Voorbij COX-1: de effecten van aspirine op de biologie van bloedplaatjes en mogelijke mechanismen van chemopreventie

Plaatjes spelen een cruciale rol in hemostase, trombose en het behoud van de integriteit van bloedvaten. Onvoldoende regulering van de activiteit van bloedplaatjes kan leiden tot ongepaste bloedingen, terwijl overmatige activiteit leidt tot trombose en acute ischemische gebeurtenissen. Het stollingsproces wordt gereguleerd door glycoproteïnen op het membraanoppervlak en receptoren die de stollingscascade in gang zetten na binding door exogene effectoren zoals adenosinedifosfaat (ADP), tromboxaan A2 (TXA2), serotonine, collageen, trombine en epinefrine. De basissequentie van de aggregatie van bloedplaatjes verloopt in drie stappen: initiatie, extensie en stabilisatie. In het initiatiestadium raken bloedplaatjes gebonden aan blootgestelde von Willebrand factor (vWF)/collageencomplexen en blijven zij lang genoeg op de plaats van het vasculaire letsel en de respons om verdere activering door collageen te veroorzaken. Versterking wordt gekenmerkt door een tweede golf van secretie en aggregatie, die nog wordt versterkt door het vrijkomen van trombine, adenosinedifosfaat (ADP) en thromboxaan A2 (TXA2) door de bloedplaatjes. De tweede golf markeert ook de uitbreidingsfase waarin nieuw arriverende bloedplaatjes zich vasthechten aan de initiële bloedplaatjesmonolaag. Na de interactie tussen eiwitreceptor en -effector blijven geactiveerde bloedplaatjes aggregeren en bruggen vormen tussen oppervlakteglycoproteïnen, fibrinogeen, fibrine, en vWF naar geactiveerde glycoproteïnen. Deze stabilisatiefase omvat de daaropvolgende signaleringsgebeurtenissen in de vorming van trombocytenpluggen die consolidatie van het trombocytenaggregaat mogelijk maken om dispersie door schuifkrachten in het circulerende bloed te voorkomen.

Signalering in trombocytenaggregatie begint met de activering van de receptoren op het trombocytenoppervlak door agonisten zoals collageen, trombine, ADP, TXA2, en epinefrine. Activering van deze GPCR-receptoren leidt tot de activering van fosfolipase A2, dat fosfotidylcholine en andere membraanfosfolipiden splitst, waarbij arachidonaat vrijkomt uit de C2-positie van de glycerolruggengraat. Arachidonaat kan worden omgezet in een verscheidenheid van prostaglandines (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2α,) die de ontstekingsbevorderende reactie mediëren. Bovendien induceren tromboxanen, zoals TXA2, het vrijkomen, de aggregatie en de stolling van bloedplaatjes, en versterken zij de circulerende activering van de bloedplaatjes. Prostaglandine endoperoxide synthase-1 (PGSH-1)/cyclooxygenase-1 (COX-1) voert de initiële cyclooxygenase- en peroxidase-reacties uit om arachidonzuur om te zetten in de precursormetabolieten prostaglandine G2 en prostaglandine H2. Deze worden chemisch verwerkt tot andere prostaglandines, waaronder TXA2, dat het grootste deel van de door de bloedplaatjes veroorzaakte respons bewerkstelligt. Een overzicht van de signaleringsgebeurtenissen die tijdens de activering van de bloedplaatjes plaatsvinden, is te zien in fig. 3.

Aspirine moduleert de activiteit van bloedplaatjes en de biologie – remming van cyclo-oxygenase

Aspirine remt de aggregatie van bloedplaatjes en de afgifte van prostaglandine . Vroege studies met behulp van aspirine radioactief gelabeld met 14C op de acetaat carbonyl koolstof toonden <0,1% van de 14C radiolabel werd opgenomen door bloedplaatjes en dat de activiteit werd geassocieerd voornamelijk met drie eiwitten . Hoewel de associatie onomkeerbaar was, wat wijst op de vorming van een covalente binding, bleek zij alleen verzadigbaar bij biologisch relevante concentraties voor één enkel 85 kDa-eiwit. De andere twee oplosbare bloedplaatjes-eiwitten vertoonden een niet-verzadigbare acetylering, wat suggereert dat aspirine-afhankelijke acetylering in bloedplaatjes zowel specifiek als niet-specifiek is. Het geacetyleerde 85 kDa enzym bleek later prostaglandine endoperoxide synthase-1 (PTGS-1/COX-1) te zijn. De remming van bloedplaatjes-COX-1 door acetyltransfer is onomkeerbaar, en de remming blijft gehandhaafd gedurende het 10-daagse leven van het bloedplaatje.

