Effect van Bacillus megaterium-gecoate diëten op de groei, spijsverteringsenzymactiviteit en intestinale microbiële diversiteit van Songpu spiegelkarper Cyprinus specularis Songpu

Abstract

De huidige studie werd uitgevoerd om het effect van een Bacillus megaterium-gecoate voeding op de groeiprestaties te evalueren, spijsverteringsenzymen, en de intestinale microbiële diversiteit bij Songpu spiegelkarper (Cyprinus specularis Songpu). De vissen werden gedurende 56 dagen driemaal daags manueel gevoederd met twee diëten (een controledieet en een met B. megaterium gecoat dieet) tot ze blijkbaar verzadigd waren. In vergelijking met de controlegroep verbeterde de supplementatie met B. megaterium de groei van de vissen en verminderde de voederconversie aanzienlijk (). De activiteiten van amylase en lipase in het voordarmkanaal van de behandelde groep waren significant hoger dan die van de controlegroep (). De activiteiten van de voordarm-, middendarm- en achterdarmproteasen in de behandelde groep waren allemaal hoger dan die in de controlegroep (). De resultaten van de sequentiebepaling van de 16S rDNA-genen van de microbiota door middel van high-throughput sequentiebepaling toonden aan dat de diversiteit en abundantie van de intestinale microflora toenamen naarmate de Songpu spiegelkarper groeide. De Songpu spiegelkarpers die gevoederd werden met een dieet gecoat met B. megaterium vertoonden verhoogde verhoudingen van intestinale Bacillus en Lactococcus op genusniveau, en beide waren significant hoger dan die van de controlegroep (). Deze resultaten suggereren dus dat het toedienen van B. megaterium via het dieet de groei en de spijsverteringsenzymactiviteit van Songpu spiegelkarper kan verbeteren en de gunstige genus-samenstelling van zijn belangrijkste intestinale microflora kan verrijken.

1. Inleiding

Vis, als een van de belangrijkste voedingsbronnen van dierlijke eiwitten, speelt een zeer belangrijke rol in de menselijke voedselstructuur. In de afgelopen jaren is de veiligheid van aquatische producten echter een van de grootste factoren geworden die de ontwikkeling van aquatische producten belemmeren, vanwege de bezorgdheid over de veiligheid van hormonen, antibiotica en overmatige micro-organismen . Door de snelle ontwikkeling van de intensieve kweek in hoge dichtheid verslechtert het watermilieu in de aquacultuur dagelijks, wat leidt tot het uitbreken van ziekten en zelfs tot massale sterfte onder de gekweekte dieren. Er is dringend behoefte aan milieuvriendelijke en veilige alternatieven om de gezonde groei van landbouwhuisdieren te waarborgen. Als een nieuw toevoegingsmiddel voor diervoeder na het tijdperk van de antibiotica, worden probiotica beschouwd als belangrijke vervangers van antibiotica voor diervoeder. Studies hebben aangetoond dat het gebruik van probiotica niet alleen de groei van waterdieren kan bevorderen en hun overlevingskans kan verbeteren, maar ook de incidentie van ziekten bij waterdieren kan verminderen. Bacillus is een saprofytische grampositieve bacterie die algemeen wordt aangetroffen in de kweekomgeving . Het onderzoek naar en de toepassing van Bacillen op het gebied van de aquacultuur hebben veel aandacht getrokken. De eerste toepassing van probiotica in de aquacultuur vond plaats door de bacteriële populatie in het water in evenwicht te brengen, en daarbij werden goede resultaten geboekt . Sommige studies hebben aangetoond dat toevoeging van Bacillus subtilis aan voeder niet alleen de groei van waterdieren kan bevorderen en de activiteiten van hun spijsverteringsenzymen en hun niet-specifieke immuniteit kan verbeteren, maar ook de structuur van hun intestinale microflora kan verbeteren . In het midden van de 20e eeuw begonnen Chinese geleerden Bacillus megaterium te bestuderen, voornamelijk gericht op het screenen van stammen, met name hun vermogen om organisch materiaal af te breken, hun stikstofmetabolisme, en hun toepassing als probiotica in de behandeling van afvalwater van aquacultuur .

