Microbiologie

Veel cellen zijn niet in staat om ademhaling uit te voeren als gevolg van een of meer van de volgende omstandigheden:

1. De cel mist een voldoende hoeveelheid van een geschikte, anorganische, uiteindelijke elektronenacceptor om de cellulaire ademhaling uit te voeren.
2. De cel mist genen om geschikte complexen en elektronendragers in het elektronentransportsysteem te maken.
3. De cel mist genen om een of meer enzymen in de Krebs-cyclus te maken.

Waar gebrek aan een geschikte anorganische eindelektronenacceptor milieuafhankelijk is, zijn de andere twee voorwaarden genetisch bepaald. Zo zijn veel prokaryoten, waaronder leden van het klinisch belangrijke genus Streptococcus, permanent niet in staat tot ademhaling, zelfs niet in aanwezigheid van zuurstof. Omgekeerd zijn veel prokaryoten facultatief, wat betekent dat, als de milieuomstandigheden veranderen om een geschikte anorganische eindelektronenacceptor voor ademhaling te leveren, organismen die alle genen bevatten die nodig zijn om dit te doen, zullen overschakelen op cellulaire ademhaling voor glucosemetabolisme, omdat ademhaling een veel grotere ATP-productie per glucosemolecuul mogelijk maakt.

Als de ademhaling niet plaatsvindt, moet NADH worden geheroxideerd tot NAD+ voor hergebruik als een elektronendrager voor glycolyse, het enige mechanisme van de cel om ATP te produceren, om door te gaan. Sommige levende systemen gebruiken een organische molecule (gewoonlijk pyruvaat) als laatste elektronenacceptor via een proces dat fermentatie wordt genoemd. Bij fermentatie is geen elektronentransportsysteem betrokken en wordt niet direct extra ATP geproduceerd naast het ATP dat tijdens de glycolyse wordt geproduceerd door fosforylering op substraatniveau. Organismen die fermentatie uitvoeren, fermentoren genoemd, produceren tijdens de glycolyse maximaal twee ATP-moleculen per glucose. Tabel 1 vergelijkt de uiteindelijke elektronenacceptoren en methoden van ATP-synthese in aërobe respiratie, anaërobe respiratie, en fermentatie. Merk op dat het getoonde aantal ATP-moleculen voor glycolyse uitgaat van de Embden-Meyerhof-Parnas-route. Het aantal ATP-moleculen gemaakt door fosforylering op substraatniveau (SLP) versus oxidatieve fosforylering (OP) zijn aangegeven.

Microbiële fermentatieprocessen zijn door de mens gemanipuleerd en worden uitgebreid gebruikt bij de productie van diverse voedingsmiddelen en andere commerciële producten, waaronder farmaceutische producten. Microbiële fermentatie kan ook nuttig zijn voor het identificeren van microben voor diagnostische doeleinden.

Fermentatie door sommige bacteriën, zoals die in yoghurt en andere verzuurde voedingsproducten, en door dieren in spieren tijdens zuurstofgebrek, is melkzuurfermentatie. De chemische reactie van melkzuurgisting is als volgt:

Tekst{Pyruvaat + NADH}

Bacteriën van verschillende grampositieve geslachten, waaronder Lactobacillus, Leuconostoc, en Streptococcus, staan gezamenlijk bekend als de melkzuurbacteriën (LAB), en verschillende stammen zijn belangrijk in de voedselproductie. Bij de productie van yoghurt en kaas worden de eiwitten in de melk gedenatureerd door het zeer zure milieu dat ontstaat bij melkzuurfermentatie, waardoor de melk hard wordt. Wanneer melkzuur het enige gistingsproduct is, spreekt men van homolactische fermentatie; dit is het geval voor Lactobacillus delbrueckii en S. thermophiles die bij de yoghurtproductie worden gebruikt. Veel bacteriën voeren echter heterolactische fermentatie uit, waarbij een mengsel van melkzuur, ethanol en/of azijnzuur wordt geproduceerd, en CO2 als resultaat, vanwege hun gebruik van de vertakte pentosefosfaatroute in plaats van de EMP-baan voor glycolyse. Een belangrijke heterolactische fermentor is Leuconostoc mesenteroides, die wordt gebruikt voor het zuur maken van groenten zoals komkommers en kool, waarbij respectievelijk augurken en zuurkool worden geproduceerd.

Melkzuurbacteriën zijn ook medisch van belang. De productie van lage pH-omgevingen in het lichaam remt de vestiging en groei van ziekteverwekkers in deze gebieden. De vaginale microbiota bestaat bijvoorbeeld voor een groot deel uit melkzuurbacteriën, maar wanneer deze bacteriën worden gereduceerd, kan gist zich vermenigvuldigen, waardoor een gistinfectie ontstaat. Bovendien zijn melkzuurbacteriën belangrijk voor de gezondheid van het maagdarmkanaal en vormen als zodanig het hoofdbestanddeel van probiotica.

