に、複数の濃度のUFHを加え、凝集反応を調べました。 これはデュアルチャンネルLTA Chronolog凝集計で行われました。 Pubmedではこの件に関して1983年までしか遡れないので、参考文献をあげることはできません。

それから、HITがどういうものかを学ぶ必要がありました。 HITとは、矛盾するような免疫反応の後遺症、あるいは「パラドックス」と呼ばれる反応のことです。 薬剤性免疫血小板減少症は、キニーネやバンコマイシンなどの薬剤により、直ちに急激な血小板減少（<20×109/L）を起こし、大出血を起こすことがあります。 真のHIT反応を示す人は、ヘパリン投与開始後5日以上経過してから血小板の50%を失うことがありますが、出血性の問題ではなく、血栓性の問題を発症します。

HIT はIgG抗体による免疫反応問題です。 この抗体は、未分画ヘパリン（UFH）や低分子ヘパリン（LMWH）に反応して進化します。 UFH療法に対する発現率は0.5-5%である。 LMWH療法では、HITの発生率はUFH療法の10分の1である。

HITは、患者への破滅的な結果を防ぐために、医師が迅速な判断を下す必要がある疾患である。 医師は血小板数とともに4Tsスコアを用いて、臨床検査プロトコルを指示するかどうかの指針にすることができる。 4TsはHITの検査前スコアリング・システムであり、臨床の場で広く用いられている。 下表をご覧ください。 タイトルはHITの4つの特徴を指している：

• 血小板減少症
• ヘパリン曝露に対する血小板減少のタイミング
• HITの血栓症や他の後遺症
• 血小板減少の他の原因

テーブルを参照。 4Tsスコア

特徴	スコア
	2 点	1 点 0点
血小板減少症	>50％低下 そして 血小板ナディア20-… 続きを読む100 × 109/L	30%-50%低下 または血小板直下10-。19× 109/L	< 30% fall or platelet nadir < 10×109/L
platelet count fall	clear on day 5-10に発症する。 または、過去30日以内にヘパリンに曝露された場合は1日以内	5-10日目の下降と一致するが、明確ではない（例：血小板数の欠測）。 10日目以降の発症、または30-100日前のヘパリン曝露であれば≦1日の低下	最近のヘパリン曝露でなければ血小板数低下≦4日
血栓症または他の後遺症	新しい血栓（確認）、ヘパリン注射部位の皮膚壊死、ヘパリンボーラス静脈注射後のアナフィラクトイド反応。 副腎出血	進行性又は再発性の血栓症；紅斑性皮膚病変。 血栓症が疑われるが証明されていない
血小板減少症の他の原因	明らかでない	可能性	不明

最高得点は8点です。 スコア6-8はHITの可能性が高いことを示しています。 4-5点はHITの中程度の存在を示し、0-3点はHITの存在の可能性が低い。3,4

4Tsスコアの上昇によりHITが疑われる場合、検査室は医師が正確に診断できるよう支援する。 これは多くの検査法によって達成することができる。 これらは通常、免疫学的および機能的な2つのクラスに分類される。 以下の情報は、本疾患の検査室検査で最も一般的に使用される検査について説明する。

HITの検査室診断検査

HITイムノアッセイ。 抗PF4/ヘパリン抗体を検出する検査

酵素免疫測定法（EIA）（IgGを検出）

EIA（多特異抗体を検出）

これらの方法は通常PF4依存で高感度である。 HITの場合、固相キットを用いると97％陽性となる。 これらは広く市販されている。 この方法は時間がかかるため、通常バッチテストが行われる。 しかし、弱陽性では特異度が低い場合がある。 陽性の目安は各検査施設で設定する必要がある。

– IgG特異的化学発光免疫測定法（CLIA）

-PF4/polyvinyl sulfonate (PVS) でコートした磁性粒子を用いて抗PF4/ヘパリン抗体を検出する迅速自動法である。 インキュベーション、磁気分離、洗浄工程の後、イソラミノール標識抗ヒトIgG抗体からなるトレーサーを添加し、粒子上の抗PF4/ヘパリン抗体に結合させる。 2回目のインキュベーション、磁気分離、洗浄で反応は完了する。 測定された抗PF4/ヘパリン抗体の濃度に比例したOD値が得られます。 検査は通常オンデマンドで行われ、所要時間は約30分です。 この方法をゴールドスタンダードのセロトニン放出測定法（SRA）と比較した研究では、特異度と感度で優れた相関がありました（それぞれ98.8/97.0%）6

– LIA（Latex immunoturbidometric assay） for (HIT).

