De rol van Ki-67 bij borstkanker

REVIEW ARTICLE

De rol van Ki-67 bij borstkanker

A Mannell

Department of Surgery, University of the Witwatersrand, Johannesburg, South Africa

Correspondentie

ABSTRACT

De proliferatieve marker, Ki-67, is een humaan nucleair antigeen, en vormt een integraal onderdeel van celdeling in zowel normaal als maligne weefsel. Aangezien het kenmerk van kanker ongecontroleerde en onophoudelijke celproliferatie is, wordt de Ki-67 proliferatieve index steeds meer gebruikt om borstkanker te beoordelen en te beheren. De waarde van Ki-67 als een prognostische indicator, een leidraad voor de keuze van therapie, en een methode om de respons op een lopende behandeling te meten, wordt in dit overzicht onderzocht.

Het Ki-67 antigeen, een niet-histon-eiwit, werd voor het eerst beschreven door Gerdes et al.1 toen zij monoklonale antilichamen in muizen aankweekten tegen de kernen van een cellijn voor de ziekte van Hodgkin. Dit werk werd verricht aan de universiteit van Kiel in Duitsland, vandaar de “Ki”. De “67” verwijst naar het kloongetal in een 96 wells plaat.

Het Ki-67 antigeen kan worden geïdentificeerd door immunokleuring met een monoklonaal antilichaam in alle fasen van de celproliferatie. Het komt niet voor in de rustfase (GO), maar wel in de kern in de S-, G1- en G2-fase. Het niveau neemt toe aan de oppervlakte van de chromosomen en bereikt een piek in de mitose in zowel normaal als kwaadaardig weefsel.2

De Ki-67 score of index is het percentage positief gekleurde cellen onder het totale aantal gescoorde kwaadaardige cellen. Het gebruik van het oorspronkelijke anti-Ki-67 monoklonale antilichaam was beperkt tot vers ingevroren weefsel, maar door gebruik te maken van een ander anti-humaan monoklonaal antilichaam, N1B-1 (kloon 42), kan de Ki-67 worden gemeten in formaline-vaste, paraffine-ingebedde secties, die gedurende tientallen jaren zijn gearchiveerd.3

Ki-67 en prognose van borstkanker

De waarde van Ki-67 als prognostische index werd onderzocht in een retrospectieve studie van 3 658 gevallen van invasieve borstkanker die van 2005-2011 waren ingevoerd in het klinische kankerregister van Regenburg, Beieren, Duitsland.3 Naast de receptorstatus en algemeen geregistreerde histopathologische kenmerken, maakte het Ki-67-percentage deel uit van de routine-workup voor deze patiënten. In een univariate analyse gaf een Ki-67 >25%, samen met ongunstige klinische en histopathologische parameters, een slechtere prognose aan de bestudeerde populatie. Een lage Ki-67 (<15%) werd geassocieerd met een ziektevrije overleving na vijf jaar en een totale overleving van respectievelijk 87% en 89%, terwijl patiënten met een hoge Ki-67 (>45%) een ziektevrije overleving en een totale overleving hadden van 76% en 83%. Deze bevindingen bevestigen die van een eerdere meta-analyse door De Azambuja,4 waarin in een univariaat model werd aangetoond dat een hoog Ki-67 percentage correleerde met een verminderde overleving bij zowel node-negatieve, node-positieve als onbehandelde borstkankerpatiënten.

Weliswaar zijn agressieve klinische en histopathologische kenmerken (receptornegativiteit, hooggradige kanker, een positieve nodale status, een jonge leeftijd en lymfovasculaire invasie) significant geassocieerd met slechtere uitkomsten, maar een multivariate analyse van de Regenburg-gegevens toonde aan dat een hoog Ki-67-percentage (> 25%) een onafhankelijke prognostische parameter bleef voor ziektevrije en algehele overleving, ongeacht de klinische en histopathologische kenmerken van de kanker.3

