Heparin-Induced Thrombocytopenia (HIT) – A sensible laboratory approach (hopefully)

David L. McGlasson, MS MLS(ASCP)

Posted: January 28, 2020

Heparin-Induced Thrombocytopenia (HIT) – A sensible laboratory approach (hopefully)

Terug in 1980, werd ik blootgesteld aan mijn eerste verzoek voor een work-up van een aandoening die ik nog nooit had meegemaakt. Een hematoloog van onze instelling kwam binnen met het verzoek om te zien of een patiënt in onze instelling misschien een geval van door heparine geïnduceerde trombocytopenie (HIT) had. Ik had toen nog nooit van deze aandoening gehoord, dus moest ik het op de oude manier opzoeken in de Index Medicus (echte boeken) voor een referentie. Ik kon op dat moment in onze omgeving geen laboratoriumprocedures vinden, dus begon ik aan een missie om een methode gevalideerd te krijgen, zodat ik deze arts kon helpen bij de behandeling van dit onderwerp. Later vond ik een methode waarbij gebruik werd gemaakt van lichttransmissie aggregometrie (LTA). Deze procedure gebruikte normaal donorplaatjesrijk plasma (PRP) en patiëntendonorserum met meerdere concentraties UFH om te controleren op een aggregatiereactie. Dit werd uitgevoerd op een tweekanaals LTA Chronolog aggregometer. Ik kan u de referentie niet geven omdat Pubmed slechts teruggaat tot 1983 over dit onderwerp.

Toen moest ik leren wat HIT inhield. HIT is de nasleep van een immuunreactie die een contradictio in terminis is of een “paradox” van reacties. Drugsgeïnduceerde immuun trombocytopenie kan worden veroorzaakt door medicijnen zoals kinine en vancomycine die een onmiddellijke en drastische trombocytopenie veroorzaken (<20 x 109/L), die ernstige bloedingen veroorzaakt. Een persoon met een echte HIT-reactie kan 50% van zijn bloedplaatjes verliezen beginnend na de start van heparine na een periode van 5 dagen of meer, maar in plaats van hemorragische problemen, ontwikkelen ze trombotische problemen.

HIT is een immuunresponsprobleem veroorzaakt door IgG-antilichamen. De antilichamen ontwikkelen zich als reactie op ongefractioneerde heparine (UFH) en laag-moleculaire-gewicht heparine (LMWH). Het voorkomen in reactie op UFH-therapie is 0,5-5%. Bij LMWH-therapie is de incidentie van HIT een tiende van die bij UFH.

HIT is een aandoening waarbij de arts snel beslissingen moet nemen om catastrofale gevolgen voor de patiënt te voorkomen. Hij kan de 4Ts-score samen met het aantal bloedplaatjes gebruiken om te bepalen of hij laboratoriumtestprotocollen moet bestellen: De 4Ts is een pretest scoringssysteem voor HIT dat veel gebruikt wordt in de klinische praktijk. Zie de tabel hieronder. De titel verwijst naar vier kenmerken van HIT:

• Thrombocytopenie
• Tijdstip van trombocytopenie ten opzichte van blootstelling aan heparine
• Thrombose of andere sequelae van HIT
• Waarschijnlijkheid van andere oorzaken van trombocytopenie

Tabel. 4Ts score

Feature	Score
	2 punten	1 punt	0 punten
Thrombocytopenie	>50% daling en bloedplaatjes nadir 20-100 × 109/L	30%-50% daling of bloedplaatjes nadir 10-19× 109/L	< 30% daling of bloedplaatjes nadir < 10×109/L
Tijdstip van daling bloedplaatjesaantal	Clear onset op dag 5-10, of ≤ 1 dag bij blootstelling aan heparine in de afgelopen 30 dagen	Assistent met daling op dag 5-10, maar niet duidelijk (bijv. ontbrekende trombocytenaantallen); begin na dag 10; of daling ≤1 dag bij blootstelling aan heparine 30-100 dagen geleden	Daling van aantal bloedplaatjes ≤4 d zonder recente blootstelling aan heparine
Thrombose of andere restverschijnselen	Nieuwe trombose (bevestigd); huidnecrose op injectieplaatsen van heparine; anafylactoïde reactie na IV heparinebolus; bijnierbloeding	Progressieve of recidiverende trombose; erythemateuze huidlaesies; trombose vermoedelijk maar niet bewezen	Geen
Andere oorzaken van trombocytopenie	Geen duidelijke	Mogelijk	Geen

De maximale score is 8. Een score van 6-8 duidt op een hoge waarschijnlijkheid van HIT. Een score van 4-5 wijst op een intermediaire aanwezigheid van HIT en een score van 0-3 is een lage kans op de aanwezigheid van HIT.3,4

Als HIT wordt vermoed door een verhoogde 4Ts-score zal het laboratorium de arts helpen bij het stellen van een nauwkeurige diagnose. Dit kan worden bereikt door een aantal bepalingen. Deze vallen gewoonlijk in twee klassen uiteen: immunologisch en functioneel. De volgende informatie bespreekt de tests die het meest worden gebruikt bij het laboratoriumonderzoek naar de aandoening.