De gewone karper (Cyprinus carpio) is de meest extensief gekweekte zoetwatervissoort in China, en de productie van gewone karper bedroeg 2.962.218 ton in 2018 . Songpu spiegelkarper (Cyprinus specularis Songpu), een variëteit van gewone karper, neemt een steeds groter deel van de productie voor zijn rekening vanwege zijn relatief snellere groei, betere weerstand tegen ziekten, hogere vleesconversie, en bijna afwezigheid van schubben op het lichaamsoppervlak . Met de uitbreiding en bevordering van de kweek in hoge dichtheden, de toenemende voederfrequentie en de waterverontreiniging zijn de problemen op het gebied van voedselveiligheid en -kwaliteit echter steeds ernstiger geworden.

Nutriënten behoren tot de belangrijkste en gemakkelijkst te reguleren factoren die van invloed zijn op de weerstand van waterdieren. De microbiologie van levensmiddelen omvat micro-organismen die zowel gunstige als schadelijke effecten hebben op de kwaliteit en de veiligheid van levensmiddelen en daarom van belang kunnen zijn voor de volksgezondheid. In deze studie wilden we het effect van B. megaterium-gecoate diëten op de groei, de spijsverteringsenzymactiviteit en de intestinale microbiële diversiteit bij Songpu spiegelkarper evalueren en een theoretische basis leggen voor de praktijk van gezonde en ecologische viskweek.

2. Materialen en Methoden

2.1. Bereiding van het dieet

B. megaterium werd bereid in ons laboratorium. Het gehalte aan B. megaterium was . Het commerciële voeder werd aangekocht bij Zhejiang AIPHA Feed Co., Ltd., China. De gegarandeerde waarden van de analyse van de samenstelling van het voederproduct zijn weergegeven in Tabel 1. De fermentatiebouillon van B. megaterium werd gelijkmatig op het oppervlak van het commerciële materiaal gesproeid aan een dosis van 100 ml/kg, en vervolgens werd het besproeide voeder gedurende 1 uur op een koele plaats geplaatst, waarna het werd gebruikt als het voeder van de experimentele groep. De controlegroep kreeg het ongewijzigde commerciële voeder.

2.2. Voederexperiment

Songpu spiegelkarper (Cyprinus specularis Songpu) (lichaamsgewicht ) werd verkregen van het Hulan Experimental Station van het Heilongjiang River Fisheries Research Institute in de provincie Heilongjiang, China (45,97°N, 126,63°E). De vissen werden gedurende 14 dagen geacclimatiseerd aan de omstandigheden in het laboratorium en werden voorafgaand aan het experiment aangepast aan het experimentele controlevoeder. Vervolgens werden 90 gezonde Songpu spiegelkarpers geselecteerd en willekeurig verdeeld in twee groepen (controlegroep en experimentele groep). Elke behandeling werd in drievoud uitgevoerd, en elk proefmonster telde 15 vissen. De controlegroep werd gevoederd met commercieel voer. De behandelingsgroep werd gevoederd met commercieel voeder gecoat met B. megaterium. De dagelijkse hoeveelheid voeder bedroeg 3% van het lichaamsgewicht van de Songpu spiegelkarper, driemaal per dag om 08:00, 12:00, en 19:00. De volledige experimentele periode duurde 56 dagen. Tijdens de experimentele periode werd het laboratoriumwater wekelijks met 1/3 van het watervolume vervangen. De waterkwaliteit werd tijdens de experimentele periode dagelijks gemeten (met YSI professional plus, Ohio State, USA), de watertemperatuur varieerde van 18 tot 25°C, en een luchtcompressor werd gebruikt om 24 uur per dag zuurstof toe te voegen. De vissen werden zowel aan het begin als aan het einde van de voederproef gewogen.

2.3. Vóór het voederexperiment werden willekeurig tien vissen uit de tijdelijke kweekbak genomen, en hun aanvankelijke lichaamsgewicht werd gemeten. Vervolgens werd het darmkanaal verzameld voor het meten van de initiële intestinale microflora (initiële groep). Aan het einde van de 56-daagse voederproef, ongeveer 24 uur na de laatste voedering, werden alle vissen verdoofd met MS-222 verdund in het water in een concentratie van 75 mg/l. Deze vissen werden geteld en gewogen om de gewichtstoename (WGR), de specifieke groeisnelheid (SGR) en de voederconversie (FCR, Tabel 2) te bepalen.