Ki-67 en raciale verschillen in borstkanker

In de VS hebben zwarte vrouwen 40% meer kans om te sterven dan blanke vrouwen met borstkanker, en in Afrika hebben Nigeriaanse vrouwen met borstkanker een hogere mortaliteit dan Britse vrouwen.5 Veel lokale factoren kunnen bijdragen aan dit verschil, bijvoorbeeld patiënten die zich in een gevorderd stadium presenteren vanwege de onbetaalbaarheid van beschikbaar vervoer, de afstand tot de zorginstelling, vertragingen bij patiënten vanwege een laag niveau van gezondheidsvoorlichting en een aanvankelijke afhankelijkheid van traditionele therapieën. Deze factoren leiden tot vertragingen bij de diagnose en behandeling van borstkanker,6 hetgeen op zijn beurt een negatieve invloed heeft op de overleving. Terwijl sociaal-economische ongelijkheden in de verstrekking van gezondheidszorg goed worden erkend, is er een toenemend bewustzijn van verschillen in tumorbiologie die tussen etnische nationaliteiten bestaan.

Er werd een studie gemaakt van jonge Afro-Amerikaanse en blanke vrouwen in Atlanta, VS, met nieuw gediagnosticeerde unilaterale invasieve borstkanker gezien tussen 1996-2000.7 Naast het documenteren van de graad en het stadium van de kanker van het USA National Cancer Institute (NCI) Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) Program, werd archief tumorweefsel opnieuw onderzocht op de graad van tumornecrose, de mitotatiesnelheid, de receptorstatus, proliferatieve markers en celcyclusregulerende eiwitten. Raciale verschillen in tumorkenmerken werden geïdentificeerd en gecorreleerd met uitkomstgegevens van het Georgia Center for Cancer Statistics (onderdeel van het door het NCI gefinancierde SEER-programma).

Na correctie voor leeftijd, graad en stadium had borstkanker bij Afro-Amerikaanse vrouwen meer kans op een hogere proliferatieve snelheid en abnormale expressie van celcyclusregulerende proteïnen, cycline E en D, dan borstkanker bij blanke vrouwen. Een agressiever borstkankerfenotype bij Afro-Amerikaanse vrouwen ligt ten grondslag aan de slechte overleving in deze bevolkingsgroep.

Deze bevindingen die raciale verschillen in tumorbiologie identificeren, worden ondersteund door een latere studie uit Nigeria en Nottingham, VK.5 De klinische pathologische kenmerken en biomarkers, waaronder Ki-67, werden onderzocht in de borstkanker van 302 Nigeriaanse vrouwen. Deze serie werd vervolgens gematcht met een cohort Britse vrouwen van Kaukasische afkomst wat betreft stadium en graad. Alle patiënten werden beoordeeld en behandeld op een standaardmanier door primaire chirurgie, gevolgd door adjuvante therapie bepaald door de receptorstatus. Overlevingsgegevens werden prospectief bijgehouden en het resultaat voor elk geval werd genoteerd.

De niveaus van Ki-67 waren significant hoger in de borstkanker van Nigeriaanse vrouwen dan die van Britse vrouwen, onafhankelijk van stadium, graad en receptorstatus. De mortaliteit was groter bij de Nigeriaanse patiënten. Het is waarschijnlijk dat de grotere proliferatieve fractie, geïdentificeerd door hoge niveaus van Ki-67, bijdroeg tot de raciale verschillen in overleving.

Ki-67 en de moleculaire subtypering van borstkanker

Ki-67 is gebruikt als een marker om de moleculaire subtypes van borstkanker te definiëren. Cheang et al.8 combineerden Ki-67 met een panel van receptoren en stelden vast dat een Ki-67 niveau van 13% luminal A kanker met een goede prognose kon onderscheiden van luminal B kanker met een slechtere prognose. Negenhonderd drieënveertig patiënten met node-negatieve borstkanker, die geen systemische therapie kregen, werden met behulp van deze vier immunohistochemische markers (IHC4), d.w.z. ER, PR, HER2 en Ki-67, gesubtypeerd en gevolgd om recidief en 10-jaars kankerspecifieke overleving te documenteren. Degenen met luminal B kanker met een Ki-67 van >14% hadden een significant slechtere prognose voor recidief en overlijden dan degenen met luminal A tumoren, waar de Ki-67 <14% was.