COX-1 is een bifunctioneel enzym dat in de meeste weefsels constitutief tot expressie komt, en dat twee verschillende en opeenvolgende reacties uitvoert op ruimtelijk verschillende, maar mechanistisch gekoppelde actieve sites. In normale cellen is COX-1 membraangebonden en ingebed in het luminale oppervlak van het endoplasmatisch reticulum en in het binnen- en buitenoppervlak van de nucleaire enveloppe. Bloedplaatjes zijn echter anucleaire celfragmenten en brengen in plaats daarvan COX-1 eiwitten tot expressie in het dichte buisvormige membraanstelsel dat ontstaat uit het demarcate membraanstelsel tijdens de biogenese van de bloedplaatjes. Dit dichte buisvormige membraanstelsel speelt een belangrijke rol bij de activering van bloedplaatjes, en is de voornaamste plaats voor de synthese van eicosanoïden in bloedplaatjes. Het 85 kDa COX-1 homodimeer bevat 576 residuen en het is geglycosyleerd aan verschillende lysine zijketens. Hoewel COX-1 een van de weinige eiwitten is die in verband is gebracht met remming door aspirine op zijn actieve plaats, is het belangrijk op te merken dat glycosylering van lysineresiduen de acetylering van andere residuen versterkt, en in dit geval het serine op de actieve plaats van COX-1 . Elke structurele subeenheid van COX-1 omvat drie vouwdomeinen: een epidermale groeifactor-domein, een membraan-bindend domein, en een katalytisch actief gebied. Het katalytische domein bevat een cyclo-oxygenase-locatie die zorgt voor de di-oxygenering van arachidonzuur om een hydroxyl-endoperoxide prostaglandine G2 (PGG2) te vormen, terwijl de aangrenzende peroxidase-locatie zorgt voor de reductie van PGG2 tot PGH2. Tegenover het membraan-actieve domein, binnen het katalytische domein, bevindt zich de actieve plaats van het peroxidase, dat een heemcofactor heeft die gebonden is aan een ondiepe spleet. De heemgroep is essentieel voor de activering van een tyrosylradicaal in de actieve plaats van het cyclo-oxygenase voor de lipide-peroxidatie van arachidonzuur. Tegenover de heem-bindende peroxidase plaats aan de top van een tunnel die in het membraan-bindende domein begint, bevindt zich de cyclo-oxygenase actieve plaats. Arachidonzuur bindt aan deze plaats, waardoor het carboxylaat van het substraat wordt verplaatst voor di-oxygenering. Structurele studies van schaap COX-1 behandeld met 2-broomacetoxybenzoëzuur suggereren dat de binding van arachidonzuur aan het cyclooxygenase-uiteinde van de actieve site, en dientengevolge de dubbele oxygenatie van arachidonzuur, worden geremd als gevolg van acetylering van serine 530.

Ireversibele remming van COX-1 door acetylering door aspirine van de actieve site serine vermindert dramatisch prostaglandine biosynthese. In bloedplaatjes kan COX-1 niet snel geregenereerd worden, en bijgevolg kan de COX-1 activiteit enkel hersteld worden door nieuwe bloedplaatjesbiogenese. De synthese van thromboxaan A2, prostaglandine E2 en prostacycline (PGI2) is het sterkst aangetast in met aspirine behandelde bloedplaatjes, hetgeen resulteert in een tekortkoming in het stollingsmechanisme, verminderde afscheiding van maagslijmvlies, verhoogde irritatie door maagzuur, alsmede veranderde pathofysiologische stolling, en vasodilatatie/constrictie.