Laboratoriumdiagnostische tests voor HIT

HIT-immunoassay: Tests om anti-PF4/heparine-antilichamen op te sporen

Enzyme-immunoassays (EIA’s) (detecteren IgG)

EIA (detecteren polyspecifieke antilichamen)

Deze methoden zijn gewoonlijk PF4-afhankelijk met een hoge gevoeligheid. HIT-subjecten zullen 97% positief testen met vaste fase kits. Deze zijn op grote schaal in de handel verkrijgbaar. De methoden worden gewoonlijk in batch getest vanwege de lange duur van deze methode. Zwak positieve resultaten kunnen echter een lage specificiteit hebben. Richtlijnen voor positiviteit moeten in elke laboratoriumsetting worden opgesteld.

– IgG-specifieke chemiluminescentie assay (CLIA)

-Een chemiluminescentie immunoassay (CLIA) is een snelle geautomatiseerde procedure die anti-PF4/heparine antilichamen detecteert met magnetische deeltjes gecoat met PF4/polyvinylsulfonaat (PVS). Na incubatie, magnetische scheiding en een wasstap wordt een tracer bestaande uit een isoluminol-gelabeld antihumaan IgG-antilichaam toegevoegd, dat zich bindt aan de anti-PF4/heparine-antilichamen op de deeltjes. Een tweede incubatie, magnetische scheiding en wassen voltooien de reactie. Er wordt een OD-meting verkregen die evenredig is met de concentratie van de gemeten anti-PF4/heparine-antilichamen. De tests worden gewoonlijk op verzoek uitgevoerd met een doorlooptijd van ongeveer 30 minuten. In een studie waarin deze methode werd vergeleken met de gouden-standaard serotonine release assay (SRA), waren de testcorrelaties uitstekend wat specificiteit en gevoeligheid betreft (respectievelijk 98,8/97,0%).6

– Latex immunoturbidometric assay (LIA) voor (HIT).

LIA wordt geclassificeerd als een immunoassay. Zij verschilt van de meeste andere immunoassays, zoals EIA’s, in die zin dat de aanwezigheid van PF4/heparine-reactieve antilichamen in het plasma van de patiënt resulteert in remming van deeltjesagglutinatie door competitie met een HIT-imiterend monoklonaal antilichaam. Dienovereenkomstig is de LIA een “gefunctionaliseerde immunoassay” genoemd, die in theorie suggereert dat het diagnostische specificiteit zou kunnen bieden die het midden houdt tussen de zeer specifieke functionele assay, SRA, en de minder specifieke PF4-afhankelijke EIA-methoden. Dit is een gemakkelijk te automatiseren procedure met een doorlooptijd van ongeveer 20 min. Studies hebben een gevoeligheid van 97,4% en een specificiteit van 91,2% aangetoond.7

Lateral flow Assay (STiC):

Lateral flow immunoassays detecteren IgG-antilichamen tegen PF4/polyanion complexen die zich in een evaluatiekaart bevinden, waarbij de resultaten visueel worden afgelezen. Met een incubatietijd van 10 minuten is dit een snelle methode om de aanwezigheid van een HIT vast te stellen.

Functionele HIT Assays: Assays die antilichamen opsporen die bloedplaatjes kunnen binden en activeren

Serotonine release assay (SRA) – Heparin-induced platelet activation test (HIPA) – Platelet aggregation test (PAT) – Flow cytometry-based assays.

Serotonine release assay (SRA): HIT confirmatory assay

Met deze methode worden bloedplaatjesactiverende antilichamen opgespoord. De SRA meet de vrijgekomen radiogelabelde serotonine uit bloedplaatjes.9,10 Voor een positief resultaat is > 20% vrijgekomen serotonine nodig bij lage dosis UFH en < 20% vrijgekomen serotonine bij aanwezigheid van hoge UFH-niveaus. Deze methode is in het verleden algemeen erkend als de gouden standaard voor bevestigingstests. Zij heeft een sensitiviteit en specificiteit van 95%. De SRA pikt detectie van bloedplaatjesactiverende antilichamen op. Het heeft de hoogste gevoeligheid/specificiteit voor klinische HIT. De SRA heeft ook een veel grotere diagnostische specificiteit dan de EIA. De SRA moet niet worden uitgevoerd zonder een eerdere positieve EIA-uitslag als screeningstest. Dit helpt het probleem van een vals-positieve SRA uit te sluiten. Als een negatieve EIA wordt gevonden in een specimen met een positieve SRA, moet dit een “rode vlag-waarschuwing” zijn dat de SRA-methode moet worden geëvalueerd.