De cut-point in de vorige studie, die hoog risico scheidde van laag risico was een Ki-67 van 14%. In de literatuur worden echter grenswaarden gebruikt om dit onderscheid te maken, variërend van een Ki-67 van 5-30%.4 Deze grote variatie van grenswaarden in de Ki-67-tests heeft een vergelijking van de metingen van de proliferatieve activiteit van verschillende borstkankercentra zeer moeilijk gemaakt. Dit probleem wordt nog verergerd door de voortdurende discussie over de methoden voor het kleuren en tellen van neoplastische cellen in paraffineparafines. Sommige pathologen hebben ervoor gekozen de gekleurde kernen te tellen in “hot spots” en aan de invasieve rand van de maligniteit, terwijl anderen de celaantallen tellen in een veld dat representatief wordt geacht voor de volledige coupes.9 De controverse was zo groot dat de Ki-67-test werd weggelaten uit de lijst van aanbevolen biomarkers voor de klinische praktijk in de richtlijnen van 2007 van de American Society of Clinical Oncology.10

In 2010 werd vervolgens een internationale werkgroep Ki-67 in borstkanker opgericht om de waarde van Ki-67 als reproduceerbare prognostische marker te onderzoeken en de methodologische problemen aan te pakken.9 De groep publiceerde richtlijnen voor de meting van Ki-67, waarin het type biopsie, het te gebruiken fixeermiddel, de tijdstippen van opslag, alsook de geadviseerde methoden voor antigeen retrieval werden gespecificeerd. Er werd uiteengezet welk monoklonaal antilichaam het best kon worden gebruikt als reagens voor immunohistochemische en kleuringstechnieken. De werkgroep heeft ook richtsnoeren gepubliceerd voor de standaardisering van de puntentelling, de analyse van de gegevens en de interpretatie van de resultaten.

Tot dusver is er echter nog geen consensus bereikt over één enkele cut-point of een reeks cut-point-waarden. Dit is gedeeltelijk te wijten aan het feit dat de Ki-67 een continue verdeling vertoont, en aan de aanhoudende variaties in de pre-analytische en analytische methodologie.11 Deze moeilijkheden liggen ten grondslag aan de aanhoudende discussie over de waarde en de reproduceerbaarheid van de Ki-67 assay.

Het merendeel van de deskundigen die zich hebben uitgesproken over de behandelingsgeoriënteerde indeling van subgroepen van borstkanker, heeft echter verklaard dat de Ki-67-scores moeten worden geïnterpreteerd in het licht van de lokale laboratoriumwaarden.12 Het panel gaf het voorbeeld van een laboratorium met een mediane Ki-67 voor receptor-positieve kanker van 20%, zodat kankers met een Ki-67 (gemeten door dat laboratorium) van <10% duidelijk een lage proliferatieve index hebben, en die met een Ki-67 van >30%, een hoge proliferatieve.

Niettemin werd in de 2015 St Gallen International Breast Cancer Conference consensusverklaring12 erkend dat het belangrijk is om hormoonreceptorniveaus en proliferatieve activiteit te meten en te vergelijken om de prognose te bepalen, en als een gids voor adjuvante chemotherapie.

In de consensusverklaring was men het er ook over eens dat “internationale samenwerking heeft geleid tot verbeteringen in de concordantie van de Ki-67-scores”, waardoor het verdere gebruik en de standaardisatie van deze marker worden aangemoedigd.