COX-2 is op aminozuurniveau voor 60% identiek aan COX-1 en hun driedimensionale structuren zijn vrijwel superimposabel. COX-2 is induceerbaar en de expressie ervan wordt versterkt door dezelfde prostaglandinen die door COX-1 in bloedplaatjes en epitheelcellen worden gesynthetiseerd. COX-2 komt tot overexpressie tijdens de megakaryocytopoëse en is geïdentificeerd in de dwarsdoorsnede van beenmergmonsters van patiënten met chronische myeloïde leukemie en polycythemia vera. In een andere studie werd het expressieniveau van COX-2 in bloedplaatjes gekarakteriseerd in relatie tot COX-1, door het mRNA-niveau rechtstreeks te meten. Er werd vastgesteld dat bloedplaatjes COX-2 tot expressie brengen op niveaus die vergelijkbaar zijn met die van sommige kwaadaardige epitheelcellen, zij het op aanzienlijk lagere niveaus dan COX-1 in bloedplaatjes. Acetylering van COX-2 in endotheliale en epitheliale cellen remt de biosynthese van PGI2 en PGE2, die verschillende effecten hebben op downstream processen, zoals ontsteking. Hoewel door aspirine gemedieerde remming van COX-1 en COX-2 resulteert in verschillende profielen van remming van de prostaglandine biosynthese, is de basis voor remming in beide gevallen de blokkade van prostaglandine endoperoxide synthase en de daaruit voortvloeiende verlaging van de multifunctionele prostaglandine H2 niveaus. De rol van COX-3 in de context van de bloedplaatjesbiologie blijft onbekend.

De COX-remmende activiteit van aspirine is afhankelijk van de toegediende dosis. Lage doses, variërend van 75 tot 300 mg, resulteren in selectieve remming van de productie van TXA2 door bloedplaatjes zonder onderdrukking van prostacycline (PGI2), een gebruikelijke antagonist van bloedplaatjes en vaatverwijdend middel. PGI2 wordt naar verwachting voornamelijk afgeleid van vasculair COX-2, wat suggereert dat COX-2 remming minimaal is in het lage doseringsregime. Hogere doses (>1200 mg) hebben analgetische en ontstekingsremmende eigenschappen, eigenschappen die in verband worden gebracht met de pathofysiologische remming van COX-1 en COX-2. Het is belangrijk op te merken dat COX-2 ook arachidonzuur kan gebruiken voor de synthese van lipoxinen, met name 15-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-HETE). Deze biosynthetische route zal naar verwachting intact blijven, zelfs na acetylering van COX-2 . Deze differentiële remming van COX-activiteiten kan gedeeltelijk worden verklaard door de relatieve remmende kracht van aspirine. Hoewel aspirine doorgaans wordt gezien als een niet-specifieke COX-remmer, is het zeer selectief voor COX-1 versus COX-2. Zoals in Blanco e.a. wordt aangetoond, bedraagt de IC50 van aspirine voor COX-1 ongeveer 3,5 μM, terwijl de IC50 voor COX-2 ongeveer 30 μM bedraagt. Hoewel de met aspirine reactieve actieve sites van beide enzymen homoloog zijn, resulteert acetylering van Ser-516 van COX-2 slechts in gedeeltelijke remming van de katalytische activiteit. Gezien de bereikbare serumconcentratie bij lage doses (~7 μM) is het onwaarschijnlijk dat COX-2 voor meer dan 5% geacetyleerd is, terwijl van bloedplaatjes afkomstig COX-1 waarschijnlijk voor >70% geacetyleerd is. Dit suggereert dat regelmatige lage-dosis aspirine steevast de remming van COX-1 in circulerende bloedplaatjes zal handhaven, met een minimaal effect op de remming van perifeer COX-2. Een overzicht van de effecten van lage- en hoge-dosis aspirine op de COX-activiteit in bloed en weefsel is weergegeven in tabel 1.

Aspirine-afhankelijke acetylering van bloedplaatjes-interagerende eiwitten in het bloed

Plaatjes brengen een verscheidenheid aan oppervlakte-receptoren tot expressie die hen in staat stellen te interageren met plasma- en bloedproteïnen, pathogenen, pathogeen-gerelateerde producten, en het ontstoken endotheel. Oppervlakte-receptoren zijn van cruciaal belang voor de adhesie van bloedplaatjes aan de beschadigde vasculatuur, de vorming van de stollingstrombus, en de activering via een aantal metabole effectoren. De interactie tussen bloedplaatjes en andere bloedproteïnen in de systemische circulatie is van cruciaal belang voor de uitvoering en oplossing van de stollingsreactie. Interessant is dat veel van deze eiwitten ook door aspirine worden gemodificeerd.