Behandeling Controle B. megaterium Initieel lichaamsgewicht (g) Eindig lichaamsgewicht (g) WGR (%) a b SGR (% dag-1) a b FCR a b

Note: in dezelfde rij betekenen waarden met verschillende kleine letter superscripts een significant verschil (), terwijl waarden met dezelfde of geen letter superscripts geen significant verschil betekenen (). .

Tabel 2

Groei van Songpu spiegelkarper (Cyprinus specularis Songpu) gevoederd met diëten gecoat met B. megaterium gedurende 56 dagen ().

Na het bepalen van het eindgewicht van alle vissen, werden vijf vissen uit elke tank willekeurig geselecteerd en in een ijsplaat geplaatst voor een snelle dissectie. Weefselmonsters, met inbegrip van de voordarm, middendarm en achterdarm, werden verzameld met een aseptische schaar, gewassen met een aseptische fysiologische zoutoplossing, gewogen, en vervolgens bereid tot een homogenaat met een aseptische fysiologische zoutoplossing (1 : 4). Alle monsters werden onmiddellijk bij -80°C in een vriezer bewaard voor de bepaling van de verteringsenzymen. Uit elke tank werden willekeurig nog eens vijf vissen bemonsterd. De oppervlakken van de vissen werden ontsmet met 75% alcohol voordat de vissen naar een biocleanruimte werden gebracht. Na verdere ontsmetting werd de buikholte geopend, de buitenkant van de darm afgeveegd met 75% alcohol en viermaal gewassen met steriel water, en vervolgens werd het darmkanaal verzameld voor evaluatie van de uiteindelijke intestinale microflora.

2.4. Verteringsenzymen Bepaling

Voordat de immuniteitsindexen werden gemeten, werden de samengevoegde voordarm, middendarm en achterdarm handmatig gehomogeniseerd in een glazen homogenisator met 0,86% NaCl (/) om een 10%-homogenaat te verkrijgen. Na centrifugatie (4000 rpm, 10 min) bij 4°C werd het supernatant, dat hoofdzakelijk uit ruwe enzymenvloeistof bestond, verkregen. De activiteiten van amylase, protease en lipase in de voordarm, middendarm en achterdarm werden spectrofotometrisch geanalyseerd met behulp van diagnostische reagenskits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China).

2.5. 16S rRNA Gen Amplificatie en Illumina Sequencing

Microbieel DNA werd geëxtraheerd uit de darmmonsters met behulp van de E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) volgens de protocollen van de fabrikant. De uiteindelijke DNA-concentratie en de zuivering werden bepaald met een NanoDrop 2000 UV-vis spectrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, VS), en de DNA-kwaliteit werd bepaald met 1% agarose gelelektroforese. De V4-V5 hypervariabele regio’s van de bacteriële 16S rRNA-genen werden geamplificeerd met de primers 515F (5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3) en 907R (5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3) met behulp van een thermocycler PCR-systeem (GeneAmp 9700, ABI, USA). De PCR’s werden uitgevoerd met behulp van het volgende programma: 3 min denaturatie bij 95°C, 27 cycli van 30 s bij 95°C, 30 s voor annealing bij 55°C, en 45 s voor elongatie bij 72°C, en een laatste extensie bij 72°C gedurende 10 min. De resulterende PCR-producten werden geëxtraheerd van een 2% agarosegel en verder gezuiverd met een AxyPrep DNA gel extractiekit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) en gekwantificeerd met QuantiFluor™-ST (Promega, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Gezuiverde amplicons werden in equimolaire hoeveelheden gepoold en paired-end gesequenced () op een Illumina MiSeq-platform (Illumina, San Diego, VS) volgens de standaardprotocollen van Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Shanghai, China). (Shanghai, China) .