Ki-67 en het verre recidief van borstkanker

Verbetering van de operatietechnieken en uitbreiding van het bestralingsveld, samen met vooruitgang op het gebied van cytotoxische geneesmiddelen en gerichte therapie, hebben de ziektevrije overleving doen toenemen en de totale mortaliteit als gevolg van borstkanker doen afnemen. Maar het is nog steeds niet mogelijk om een subgroep van patiënten als “genezen” van kanker te karakteriseren. Node-negatieve ER-positieve kankers hervallen met een percentage van 2% per jaar gedurende ten minste 15 jaar na langdurige anti-oestrogeentherapie.13 Dit heeft geleid tot het zoeken naar een scoresysteem om patiënten met een zeer laag risico op herval, die geen baat zouden hebben bij adjuvante chemotherapie, te scheiden van patiënten met een voldoende hoog risico op herval om cytotoxische therapieën te rechtvaardigen. De Genomic Health 21-gen recidiefscore (RS) (6H1-RS), in de handel verkrijgbaar als Oncotype DX®, is zo’n scoresysteem, ontwikkeld op basis van een assay van tumorgerelateerde genen.14 De 6H1-RS score werd berekend voor node-negatieve, ER-positieve en HER2-negatieve patiënten in de ATAC-studie (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) die geen adjuvante chemotherapie kregen.15 Deze onderzoekers vonden dat de Oncotype DX® een nauwkeurigere voorspeller was van distant recurrence dan leeftijd, stadium, graad en ER-expressie. Zes van de kankergerelateerde genen in de Oncotype DX® zijn echter geassocieerd met proliferatie, en de IHC4 score bleek even goed te zijn als deze 21-gen score in het voorspellen van ziekte in de verte in de vijf jaar na voltooiing van de behandeling.16

Het meest voor de hand liggende voordeel van de IHC4-score is dat deze parameters routinematig worden gemeten in de tertiaire verwijsziekenhuizen in Zuid-Afrika, waar de kosten van een immuunkleuring, inclusief Ki-67, R350 bedragen in de openbare gezondheidszorg (volgens informatie verstrekt door de afdeling Histopathologie, Charlotte Maxeke Johannesburg Academisch Ziekenhuis, Johannesburg, Zuid-Afrika). De 21-genen Oncotype DX® score kost 28.780,00 R (volgens informatie van Drs Gritzman and Thatcher Inc Laboratory, Johannesburg, Zuid-Afrika) en is onbetaalbaar voor het arme Afrikaanse milieu, en is alleen verkrijgbaar in particuliere gezondheidslaboratoria.

Multicentrische trials van verlengde hormonale therapie voor ER-positieve borstkankers hebben gelijktijdig plaatsgevonden met deze analyses van voorspellende factoren.18 Deze klinische trials hebben bevestigd dat het gedurende 10 jaar voortzetten van anti-oestrogeen de mortaliteit van borstkanker in het tweede decennium na de diagnose significant vermindert.

Selectie van therapie

Naast de bijdrage van Ki-67 aan de prognose, wordt de Ki-67 index dagelijks gebruikt bij de selectie van therapie. Delende cellen hebben een verhoogde gevoeligheid voor cytotoxische geneesmiddelen, en een hoge Ki-67 is geassocieerd met een goede respons op neoadjuvante chemotherapie (NAC).11,19 Omgekeerd zijn sterk ER-positieve kankers met een lage Ki-67 beter te behandelen met 4-8 maanden neoadjuvante hormonale therapie.12 Het vermogen van baseline Ki-67 waarden om respons op een specifiek adjuvante chemotherapieregime te voorspellen is echter niet vastgesteld.11,20

Hoewel baseline Ki-67 kleuring de initiële therapiekeuze kan sturen, is de beoordeling van respons op voortgaande behandeling een belangrijk punt geworden in het patiëntenmanagement. De Ki-67 in een kernbiopsie werd twee en 12 weken na het begin van de behandeling gemeten in de Immediate Preoperative Anastrozole, Tamoxifen, or Combined with Tamoxifen (IMPACT) trial.21 De onderdrukking van Ki-67 door anastrozol op beide tijdstippen was groter dan die geregistreerd voor tamoxifen of de combinatie. De grotere onderdrukking van Ki-67 door anastrozol correleerde met de significant verbeterde recidiefvrije overleving van patiënten met anastrozol bij de 31-maanden evaluatie van de ATAC trial.22

Het doel van de Perioperative Endocrine Therapy for Individualizing Care (POETIC) trial is het testen van de hypothese dat een verandering in Ki-67 na twee weken anti-oestrogeen behandeling de uiteindelijke uitkomst van endocriene therapie kan voorspellen.23 Deze studie loopt nog en de rekrutering van 4.000 patiënten met niet-metastatische ER-positieve borstkanker is gepland.