Fibrinogeen

Farr en medewerkers identificeerden in 1968 fibrinogeen als een doelwit van aspirine-acetylering. Fibrinogeen wordt gevonden als een oplosbaar eiwit in plasma en als een intracellulair membraan-geassocieerd eiwit in bloedplaatjes. Fibrinogeen maakt 3-10% uit van het totale eiwit van bloedplaatjes (waarvan bijna 25% in α-granules) en komt vrij bij activering van de bloedplaatjes. Fibrinogeen wordt naar verluidt in vitro en in vivo geacetyleerd door aspirine om ε-N-acetyllysinederivaten te vormen, waarbij gemiddeld drie residuen van fibrinogeen worden gemodificeerd. Geacetyleerd fibrinogeen verhoogt de gevoeligheid van fibrinestolsels voor lysis.

Albumin

Albuminemodificatie door aspirineacetylering is al meer dan een halve eeuw bekend. Een aantal studies van Farr en collega’s hebben de mogelijke conformatie-effecten beoordeeld die worden veroorzaakt door de toevoeging van de acetylgroep aan albumine. De meest besproken modificatie van serumalbumine in de literatuur richt zich op de acetylering van lysineresten . Menselijk serum albumine is ook waargenomen om bloedplaatjes-stolling mechanismen te beïnvloeden door het beïnvloeden van calcium regulatie.

Hemoglobine

Verschijnbaar de belangrijkste component van het bloed-plasma milieu, hemoglobine, ondergaat aspirine-afhankelijke acetylering in vitro, en er wordt verondersteld dat het soortgelijke wijzigingen ondergaat bij hoge aspirine doses in vivo . Onderzoek naar de acetylering van hemoglobine door aspirine heeft een afname van de proteïneglycering aangetoond, en in aanwezigheid van hoge glucoseconcentraties wordt de acetylering van hemoglobine door aspirine verhoogd , een effect dat ook is waargenomen bij serumalbumine. Aspirine is in staat een verscheidenheid van lysineresiduen in de α- en β-ketens van hemoglobine te acetyleren, zonder een effect te hebben op de structurele conformatie of de zuurstofbindende en -transporterende functies. Hemoglobine kan aggregatie van bloedplaatjes teweegbrengen via interacties met GP1βα, een van de vele receptoreiwitten aan het oppervlak van bloedplaatjes. Relatief lage concentraties van hemoglobine zijn ook in staat om bloedplaatjesaggregatie te induceren, hoewel het effect van hemoglobineacetylatie door aspirine op de interacties tussen hemoglobine en bloedplaatjes onbekend blijft .

Effect van aspirine op de bloedplaatjesaggregatie: implicaties voor kanker

Cyclooxygenase inhibitie en de gelijktijdige vermindering van thromboxaan biosynthese resulteren in verminderde bloedplaatjesaggregatie, expressie van P-selectine, en verminderde stollingsfunctie. Naast de rol die aspirine speelt bij de modulatie van de aggregatie van bloedplaatjes, is ook aangetoond dat aspirine het profiel van tot expressie gebrachte en gesecreteerde eiwitten in bloedplaatjes verandert. Veel van deze eiwitten zijn betrokken bij het mediëren van de stollingsreactie en het rekruteren van immuuncellen op de plaats van het letsel. Veel van de eiwitten in het “releasaat” van bloedplaatjes kunnen echter ook een belangrijke rol spelen bij het bevorderen van angiogenese en tumorgroei.

Van aspirine is aangetoond dat het de afgifte van interleukine 7 (IL-7) remt door bloedplaatjes die zijn gestimuleerd met trombinereceptor-activerend peptide (SFLLRN). Gezonde patiënten die aspirine gebruikten vertoonden ook een significant lager plasma IL-7 . Van dit ontstekingsbevorderende cytokine is aangetoond dat het een sleutelrol speelt bij zowel de rijping van B-cellen als T-cellen. Van IL-7 is ook aangetoond dat het zowel pro- als anti-tumor effecten heeft, waarbij de laatste voornamelijk het gevolg zijn van remming van apoptose door regulatie van BCL2 . Bloedplaatjes zijn ook een bron van pro-angiogene factoren, waaronder VEGF en angiopoetine-1, en er zijn aanwijzingen dat regelmatig gebruik van aspirine de plasmaconcentratie van beide factoren verlaagt, hoewel het onduidelijk is of dit louter een functie is van het vrijkomen van bloedplaatjes. Dit wordt ondersteund door een klinische studie waarin aspirinetherapie een algemeen anti-iangiogeen evenwicht leek te bevorderen bij vrouwen met borstkanker die tamoxifen kregen, zoals beoordeeld door dalende plasma VEGF niveaus en trombinereceptor gemedieerde afgifte van TSP-1 en VEGF uit bloedplaatjes.