De SRA kan ook informatie verschaffen over de vraag of een HIT-serummonster een sterke bloedplaatjesrespons kan veroorzaken in afwezigheid van heparine. De heparine-onafhankelijke activering van de bloedplaatjes is een waarschuwing voor een zeer ernstige aanwezigheid van HIT. Deze bevinding kan wijzen op vertraagd ontstane HIT en sterk positieve HIT met de aanwezigheid van consumptieve coagulopathie met een risico op microvasculaire trombose.

De test is complex, duur en tijdrovend. Er zijn normale donorplaatjes voor nodig (moeilijk te standaardiseren vanwege de individuele normale donorreacties). Daarom is het een relatief niet-gestandaardiseerde test die niet op grote schaal wordt gebruikt.9,10

Heparin-induced platelet activation assay (HIPA):

Deze methode is een gewassen bloedplaatjesactiveringstest die doorgaans alleen in Europa wordt uitgevoerd. Deze assay wordt uitgevoerd door aggregatie van bloedplaatjes en visueel bepaald door een eindpunt voor de activering van bloedplaatjes.10 Ter vergelijking: de SRA wordt uitgevoerd door bloedplaatjes in een shaker te testen en gedurende 60 minuten te laten reageren. De HIPA verschilt in die zin dat gebruik wordt gemaakt van geroerde bloedplaatjes en visueel wordt afgelezen met intervallen van 5 minuten gedurende 45 minuten.

Sommige onderzoekers hebben geconstateerd dat de HIPA-methode gevoeliger is voor het opsporen van bloedplaatjesactiverende antilichamen dan de SRA-procedure. Deze bevinding kan echter niet-pathogene antilichamen oppikken, waardoor de specificiteit van de diagnose afneemt.6

Plaatjesaggregatietests

(LTA: lichttransmissieaggregometrie)/WB: aggregometrie van volbloed):

Lichttransmissieaggregometrie (LTA) was de eerste test die werd gebruikt om een kwalitatieve bloedplaatjesreactie op HIT-antilichamen te bepalen. De test wordt uitgevoerd door normaal donor-PRP en patiënt-PRP in een cuvette te plaatsen die wordt geroerd. Heparine wordt aan het mengsel toegevoegd in verschillende concentraties, en de aggregatie wordt gedurende 15 minuten gecontroleerd. Als een monster aggregatie vertoont, wordt een hogere concentratie heparine toegevoegd om het punt te bepalen waarop de aggregatie wordt geremd. Dit krijgt een positieve of negatieve kwalitatieve resultaatbepaling: negatief, zwak positief, of sterk positief (0, 2, 3). Deze assay wordt niet langer gebruikt vanwege de arbeidsintensiviteit en de betrekkelijk lage gevoeligheid.11

– Bij aggregometrie van bloedplaatjes in volbloed (WB) wordt gebruik gemaakt van een mengsel van normale donorplaatjes en volbloed of serum van de patiënt, afhankelijk van de aggregometer die wordt gebruikt. Als die informatie niet bekend is, moet de donor bloedgroep O hebben. De volbloeddonor(en) moet(en) vooraf worden gekwalificeerd (met behulp van een HIT-positief monster) om er zeker van te zijn dat het monster op het antilichaam reageert. Afhankelijk van de WB-methode kan het monster worden afgenomen in een gewone 3,2% natriumcitraatbuis of een speciale hirudine-afnamebuis. Beide methoden maken gebruik van een vorm van impedantieaggregometrie. Voor elke methode worden heparine en bloedmonsters geïncubeerd en wordt aggregatie waargenomen door impedantie-aggregometrie. Monsters die een aggregatierespons vertonen, worden vervolgens uitgedaagd met een hogere concentratie heparine totdat geen aggregatie meer wordt vastgesteld. WB-bloedplaatjesaggregometrie wordt beschouwd als een kwantitatieve test en wordt gerapporteerd als waarden van 0-3, afhankelijk van de concentratie heparine die nodig is om de waargenomen aggregatie te verminderen.11