Er is behoefte aan een betrouwbare marker om de respons op lopende chemotherapie te beoordelen. Een daling van 20-25% van Ki-67 op de basislijn na één cyclus cyclofosfamide, epirubicine en 5-fluorouracil correleerde significant met een daling van het risico van recidief in een kleine studie van het Karolinska University Hospital, Stockholm, Zweden.24 Wanneer een chemotherapieregime er niet in slaagt de proliferatieve fractie van een kanker te verminderen, wijst dit op de noodzaak om de therapie te wijzigen.

Bepaling van het residuele risico

Chemotherapie bereikt een klinische respons bij de meerderheid van de patiënten met invasieve borstkanker, maar een volledige pathologische respons komt slechts bij een minderheid voor. Het is belangrijk om de residuele kanker in de chirurgische excisiemonsters te profileren als een leidraad voor adjuvante therapie. Een studie van Ki-67 voor en na NAC werd uitgevoerd bij 283 patiënten met ER-negatieve, invasieve niet-metastatische borstkanker die geen pathologische respons vertoonden. Patiënten met een hoge baseline Ki-67 hadden een betere respons op NAC, maar degenen met een hoge Ki-67 in het chirurgische excisiespecimen hadden een significant slechtere recidiefvrije overleving.25 Een hoge Ki-67 in residuele kanker is een indicatie voor verdere, niet kruisresistente behandeling.

Conclusie

De Ki-67 is een humaan nucleair antigeen dat nauw geassocieerd is met de celcyclus en mitose, zodat het Ki-67-percentage de proliferatieve fractie van een kanker weergeeft. Ki-67 is een duurzaam antigeen dat gemakkelijk en op economische wijze kan worden verkregen uit in paraffine ingebedde secties van tumorweefsel. Talrijke studies hebben de waarde ervan als prognostische merker van borstkanker bevestigd.

De Ki-67 wordt in de dagelijkse praktijk gebruikt om therapie te selecteren, en biedt de mogelijkheid om de respons op lopende behandeling te meten. De meeste patiënten met borstkanker hebben geen volledige pathologische respons na NAC, zodat herbeoordeling van de receptoren en Ki-67 in het chirurgische excisiespecimen helpt bij de keuze van een tweedelijns, niet-kruisresistent regimen. Even belangrijk is de meting van Ki-67 en receptorexpressie in locoregionale en verre recidieven van borstkanker om de selectie van geschikte systemische therapie te vergemakkelijken.

Met een grote variatie in methodologie, scoring en afkappunten is standaardisatie en laboratoriumaccreditatie essentieel voor het bereiken van het volledige klinische potentieel van Ki-67, zoals is bereikt met hormonale en HER2-receptoren.26

Verklaring

Een deel van deze review is gepresenteerd op het Durban breast cancer forum op 18 augustus 2015.

Conflict of interest

De auteur bevestigt dat er geen sprake was van belangenverstrengeling die haar mogelijk ongepast heeft beïnvloed bij het schrijven van dit artikel.

1. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer. 1983;31(1):13- 20.

2. Jonat W, Arnold N. Is the Ki-67 labelling index ready for clinical use. Ann Oncol. 2011;22(3):500-502.

3. Inwald EC, Klinkhammer-Schalke M, Hofstadler F, et al. Ki67 is een prognostische parameter bij borstkankerpatiënten: resultaten van een groot populatie-gebaseerd cohort van een kankerregistratie. Breast Cancer Res Treat. 2013;139(2):539-552 .

4. De Azambuja E, Cardoso F, de Castro G, et al. Ki67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12155 patients. Br J Cancer. 2007;96(10):1504-1513.

5. Agboola AO, Banjo AA, Annunobi CC, et al. Cell proliferation (Ki67) expression is associated with poorer prognosis in Nigerian compared to British breast cancer women. ISRN Oncol. 2013;675051.

6. Iqbal J, Ginsburg O, Rochon PA, et al. Verschillen in borstkankerstadium bij diagnose en kankerspecifieke overleving naar ras en etniciteit in de Verenigde Staten. JAMA. 2015;313(2):165-173.

7. Porter PL, Lund MJ, Ming GL, et al. Raciale verschillen in de expressie van celcyclus-regulerende eiwitten in borstcarcinoom. Cancer. 2004;100(12):2533-2542.