2.6. Statistische analyse

Operationele taxonomische eenheden (OTU’s) werden geclusterd met een 97% similariteit cutoff met behulp van UPARSE (versie 7.1, http://drive5.com/uparse/) met een nieuw “greedy” algoritme dat tegelijkertijd chimera filtering en OTU-clustering uitvoert. De taxonomie van elke 16S rRNA gensequentie werd geanalyseerd met het RDP Classifier algoritme (http://rdp.cme.msu.edu/) tegen de SILVA 16S rRNA database met een betrouwbaarheidsdrempel van 70%. De Chao en ACE estimator indexen werden geselecteerd om de gemeenschapsrijkdom te identificeren, en de Shannon en Simpson indexen werden gebruikt om de gemeenschapsdiversiteit te identificeren. Al deze indexen in onze monsters werden berekend met QIIME (versie 1.7.0) en klaargemaakt voor weergave met R software (versie 2.15.3). De statistische analyses werden uitgevoerd met het statistische softwarepakket SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). De gegevens zijn uitgedrukt als de van drie replicaten. De gegevens werden onderworpen aan een eenweg ANOVA, en wanneer verschillen werden gevonden, werden de gemiddelden gerangschikt met behulp van de Duncan’s multiple comparison test. Verschillen werden als significant beschouwd bij .

3. Resultaten

3.1. Effect van het met B. megaterium gecoate dieet op de groei van de vissen

Zoals blijkt uit tabel 2, waren de gewichtstoename en de specifieke groeisnelheid van de behandelingsgroep (71,03%, 0,42% dag-1) significant hoger dan die van de controlegroep (52,75%, 0,33% dag-1, ), en de voederconversieverhouding van de behandelingsgroep (1,28) was significant lager dan die van de controlegroep (2,23, ). Er werd geen sterfte waargenomen gedurende de 56 dagen van de voederproef.

3.2. Effect van het B. megaterium-gecoate dieet op de spijsverteringsenzymactiviteit

De effecten van het B. megaterium-gecoate dieet op de spijsverteringsenzymactiviteit zijn weergegeven in tabel 3. De voordarm amylase activiteit in de behandelingsgroep was significant hoger dan die in de controlegroep (). De midgut en hindgut amylase activiteiten in de behandelingsgroep waren significant hoger dan die in de controlegroep, maar er waren geen significante verschillen (). De voordarm-, middendarm- en achterdarmproteaseactiviteit van de behandelde groep was hoger dan die van de controlegroep, maar er waren geen significante verschillen (). De lipase-activiteit in het voordarmkanaal van de behandelde groep was significant hoger dan die van de controlegroep (). De midgut en hindgut lipase activiteiten in de behandelgroep waren in principe hetzelfde als die in de controlegroep, en er waren geen significante verschillen ().

3.3. Effect van het met B. megaterium gecoate dieet op de spijsvertering in de darm (voordarm, middendarm en achterdarm).

3.3. Effect van het met B. megaterium gecoate dieet op de intestinale microbiële diversiteit en rijkdom

De intestinale microbiële diversiteit van de Songpu spiegelkarper werd bepaald door high-throughput sequencing. Het gemiddelde aantal gedetecteerde OTU’s van het initiële groepstaal was 63. Na 56 dagen was het gemiddelde aantal gedetecteerde OTU’s in de controle- en behandelingsgroepen respectievelijk 114 en 196. De dekkingsindex van alle monsters lag boven 0,97, wat duidt op een hoog detectiepercentage. Zoals blijkt uit tabel 4, waren de Chao en ACE indexen, die de rijkdom van de intestinale microflora van Songpu spiegelkarper weergeven, significant hoger in de behandelingsgroep na 56 dagen dan in de controle en initiële groepen (). De Shannon-index van de diversiteit van de darmgemeenschap in de behandelingsgroep was significant hoger dan die in de controlegroep (). De Simpson-index van de diversiteit van de darmgemeenschap in de behandelingsgroep was significant lager dan die in de controlegroep (). Er waren geen significante verschillen voor de bovengenoemde vier indexen tussen de controle- en initiële groepen ().

3.4. Effect van het B. megaterium-gecoate dieet op de samenstelling en veranderingen in de belangrijkste microbiota in de darm van de Songpu spiegelkarper