Een ander bekend fermentatieproces is alcoholfermentatie, waarbij ethanol wordt geproduceerd. De fermentatiereactie van ethanol is weergegeven in figuur 1. In de eerste reactie verwijdert het enzym pyruvaat-decarboxylase een carboxylgroep uit pyruvaat, waarbij CO2-gas vrijkomt en het tweekoolstofmolecuul acetaldehyde wordt geproduceerd. De tweede reactie, gekatalyseerd door het enzym alcoholdehydrogenase, brengt een elektron van NADH over naar acetaldehyde, waarbij ethanol en NAD+ worden geproduceerd. De ethanolfermentatie van pyruvaat door de gist Saccharomyces cerevisiae wordt gebruikt bij de productie van alcoholische dranken en doet ook broodproducten rijzen door de CO2-productie. Buiten de voedingsindustrie is ethanolfermentatie van plantaardige producten belangrijk bij de productie van biobrandstoffen.

Figuur 1. De chemische reacties van alcoholfermentatie zijn hier weergegeven. Ethanolfermentatie is belangrijk bij de productie van alcoholische dranken en brood.

Naast melkzuurfermentatie en alcoholfermentatie komen bij prokaryoten nog vele andere fermentatiemethoden voor, die alle tot doel hebben te zorgen voor een toereikende toevoer van NAD+ voor de glycolyse (tabel 2). Zonder deze routes zou glycolyse niet plaatsvinden en zou geen ATP worden geoogst uit de afbraak van glucose. Opgemerkt moet worden dat de meeste vormen van fermentatie naast homolactische fermentatie gas produceren, gewoonlijk CO2 en/of waterstofgas. Veel van deze verschillende soorten fermentatiewegen worden ook gebruikt in de voedselproductie en elk resulteert in de productie van verschillende organische zuren, die bijdragen tot de unieke smaak van een bepaald gefermenteerd voedselproduct. Het propionzuur geproduceerd tijdens propionzuurfermentatie draagt bij tot de kenmerkende smaak van Zwitserse kaas, bijvoorbeeld.

Een aantal fermentatieproducten zijn commercieel belangrijk buiten de voedingsindustrie. Bijvoorbeeld, chemische oplosmiddelen zoals aceton en butanol worden geproduceerd tijdens aceton-butanol-ethanol fermentatie. Complexe organische farmaceutische verbindingen die worden gebruikt in antibiotica (b.v. penicilline), vaccins en vitaminen worden geproduceerd via mengzuurfermentatie. Fermentatieproducten worden in het laboratorium gebruikt om verschillende bacteriën te onderscheiden voor diagnostische doeleinden. Zo zijn darmbacteriën bekend om hun vermogen om mengzuurfermentatie uit te voeren, waardoor de pH daalt, wat kan worden gedetecteerd met een pH-indicator. Ook de bacteriële productie van acetoïne tijdens butaandiolfermentatie kan worden opgespoord. De gasproductie bij fermentatie kan ook worden waargenomen in een omgekeerde Durham-buis die het geproduceerde gas in een bouilloncultuur opvangt.

Microben kunnen ook worden gedifferentieerd naar de substraten die zij kunnen fermenteren. Bijvoorbeeld, E. coli kan lactose fermenteren en daarbij gas vormen, terwijl sommige van zijn naaste gramnegatieve verwanten dat niet kunnen. Het vermogen om de suikeralcohol sorbitol te fermenteren wordt gebruikt om de pathogene enterohemorragische O157:H7-stam van E. coli te identificeren, omdat deze, in tegenstelling tot andere E. coli-stammen, niet in staat is sorbitol te fermenteren. Tenslotte onderscheidt mannitolfermentatie de mannitol-fermenterende Staphylococcus aureus van andere niet-mannitol-fermenterende Staphylococcen.

Bacteriën identificeren met behulp van API-testpanels

Identificatie van een microbieel isolaat is essentieel voor de juiste diagnose en de juiste behandeling van patiënten. Wetenschappers hebben technieken ontwikkeld om bacteriën aan de hand van hun biochemische kenmerken te identificeren. Gewoonlijk onderzoeken zij het gebruik van specifieke koolstofbronnen als substraat voor fermentatie of andere metabolische reacties, of zij identificeren fermentatieproducten of specifieke enzymen die in reacties aanwezig zijn. In het verleden gebruikten microbiologen afzonderlijke reageerbuisjes en platen om biochemische tests uit te voeren. Wetenschappers, met name in klinische laboratoria, maken nu echter vaker gebruik van plastic, wegwerpbare, multitest-panels die een aantal miniatuurreactiebuisjes bevatten, elk doorgaans voorzien van een specifiek substraat en een pH-indicator. Na inoculatie van het testpanel met een klein monster van de microbe in kwestie en incubatie kunnen wetenschappers de resultaten vergelijken met een database die de verwachte resultaten voor specifieke biochemische reacties voor bekende microben bevat, waardoor een snelle identificatie van een monstermicrobe mogelijk wordt. Deze testpanels hebben wetenschappers in staat gesteld de kosten te verlagen en tegelijkertijd de efficiëntie en reproduceerbaarheid te verbeteren door een groter aantal tests tegelijk uit te voeren.