Coppinger et al. voerden een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische studie uit om de samenstelling van het bloedplaatjes releasaat verder te onderzoeken als functie van aspirinebehandeling. In deze studie resulteerde de behandeling van menselijke bloedplaatjes met een lage dosis aspirine (20 μM) na stimulatie door collageen, SFLLRN, of ADP in een brede daling van de hoeveelheid eiwit in het releasaat, hoewel de mate van deze vermindering afhankelijk was van de gebruikte agonist. Aspirinebehandeling bleek ook te resulteren in verlaagde niveaus van groeiregulerende groeifactor (GRO), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), angiogenine, RANTES, en oncostatine M (OSM) in het bloedplaatjes releasaat, vooral na stimulatie met collageen. Terwijl deze, en andere van bloedplaatjes afgeleide cytokinen (bv, CXCL4 en CTGF ), van cruciaal belang zijn voor het reguleren van vasculair herstel, spelen zij ook een rol in het aanjagen van tumorigenese, angiogenese en metastase.

Definiëring van het aspirine acetyloom

Zoals hierboven vermeld, is van aspirine bekend dat het een grote verscheidenheid van intracellulaire en extracellulaire eiwit targets acetyleert, met name aan zijketen en N-terminale aminogroepen. Helaas zijn er geen uitgebreide proteomische studies verricht die specifiek ingaan op de vraag welke bloedplaatjes-eiwitten, naast de COX enzymen, worden geacetyleerd door aspirine of op de biologische rol van deze niet-canonieke acetyleringen. In deze paragraaf zullen we eerdere proteomische studies naar niet-kanonieke doelen van aspirine-gemedieerde acetylering beschouwen en proberen deze in verband te brengen met de huidige stand van zaken op het gebied van proteomics van bloedplaatjes.

Er zijn talrijke proteomische studies geweest die hebben geprobeerd de reeks eiwitten te definiëren die door fysiologische concentraties aspirine in verschillende cellijnen worden geacetyleerd. Bhat en medewerkers identificeerden 33 cellulaire eiwitten die geacetyleerd zijn door aspirine na verrijking met een anti-acetyl lysine antilichaam. Latere analyse door massaspectrometrie identificeerde de aanwezigheid van geacetyleerde cytoskelet en metabolische enzymen, waaronder glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD), lactaat dehydrogenase, enolase, pyruvaat kinase, en transketolase, hoewel alleen G6PD significant werd geremd door aspirine-gemedieerde acetylering in vitro. Dit suggereert dat aspirine de stroom door de pentosefosfaatroute kan blokkeren, hoewel aanvullend onderzoek nodig is om dit te bevestigen. Deze groep heeft ook aangetoond dat aspirine p53 acetyleert, hetgeen resulteert in een verhoogde DNA-binding, expressie van p21Cip, en verhoging van de apoptotische celdood in aanwezigheid van camptothecine. Hoewel deze effecten zijn aangetoond in meerdere tumor cellijnen, suggereert de afwezigheid van p53 in het bloedplaatjes proteoom en het ontbreken van een functioneel genoom in bloedplaatjes dat p53 acetylering minimale invloed zal hebben op de bloedplaatjes biologie.