Een microbiële rijkdom in de darm van meer dan 1% op fylumniveau werd genomen als de belangrijkste microflora voor de statistieken gepresenteerd in figuur 1. Het dominante fylum in de darm van de initiële groep was overwegend Fusobacteria (86,36%) en Bacteroidetes (8,60%) vóór het begin van het experiment. Na de 56-daagse voederproef nam het aantal van de belangrijkste intestinale microflora in elke groep toe. In de controlegroep waren de dominante fyla Fusobacteriën (86,36%), Bacteroidetes (14,4%), Firmicutes (2,42%), en Proteobacteria (1,37%). In de behandelingsgroep waren de dominante fyla Firmicutes (69,15%), Proteobacteria (23,8%), Bacteroidetes (4,65%), en Actinobacteria (1,43%). Een intestinale microbiële rijkdom van meer dan 0,5% op genusniveau werd beschouwd als de belangrijkste microflora voor de statistische berekeningen, weergegeven in Tabel 5. Er waren slechts 5 genera van de belangrijkste intestinale micro-organismen in de initiële groep. Na de 56-daagse voederproef nam het aantal voornaamste intestinale micro-organismen toe tot 11 genera in de behandelingsgroep. Het meest voorkomende micro-organisme in de darm van Songpu spiegelkarper in de aanvangsgroep was Cetobacterium. Na de 56-daagse voederproef was het meest voorkomende micro-organisme in de controlegroep nog steeds Cetobacterium. In de controlegroep waren de 11 dominante genera Bacillus, Lactococcus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Brochothrix, Myroides, Arthrobacter, Flavobacterium, Comamonadaceae_unclassified, en Yersinia. De Songpu spiegelkarper gevoederd met een dieet gecoat met B. megaterium vertoonde verhoogde proporties van intestinale Bacillus en Lactococcus op genus niveau, die beide significant hoger waren dan die van de controlegroep ().

Figuur 1

Intestinale microbiële samenstellingen op fylum-niveau bij Songpu spiegelkarpers die gedurende 56 dagen gevoederd werden met een dieet gecoat met B. megaterium gedurende 56 dagen.

Genus Behandelingen Initieel Controle B. megaterium Cetobacterium – Lactococcus – – Bacillus – – Enterobacteriaceae_unclassified – – – Bacteroides – Comamonadaceae_unclassified – Yersinia – Pseudomonas – – Pseudoxanthomonas – – Fusobacteriales_unclassified – Stenotrophomonas – Psychrobacter – – Leucobacter – – – Brochothrix – – Myroides – Barnesiella – Rhodobacter – – Arenimonas – – Clostridium – Arthrobacter – Flavobacterium – Anderen

Noten: – betekent dat het percentage van het genus dat verantwoordelijk is voor de totale intestinale microflora minder dan 0,5% bedraagt.

Tabel 5

Procentages van de belangrijkste genus van de intestinale microflora bij Songpu spiegelkarper gevoederd met een dieet gecoat met B. megaterium gedurende 56 dagen.

4. Discussie

Probiotica zoals Bacillen zijn op grote schaal gebruikt in de aquacultuur. Sommige studies hebben aangetoond dat de toevoeging van verschillende stammen van Bacillus spp. aan larvenvoer goede resultaten heeft opgeleverd en een goed bevorderend effect heeft op de groei van vislarven. De toevoeging van bacteriën (stam CA2) als voedingssupplement aan xenische larvale culturen van de oester Crassostrea gigas bevorderde consequent de groei van de larven gedurende verschillende seizoenen van het jaar . Manipulatie van de microbiota met probiotica wordt in de aquacultuur gebruikt om pathogene bacteriën te bestrijden of te remmen en de groeiprestaties en de activiteit van verteringsenzymen te verbeteren. In vergelijking met de onbehandelde controlegroep, waren het eindgewicht en de gewichtstoename significant hoger bij garnalen die gevoederd werden met een mengsel van twee probioticastammen. In deze studie werd vastgesteld dat met B. megaterium gecoate diëten de gewichtstoename en de specifieke groeisnelheid verhoogden en de voederconversie verlaagden, wat erop wijst dat met B. megaterium gecoate diëten de groei van Songpu spiegelkarper kunnen bevorderen. Vergelijkbare resultaten werden gevonden bij meerval Clarias sp., waar de toevoeging van B. megaterium PTB 1.4 aan hun voer hun groeisnelheid aanzienlijk verbeterde. Vergelijkbare resultaten werden ook gevonden bij Penaeus monodon, waarvoor hogere FCR- en SGR-waarden werden verkregen na toevoeging van Bacillus cereus.