Veel commerciële, geminiaturiseerde biochemische testpanels bestrijken een aantal klinisch belangrijke groepen van bacteriën en gisten. Een van de vroegste en populairste testpanels is het Analytical Profile Index (API)-panel, dat in de jaren zeventig is uitgevonden. Zodra een bepaalde stam in een laboratorium aan een aantal basiskarakteristieken is onderworpen, zoals de bepaling van de Gram-morfologie van de stam, kan een geschikte teststrip worden gebruikt die 10 tot 20 verschillende biochemische tests bevat voor het onderscheiden van stammen binnen die microbiële groep. Momenteel kunnen de verschillende API-strips worden gebruikt om snel en gemakkelijk meer dan 600 soorten bacteriën, zowel aerobe als anaerobe, en ongeveer 100 verschillende soorten gisten te identificeren. Op basis van de kleuren van de reacties bij aanwezigheid van metabolische eindproducten, als gevolg van de aanwezigheid van pH-indicatoren, wordt uit de resultaten een metabool profiel gemaakt (figuur 2). Microbiologen kunnen vervolgens het profiel van het monster vergelijken met de database om de specifieke microbe te identificeren.

Figuur 2. De API 20NE-teststrip wordt gebruikt om specifieke stammen van gramnegatieve bacteriën buiten de Enterobacteriaceae te identificeren. Hier is een API 20NE-teststripresultaat voor Photobacterium damselae ssp. piscicida.

Clinical Focus: Alex, Part 2

Dit voorbeeld gaat verder met Alex’s verhaal dat begon in Energy Matter and Enzymes.

Veel van Alex’s symptomen komen overeen met verschillende infecties, waaronder griep en longontsteking. Echter, zijn trage reflexen samen met zijn lichtgevoeligheid en stijve nek suggereren een mogelijke betrokkenheid van het centrale zenuwstelsel, misschien duidend op meningitis. Meningitis is een infectie van de cerebrospinale vloeistof (CSF) rond de hersenen en het ruggenmerg die een ontsteking van de hersenvliezen veroorzaakt, de beschermende lagen die de hersenen bedekken. Meningitis kan worden veroorzaakt door virussen, bacteriën of schimmels. Hoewel alle vormen van meningitis ernstig zijn, is bacteriële meningitis bijzonder ernstig. Bacteriële meningitis kan door verschillende bacteriën worden veroorzaakt, maar de bacterie Neisseria meningitidis, een gramnegatieve, boonvormige diplokok, is een veel voorkomende oorzaak en leidt bij 5% tot 10% van de patiënten binnen 1 tot 2 dagen tot de dood.

Gezien de mogelijke ernst van Alex’ aandoeningen, adviseerde zijn arts zijn ouders hem naar het ziekenhuis in de Gambiaanse hoofdstad Banjul te brengen en hem daar te laten testen en behandelen voor mogelijke meningitis. Na een rit van 3 uur naar het ziekenhuis werd Alex onmiddellijk opgenomen. De artsen namen een bloedmonster en deden een lumbaalpunctie om zijn liquor te testen. Zij begonnen ook onmiddellijk met een antibioticakuur met ceftriaxon, het geneesmiddel bij uitstek voor de behandeling van meningitis veroorzaakt door N. meningitidis, zonder de resultaten van laboratoriumtests af te wachten.

• Hoe kunnen biochemische tests worden gebruikt om de identiteit van N. meningitidis te bevestigen?
• Waarom besloten Alex’ artsen antibiotica toe te dienen zonder de testresultaten af te wachten?

We komen later nog terug op Alex’ voorbeeld.