Flowcytometrie voor de aanwezigheid van HIT

De Platelet P-Selectin Expression Assay (PEA) wordt gebruikt voor evaluatie van HIT door middel van flowcytometrie. Zoals we eerder bespraken, is de SRA-methode de “gouden standaard” voor bevestigingstests om antilichamen te herkennen die PF4 kunnen herkennen in een compex met de aanwezigheid van heparine. Sommige patiënten die met heparine zijn behandeld zonder dat er sprake is van HIT, kunnen positief zijn voor de antilichamen. De SRA is gewoonlijk alleen beschikbaar in speciale referentielaboratoria. De methode is tijdrovend, technisch veeleisend en omvangrijk. Een snelle doorlooptijd is niet mogelijk, waardoor de diagnose van de aanwezigheid van een HIT, die onmiddellijke behandeling vereist om mogelijke levensbedreigende problemen te voorkomen, nog meer vertraging zal oplopen. In een recente studie werd de SRA-methode vergeleken met de PEA-techniek waarbij gebruik wordt gemaakt van een flowcytometriesysteem. De assays maken gebruik van de PF4 afhankelijke P-selectine expressie assay de PEA. Een retrosoectuve studie werd uitgevoerd op opgeslagen serummonsters van 91 proefpersonen. Alle onderzochte patiënten hadden eerdere HIT 4Ts-informatie die het volgende omvatte: trombocytopenie, het tijdstip van het verlies van de hoeveelheid bloedplaatjes, een diagnose van trombose en elk ander geval van trombocytopenie. Alle proefpersonen met een intermediaire 4Ts score en een verhoogde PF4 EIA test met een OD ≥2.0 of een verhoogde 4Ts score en een lagere PF4 EIA test met een OK van ≥1.0 werden geclassificeerd als HIT positief; andere specimens werden geclassificeerd als HIT negatief.

In deze studie had de PEA een hoger diagnostisch resultaat (area under the curve van 0.92 vs 0.82;P-0.02) dan de SRA. Elf van de 16 serummonsters die PEA-positief en SRA-negatief waren, waren HIT-positief. De auteurs verklaarden dat andere studies met gebruikmaking van specimens met vergelijkbare bloedplaatjesmarkers en specimens die serieel verdund waren van personen met bevestigde HIT-diagnoses, aantoonden dat de PEA gevoeliger is dan de SRA voor bloedplaatjesactiverende antilichamen.

Zij concludeerden daarom dat de PEA eenvoudiger uit te voeren is en dat de resultaten een nauwkeuriger resultaat lieten zien bij de diagnose van het bestaan van de aanwezigheid van een HIT.13

Een andere op flowcytometrie gebaseerde assay is de HITAlert van IQ Products. In een studie uit 2013 werd een protocol ontwikkeld met behulp van de HITAlert flowcytometriemethode om HIT’s op te sporen in een tertiaire ziekenhuislaboratoriumsetting. Zij vergeleken de 4Ts-score om de mogelijke aanwezigheid van een HIT bij 37 proefpersonen te screenen. Serum werd geanalyseerd op de aanwezigheid van HIT-antilichamen met de HITAlert flowcytometriemethode en vervolgens vergeleken met een antigenische assay. De vergelijkende methoden waren de deeltjesgel-immunoassay (PaGIA) ID PF4/Hep Ab assay en twee functionele tests. Zij gebruikten de Multiplate WBA (niet verkrijgbaar in de VS en Canada) en de SRA-methoden. Hun bevindingen waren als volgt: Flow Cytometrie toonde HIT-positieven aan bij 14 van de 37 patiënten. Bij de 4Ts score van laag (0 van 8) intermediair (5 0f 19) en hoog (9 van 10). In vergelijking met de SRA had de flowmethode een specificiteit van 100% en een sensitiviteit van 81% voor het vaststellen van de aanwezigheid van een HIT. De WBIA functionele test had ook een gevoeligheid van 81% en een specificiteit van 90% in vergelijking met de flowcytometrie-analyse. De PaGIA-procedure had echter slechts een specificiteit van 20% maar een sensitiviteit van 20%. Flowcytometrie had een verbeterde specificiteit ten opzichte van de antigene procedure. Dit was het duidelijkst in de 4T intermediair-risicogroep. Dit was duidelijk bij alle 3 functionele methoden die in het protocol werden gebruikt. De onderzoekers concludeerden dat de HITAlert flowcytometermethode de specificiteit van het identificeren van een HIT kon verbeteren zonder verlies van gevoeligheid.12 Deze assay is alleen voor onderzoeksgebruik in de VS en Canada en is niet beschikbaar voor diagnostische procedures.