Probiotische bacteriën zijn in staat verteringsenzymen te produceren die de vissen helpen bij het gebruik en de vertering van voedingsstoffen. De toevoeging van B. megaterium aan plantaardige eiwitmaaltijden kan de ontwikkeling van de darmmorfologie bevorderen en de activiteit van verteringsenzymen verhogen . De studie van probiotica voor de gewone karper Cyprinus carpio gebaseerd op groeiprestaties en spijsverteringsenzymactiviteit toonde aan dat de gemiddelde spijsverteringsenzymactiviteit van alle probiotische behandelingsgroepen significant verschilde van die van de controle . In de huidige studie had een met B. megaterium gecoat dieet een positief en belangrijk effect op de spijsverteringsenzymactiviteiten, vooral die van amylase en protease in de voordarm, middendarm en achterdarm. Vergelijkbare resultaten werden ook gevonden bij tilapia, die een verbetering van de voedselvertering en groei lieten zien nadat Bacillus NP5 aan hun voer was toegevoegd. Een hoger niveau van enzymactiviteit, verkregen met probiotica bevattende diëten, verbeterde de vertering van eiwit, zetmeel, vet en cellulose, wat op zijn beurt de betere groei zou kunnen verklaren die werd waargenomen met de probiotica-bijgevoegde diëten . Verteringsenzymen helpen vissen bij het afbreken en verteren van voedingsstoffen in het voer, waardoor de vissen de voedingsstoffen in het voer gemakkelijker kunnen opnemen.

De vooruitgang in high-throughput sequencing heeft een uitgebreide catalogus van metagenomische monsters mogelijk gemaakt, die inzicht geeft in de diversiteit van microbiële soorten uit een grote verscheidenheid aan bronnen, waaronder de oceaan, de bodem en het menselijk lichaam. Deze studies gebruiken zowel 16S rRNA-gensequencing om fylogenetische relaties te bepalen als meer uitgebreide shotgun-sequencing om de gedetailleerde soort- en genensamenstelling te voorspellen. De rijkdom index en diversiteit index zijn belangrijke indexen om de diversiteit en complexiteit van micro-organismen in monsters te detecteren . In deze studie, met de groei van Songpu spiegelkarper, werden de intestinale microbiële diversiteit en rijkdom verhoogd, en de Chao en ACE indexen, die de rijkdom van de intestinale microflora van Songpu spiegelkarper weerspiegelen, waren significant hoger in de behandelingsgroep dan in de controlegroep. Bovendien was de Shannon-index van de diversiteit van de darmgemeenschap in de behandelingsgroep significant hoger dan die in de controlegroep. Evenzo toonden de resultaten aan dat de structuur van de intestinale microflora veranderde wanneer juveniele stompe snuitbrasems gevoederd werden met diëten waaraan verschillende hoeveelheden Bacillus subtilis toegevoegd werden. De toevoeging van probiotica aan het voeder kan ook het aantal en de structuur van de oorspronkelijke microflora in het darmkanaal van Litopenaeus vannamei veranderen en de complexe interacties tussen de microbiële gemeenschappen in het darmkanaal van Litopenaeus vannamei bevorderen.

In deze studie vertoonden de Songpu spiegelkarpers die gevoederd werden met een dieet gecoat met B. megaterium verhoogde proporties van intestinale Bacillus en Lactococcus op genusniveau, die beide significant hoger waren dan die van de controlegroep. De resultaten toonden ook aan dat de samenstelling en de verhoudingen van de belangrijkste microbiota in de darm van Songpu spiegelkarper kunnen veranderd worden met B. megaterium gecoate diëten. Concluderend kan het gebruik van B. megaterium-gecoate diëten de groei van vissen aanzienlijk verbeteren en de voederconversieverhouding verlagen, de activiteiten van spijsverteringsenzymen verbeteren en de gunstige genus-samenstelling van de belangrijkste intestinale microflora verrijken.

Beschikbare gegevens

Alle gegevens werden in het artikel verstrekt, en er zijn geen gegevens meer te uploaden.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten te onthullen hebben.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door de Central-Level Non-Profit Scientific Research Institutes Special Funds (no. HSY202005M), de Natural Science Foundation van de provincie Heilongjiang (nr. QC2018038), het Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (nrs. 2017HY-ZD0507, 2019XT0502, en 2020TD56), het National Key R&D Program of China (nr. 2019YFD0900302), en het Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (nr. FBB2017-04).