Key Concepts and Summary

• Fermentatie gebruikt een organisch molecuul als laatste elektronenacceptor om NAD+ van NADH te regenereren, zodat de glycolyse kan doorgaan.
• Bij fermentatie is geen elektronentransportsysteem betrokken, en er wordt geen ATP rechtstreeks door het fermentatieproces gemaakt. Fermentoren maken zeer weinig ATP – slechts twee ATP-moleculen per glucosemolecuul tijdens de glycolyse.
• Microbiële fermentatieprocessen zijn gebruikt voor de productie van voedingsmiddelen en geneesmiddelen, en voor de identificatie van microben.
• Tijdens melkzuurfermentatie, accepteert pyruvaat elektronen van NADH en wordt gereduceerd tot melkzuur. Microben die homolactische gisting uitvoeren, produceren alleen melkzuur als gistingsproduct; microben die heterolactische gisting uitvoeren, produceren een mengsel van melkzuur, ethanol en/of azijnzuur, en CO2.
• De productie van melkzuur door de normale microbiota voorkomt de groei van ziekteverwekkers in bepaalde lichaamsregio’s en is belangrijk voor de gezondheid van het maagdarmkanaal.
• Tijdens ethanolfermentatie wordt pyruvaat eerst gedecarboxyleerd (waarbij CO2 vrijkomt) tot acetaldehyde, dat vervolgens elektronen accepteert van NADH, waardoor acetaldehyde wordt gereduceerd tot ethanol. Ethanolfermentatie wordt gebruikt voor de productie van alcoholische dranken, voor het doen rijzen van broodproducten, en voor de productie van biobrandstoffen.
• Fermentatieproducten van trajecten (b.v. propionzuurfermentatie) geven kenmerkende smaken aan voedingsmiddelen. Fermentatie wordt gebruikt om chemische oplosmiddelen (aceton-butanol-ethanol fermentatie) en farmaceutische producten (gemengd zuur fermentatie) te produceren.
• Specifieke soorten microben kunnen worden onderscheiden door hun fermentatie routes en producten. Microben kunnen ook worden onderscheiden naar de substraten die zij kunnen fermenteren.

Meerkeuze

Welke van de volgende is het doel van fermentatie?

1. ATP maken
2. tussenproducten van koolstofmoleculen maken voor anabolisme
3. NADH maken
4. NAD+ maken

Toon antwoord

Antwoord d. Het doel van fermentatie is om NAD+ te maken.

Welke molecule dient typisch als laatste elektronenacceptor tijdens fermentatie?

1. zuurstof
2. NAD+
3. pyruvaat
4. CO2

Toon antwoord

Antwoord c. Pyruvaat dient typisch als laatste elektronenacceptor tijdens de fermentatie.

Welk fermentatieproduct is belangrijk om brood te laten rijzen?

1. ethanol
2. CO2
3. lactylzuur
4. waterstofgas

Toon antwoord

Antwoord b. CO2 is belangrijk om brood te laten rijzen.

Welk van de volgende is geen commercieel belangrijk fermentatieproduct?

1. ethanol
2. pyruvaat
3. butanol
4. penicilline

Toon antwoord

Antwoord b. Pyruvaat is geen commercieel belangrijk gistingsproduct.

Vul in de blanco

De microbe die verantwoordelijk is voor de fermentatie van ethanol met het oog op de productie van alcoholische dranken is ________.

Toon antwoord

De microbe die verantwoordelijk is voor de fermentatie van ethanol met het oog op de productie van alcoholische dranken is gist (Saccharomyces cerevisiae).

________ resulteert in de productie van een mengsel van gistingsproducten, waaronder melkzuur, ethanol en/of azijnzuur, en CO2.

Toon antwoord

Heterolactische gisting resulteert in de productie van een mengsel van gistingsproducten, waaronder melkzuur, ethanol en/of azijnzuur, en CO2.

Gistende organismen maken ATP door het proces van ________.

Toon antwoord

Gistende organismen maken ATP door het proces van glycolyse.

Koppeling

Plaats het fermentatieproces bij het juiste commerciële product dat ermee wordt gemaakt:

___aceton-butanol-ethanol fermentatie	a. brood
___alcoholfermentatie	b. farmaceutisch
___lactzuurfermentatie	c. Zwitserse kaas
___mengselzuurfermentatie	d. yoghurt
___propionzuurfermentatie	e. industriële oplosmiddelen

Toon antwoord

1. Industriële oplosmiddelen worden geproduceerd door aceton-butanol-ethanol fermentatie.
2. Brood wordt geproduceerd door alcohol fermentatie.
3. Yoghurt wordt geproduceerd door melkzuurfermentatie.
4. Pharmaceutische producten worden geproduceerd door mengzuurfermentatie.
5. Zwitserse kaas wordt geproduceerd door propionzuurfermentatie.

Think about It

1. Waarom zijn sommige microben, waaronder Streptococcus spp., niet in staat aërobe ademhaling uit te voeren, zelfs niet in aanwezigheid van zuurstof?
2. Hoe kan fermentatie worden gebruikt om verschillende soorten microben te onderscheiden?
3. De bacterie E. coli is in staat tot aërobe ademhaling, anaërobe ademhaling, en fermentatie. Wanneer zou het elk proces uitvoeren en waarom? Hoe wordt in elk geval ATP gemaakt?