8. Cheang MCU, Chia SK, Voduc D, et al. Ki67 index, HER2 status, en prognose van patiënten met luminal B borstkanker. J Natl Cancer Inst. 2009;101(10):736-750.

9. Harris L, Fritsche H, Mennel R, et al. The American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer. J Clin Oncol. 2007;25(33):5287-5312.

10. Dowsett M, Torsten NO, A’Hern R, et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the international Ki67 in breast cancer working group. J Natl Cancer Inst. 2011;103(22):1656-1664.

11. Yerushalmi R, Woods R, Ravdin PM, et al. Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2010;11(2):174-183.

12. Coates AS, Winer EP, Goldhirsch A, et al. Tailoring therapies – improving management of early breast cancer: St Gallen International Expert Consensus on the primary therapy of early breast cancer 2015. Ann Oncol. 2015;26(8):1533-1546.

13. Sestak I, Dowsett M, Zabaglo L, et al. Factoren die een laat recidief voorspellen voor oestrogeenreceptor-positieve borstkanker. J Natl Cancer Inst. 2013;105(19):1504-1511.

14. Paik S, Shak S, Tang G, et al. A multi gene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated node-negative breast cancer. N Engl J Med. 2004;351(27):2817-2826.

15. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, et al. Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gen recurrence score in node-negative and node-positive postmenopausal patients treated with anastrozole or tamoxifen: a trans ATAC Study. J Clin Oncol. 2010;28(11):1829-1834.

16. Cuzack J, Dowsett M, Pineda S, et al. Prognostische waarde van een gecombineerde oestrogeenreceptor-, progesteronreceptor-, Ki-67- en humane epidermale groeifactorreceptor 2 immunohistochemische score en vergelijking met de Genomic Health recidiefscore bij vroege borstkanker. J Clin Oncol. 2011;29(32):4273-4278.

17. Goss PE, Ingle JN, Martino S, et al. Randomized trial of letrozole following tamoxifen as extended adjuvant therapy in receptor-positive breast cancer: updated findings from NCIC CTG MA.17. J Natl Cancer Inst. 2005;97(17):1262-1271.

18. Davies C, Pan H, Godwin J, et al. Lange-termijn effecten van doorgaan met adjuvante tamoxifen tot 10 jaar versus stoppen na 5 jaar na diagnose van oestrogeen receptor-positieve borstkanker: ATLAS, een gerandomiseerd onderzoek. Lancet. 2013;281(9869):805-816.

19. Fasching PA, Keusinger K, Haeberle L, et al. Ki67, respons op chemotherapie en prognose bij borstkankerpatiënten die neoadjuvante therapie krijgen. BMC Cancer. 2011;11:486.

20. Sheri A, Dowsett M. Developments in Ki67 and other biomarkers for treatment decision making in breast cancer. Ann Oncol. 2012;23 Suppl 10:x219-x227.

21. Dowsett M, Smith IE, Ebbs SR, et al. Prognostische waarde van Ki67-expressie na kortdurende pre-operatieve endocriene therapie voor primaire borstkanker. J Natl Cancer Inst. 2007;99(2):167-1170

22. Cuzick J, Sestak I, Baum M, et al. Effect of anastrozole and tamoxifen as adjuvant treatment for early-stage breast cancer. 10 year analysis of the ANAC trial. Lancet Oncol. 2010;11(12):1135-1141.

23. Dowsett M, Smith I, Robertson J, et al. Endocrine therapy, new biologicals, and new study designs for presurgical studies in breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011;2011(43):120-123.

24. Billgren A-M, Rutqvist LE, Tani E, et al. Prolifererende fractie tijdens meoadjuvante chemotherapie bij borstkanker in relatie tot objectieve lokale respons en recidiefvrije overleving. Acta Oncol. 1999;38(5):597-601.

25. Jones RL, Salter J, A’Hern R, et al. The prognostic significance of Ki67 before and after neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2009;116(1):53-68.

26. Hammond ME, Hayes DF, Wolff AC, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline. Recommendations for immune histochemical testing of oestrogeen and progesterone receptors in breast cancer. J Oncol Pract. 2010;6(4):195-197.