LIA は免疫測定法に分類され、抗HIT抗体を測定する方法です。 EIAなどの他の多くのイムノアッセイとは異なり、患者の血漿中にPF4/ヘパリン反応性抗体が存在すると、HITを模倣したモノクローナル抗体との競合により粒子凝集が阻害される。 したがって、LIAは “functionalized immunoassay “と呼ばれ、理論的には特異性の高いfunctional assayであるSRAと特異性の低いPF4依存性のEIA法の中間の診断特異性を提供する可能性が示唆されています。 この方法は簡単に自動化でき、所要時間は約20分です。 7

Lateral flow Assay (STiC):

Lateral flow immunoassayは、結果を視覚的に読み取る評価カードに含まれるPF4/ポリアニオン複合体に対してIgG抗体を検出します。 インキュベーション時間は10分程度で、HITの有無を迅速に判定することができます。

Functional HIT Assays: 血小板と結合し活性化する能力を持つ抗体を検出するアッセイ

Serotonin release assay (SRA) – Heparin-induced platelet activation test (HIPA) – Platelet aggregation test (PAT) – Flow cytometry-based assays.

SERotonin release assay (SRA) ：HIT 確認試験

本法は血小板活性化抗体を検出するものであり、その検出は、HIT確認試験として行われる。 SRAは血小板から放出される放射性標識セロトニンを測定します。9,10 陽性には、低用量のUFHで> 20%、高濃度のUFHで< 20%のセロトニンが放出されることが必要とされます。 これまでこの方法は、一般に確認検査のゴールドスタンダードと認識されてきた。 感度、特異度とも95％である。 SRAは血小板活性化抗体の検出を拾い上げる。 臨床的なHITに対して最も高い感度・特異性を有する。 また、SRAはEIAよりもはるかに高い診断特異性を有しています。 SRAはスクリーニング検査として、EIAが陽性でない限り実施されるべきではありません。 これはSRAの偽陽性という問題を排除するのに役立つ。 SRAが陽性の検体でEIAが陰性であれば、SRA法を評価する必要があるという「赤旗の警告」となるはずである。 ヘパリン非依存性の血小板活性化は、HITの極めて深刻な存在を警告するものである。 この所見は遅発性HITや、微小血管血栓症のリスクを伴う消費性凝固障害の存在する強陽性HITを示唆する可能性がある。 正常ドナーの血小板が必要である（正常ドナーの反応には個人差があるため、標準化が難しい）。 したがって、比較的標準化されていない検査であり、広く使用されていません9,10

ヘパリン誘発血小板活性化アッセイ（HIPA）：

この方法は、通常ヨーロッパでのみ行われている洗浄血小板活性化アッセイであり、この方法では、血小板活性化アッセイが行われません。 このアッセイは、血小板凝集によって行われ、血小板活性化エンドポイントによって視覚的に判断されます10。これに対し、SRAは、シェーカーで血小板をテストし、60分間反応させることによって行われます。 HIPA法は攪拌した血小板を用い、5分間隔で45分間目視で読み取る点が異なります。

一部の研究者は、HIPA法がSRA法よりも血小板活性化抗体の検出感度が高いことを観察しています。 7958>

血小板凝集測定法（LTA：light transmittance aggregometry / WB： whole blood aggregometry）：

光透過式凝集測定法（LTA）は、HIT抗体に対する血小板反応を定性的に測定した最初の測定法である。 正常なドナーPRPと患者PRPをキュベットに入れ、攪拌することにより行われます。 ヘパリンを異なる濃度で添加し、15分間凝集をモニターする。 試料が凝集を示した場合、より高濃度のヘパリンを加え、凝集が阻害される時点を決定する。 この時、定性的に陰性、弱陽性、強陽性（0、2、3）の判定がなされます。 11

– 全血（WB）血小板凝集測定法では、使用する凝集計によって、正常なドナーの血小板と患者の全血または血清の混合物を使用します。 全血ドナーは、抗体が反応することを確実にするために、（HIT陽性サンプルを使用して）事前に適格性を確認する必要があります。 WB法によっては、検体は通常の3.2%クエン酸ナトリウムチューブか、特別なヒルジン採血管で採取されます。 どちらの方法もインピーダンス凝集計の一種を使用します。 いずれの方法も、ヘパリンと血液検体をインキュベートし、インピーダンス凝集計で凝集を観察します。 凝集反応を示した検体は、凝集が見られなくなるまで高濃度のヘパリンで反応させます。 11