Samenvatting voor HIT-detectie

Ik wil graag afsluiten met een algoritme dat in referentie #14 van Cuker et al staat, dat wordt aanbevolen voor de diagnose van HIT. Het is een diagnostisch algoritme van intermediaire/hoge 4Ts score, gevolgd door immunoassay, gevolgd door functionele testen die resulteren in: – Weinig vals-negatieven (gemiste HIT-diagnoses), en – Weinig of geen vals-positieven (onjuiste diagnoses van HIT).

Noot: Een functionele test is mogelijk niet nodig voor patiënten in de hoge waarschijnlijkheidsgroep op basis van hun 4Ts-score en een zeer sterk positieve immunoassay (ELISA-waarde van > 2.0 OD eenheden).

Het voorkomen van HIT is een nadelige geneesmiddelinteractie die wordt gemodereerd door bloedplaatjesactiverende antilichamen die zich richten tegen de complexen van PF4/heparine. Het is de verantwoordelijkheid van het laboratorium om de juiste laboratoriumtests te bepalen om de aanwezigheid of en het functionele vermogen van de door heparine geïnduceerde antilichamen om bloedplaatjes te activeren vast te stellen. Deze assays moeten tijdig worden uitgevoerd om artsen te helpen bij het voorkomen van catastrofale trombotische situaties.

1. Prince M, Wenham T. Heparin-induced thrombocytopaenia. Postgrad Med J 2018;94:453-457.
2. Junqueira DR, Zorzela LM, Perini E. Ongefractioneerde heparine versus laag moleculair gewicht heparines voor het vermijden van heparine-geïnduceerde trombocytopenie bij postoperatieve patiënten. Cochrane Database Syst Rev. doi: 0.1002/14651858.CD007557.pub2. Herziening. Update in: Cochrane Database Syst Rev. 2017 Apr 21;4:CD007557.
3. Cuker A, Gimotty PA, Crowther MA, Warkentin TE. Voorspellende waarde van het 4Ts scoringssysteem voor heparine-geïnduceerde trombocytopenie: een systematische review en meta-analyse. . 2012 Nov 15. 120(20):4160-7.
4. Lo GK, Juhl D, Warkentin TE, Sigouin CS, Eichler P, Greinacher A. Evaluation of pretest clinical score (4 T’s) for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia in two clinical settings. . 2006 Apr. 4(4):759-65.
5. Warkentin TE, Sheppard JI, Moore JC, et al: Quantitative interpretation of optical density measurements using PF4-dependent enzyme immunoassays. J Thromb Haemost 2008;6(8):1304-1312.
6. Warkentin TE. Laboratoriumdiagnostiek van door heparine geïnduceerde trombocytopenie. Int. J Lab Hematol. 2019;41(Suppl 1):15-25.
7. R.A. Raschke, S.C. Curry, T.E. Warkentin, R.D. Gerkin I. Verbetering van de klinische interpretatie van de anti-plaatjes factor 4/heparine enzyme-linked immunosorbent assay voor de diagnose van heparine-geïnduceerde trombocytopenie door het gebruik van receiver operating characteristic analysis, stratum-specifieke likelihood ratio’s, en Bayes theorem Chest, 144 (4) (2013), pp. 1269-1275.
8. Lau KK, Mohammed S Pasalic L et al: Laboratoriumtestprotocollen voor heparine-inducd thrombocytopenia (HIT) testen. Methods Mol Biol 2017;1646:227-243.
9. WarkentinTE, Greinacher A. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia in Warkentin TE, Greinacher A. eds. Heparin-Induced Thrombocytopenia, 5th ed. Boca Raton FL: CRC Press 2013:272-314.
10. Warkentin TE Arnold DM, Nazi I, Kelton JG. De bloedplaatjes serotonine release assay. Am J Hematol. 2015;90(6):564-572.
11. Favaloro EJ, McCaughan G, Mohammed S. et al: HIT or miss? Een uitgebreid hedendaags onderzoek van laboratoriumtesten voor heparine geïnduceerde trombocytopenie. Pathologie. 2018;50(4):426-36.
12. Solano C, Mutsando , Self M et al: Using HitAlert flow cytometry to detect heparin-induced thrombocytopenia antibodies in a tertiary care hospital… Blood Coagul and Fibrinolysis. 2013;24(4)365-70.
13. Padmanabhan A, Jones CG, Curtis BR. A Novel PF4-Dependent Platelet Activation Assay Identifies Patients Likely to Have Heparin-Induced Thrombocytopenia/Thrombosis. Chest. 2016 Sep;150(3):506-15.
14. Cuker A, Arepally GM, Chong BH, et al. American Society of Hematology 2018 guidelines for management of venous thromboembolism: heparin-induced thrombocytopenia. Blood Adv. 2018;2(22).