フローサイトメトリーによるHITの有無

Platelet P-Selectin Expression Assay (PEA) は、フローサイトメトリーによるHITの評価に使用されています。 先に述べたように、SRA法はヘパリンの存在するコンペックスでPF4を認識できる抗体を認識するための確認検査の「ゴールドスタンダード」である。 HITが存在しないのにヘパリンを投与された患者の中には、この抗体が陽性となる場合があります。 SRAは通常、特別な基準研究所でのみ利用可能である。 この方法は、時間がかかり、技術的に困難であり、拡張性がある。 また、この方法は時間がかかり、技術的にも困難であり、迅速な対応ができないため、生命を脅かす可能性のある問題を防ぐために即時の治療を必要とするHITの存在に対する診断がさらに遅れることになる。 最近の研究では、フローサイトメトリーシステムを用いたPEA法に対するSRA法の評価が行われました。 このアッセイはPF4依存性のP-セレクチン発現アッセイであり、PEAと同じものである。 91名の被験者の保存血清検体を用いてレトロスペクティブな研究が行われた。 血小板減少症、血小板減少時期、血栓症の診断、血小板減少の他の症例など、HITの4Tsの既往がある患者を対象とした。 4Tsが中程度でPF4 EIAが高値（OD≧2.0），または4Tsが高値でPF4 EIAが低値（OK≧1.0）であればすべてHIT陽性，その他の検体はHIT陰性と分類された． PEA陽性でSRA陰性の血清16検体中11検体がHIT陽性であった。 著者らは、HITと確定診断された被験者から同様の血小板マーカーを持つ検体や連続希釈した検体を用いた他の研究により、PEAは血小板活性化抗体に対してthSRAよりも感度が高いことが示されたと述べた。13

したがって、彼らはPEAがより簡単に実施でき、HIT存在の有無を診断する際により正確な結果を示すと結論付けた。 2013年の研究では、HITAlertフローサイトメトリー法を用いて、三次医療病院の検査室環境でHITを検出するプロトコルが開発された。 彼らは、37人の被験者のHITの存在の可能性をスクリーニングするために、4Tsスコアを比較しました。 血清はHITAlertフローサイトメトリー法でHIT抗体の存在を分析し、抗原性アッセイと比較された。 比較した方法は、particle gel immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assayと2つの機能検査法である。 彼らはMultiplate WBA（米国とカナダでは販売されていない）とSRA法を使用した。 その結果は次の通りであった。 フローサイトメトリーでは37名中14名にHITが陽性であった。 4Tsではlow（8例中0例）、intermediate（19例中5例）、high（10例中9例）であった。 SRAと比較した場合、Flow法はHITの有無に対して特異度100%、感度81%であった。 WBIA機能検査もフロー法と比較して、感度81％、特異度90％であった。 しかし、PaGIA法では特異度20％、感度20％にとどまった。 フローサイトメトリーでは、抗原手順に対する特異性が向上していた。 これは、4Tの中リスク群で最も顕著であった。 これは、プロトコルで使用された3つの機能的手法すべてにおいて明らかであった。 研究者らは、HITAlertフローサイトメトリー法は感度を失うことなくHITを特定する特異性を向上させることができると結論づけた12。このアッセイは米国とカナダでは研究用のみで、診断用には使用できない。

HIT検出のためのまとめ

最後にCukerらの文献#14にあるHITの診断に推奨するアルゴリズムで締めくくりたいと思う。 4Tsスコアが中・高で、次に免疫学的検査、そして機能検査という診断アルゴリズムで、その結果は – 注：高確率群の患者では、4Tsスコアと免疫測定が非常に強い陽性（ELISA値が> 2.0）であることから、機能的検査は必要ない可能性がある。0 OD単位）。

HITの存在の発生は、PF4/ヘパリンの複合体を標的とする血小板活性化抗体によって緩和される薬物有害相互作用である。 血小板を活性化するtheeヘパリン誘導抗体の存在または、機能的な能力を識別するために適切な実験室アッセイを決定することは、検査室の責任である。 これらのアッセイは、破滅的な血栓状況を防ぐために医師を支援するために適時に実行する必要があります7958>

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