Meer recente vooruitgang in high-throughput proteomics gekoppeld aan activiteit-gebaseerde probes hebben geleid tot de identificatie van honderden vermeende aspirine-gemedieerde acetyleringen. In één benadering werd de acetylgroep van aspirine vervangen door pentynoëzuur om een alkyne-bevattend aspirinederivaat (AspAlk) te genereren. In tegenstelling tot aspirine resulteert de acetyltransfer door AspAlk in de incorporatie van een azide-reactief alkyne op plaatsen die normaal door aspirine geacetyleerd worden. Na incubatie van AspAlk met levende colorectale HCT-15 cellen werden de door AspAlk geacetyleerde eiwitten gemerkt met biotine via de koper-gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie (CuAAC) en geïsoleerd door streptavidine pulldown. Na analyse met LC-MS waren de auteurs in staat om 120 eiwitten te identificeren met een significante verrijking van AspAlk acetylering ten opzichte van DMSO controles. De meest verrijkte klassen van eiwitten in deze studie waren die welke betrokken zijn bij eiwitsynthese en -vouwing, cytoskelet-eiwitten, en metabole enzymen. Histon acetylatie werd ook waargenomen en biochemisch bevestigd. Dit werk werd uitgebreid in een recent manuscript door Shen, Lin, en medewerkers die gebruik maakten van een zuur-labile biotine azide te vergemakkelijken ophalen van AspAlk-gemodificeerde eiwitten na biotine conjugatie en streptavidine pulldown . Deze strategie resulteerde in de identificatie van meer dan 500 geacetyleerde eiwitten. Pathway-analyse van de target-lijst toonde significante acetylering binnen de mTOR pathway die vele belangrijke cellulaire functies controleert, waaronder eiwitsynthese en autofagie. De auteurs valideerden de initiële proteomische observaties door aan te tonen dat aspirine behandeling van zowel HCT116 colorectale cellen als muis embryonale fibroblasten de de novo eiwitsynthese verminderde en autofagie induceerde. De inductie van autofagie door aspirine is van bijzonder belang in het licht van een recente studie waaruit blijkt dat autofagie essentieel is voor de normale functie van bloedplaatjes en dat autofagie wordt gestimuleerd tijdens stimulatie van bloedplaatjes. Bovendien is een functionele autofagie-machine essentieel voor de anti-coagulant activiteit van bloedplaatjes, zoals aangetoond in muismodellen waarin het Atg7 van bloedplaatjes is uitgeschakeld. Hoewel de functionele relatie tussen aspirine-gemedieerde acetylatie en inductie van autofagie door bloedplaatjes onduidelijk blijft, kan remming van de pentose fosfaat route (PPP) door G6PD blokkade of verstoring van de mitochondriale ademhaling door acetylatie van malaat dehydrogenase en/of isocitraat dehydrogenase de intracellulaire oxidatieve belasting verhogen, een bekende trigger voor autofagie. Als alternatief is er ruim bewijs voor aspirine-gemedieerde acetylering van chaperones, met name heat shock eiwitten en peptidyl-prolyl isomerases die de juiste eiwit-vouwing kunnen belemmeren en autofagische verwijdering van verkeerd gevouwen eiwitten kunnen triggeren.

Een andere recente proteomische studie door Tatham en medewerkers gebruikte 3H-gelabelde aspirine om plaatsen van aspirine-gemedieerde acetylering in HeLa cellen te identificeren door massaspectrometrie . In deze benadering resulteert het gebruik van getritityleerde aspirine in een +3 Da massaverschuiving ten opzichte van normaal acetaat en maakt een nauwkeuriger onderscheid mogelijk tussen door aspirine gemedieerde acetylering en endogene acetylering. Deze aanpak onthulde meer dan 12.000 door aspirine gemedieerde acetyleringen in meer dan 3700 unieke eiwitten. Interessant is dat veel van de door aspirine geacetyleerde eiwitten ook geacetyleerd bleken te zijn in afwezigheid van aspirine, wat suggereert dat aspirine bestaande acetylatieplaatsen van eiwitten “versterkt”. De auteurs van deze studie vonden ook dat in de meeste gevallen <1% van de totale plaatsen beschikbaar voor acetylatie op een bepaald eiwit werden geacetyleerd door aspirine, wat impliceert dat de stoichiometrie van niet-specifieke aspirine-gemedieerde acetylatie onvoldoende kan zijn om significante biologische effecten te produceren zonder farmacologische blokkade van endogene deacetylase activiteiten.

Deze studie toonde ook significante acetylering van histon-eiwitten aan, waarbij het merendeel van de door aspirine gemedieerde acetylering plaatsvond in de histon-kern en niet in de N-terminale staarten. Histonacetylering is waargenomen in meerdere proteomische studies en is niet verwonderlijk gezien het hoge percentage nucleofiele lysineresiduen in histon-eiwitten die een belangrijke rol spelen bij de elektrostatische DNA-binding. Histonacetylering speelt een cruciale rol bij DNA-binding en is een bekend epigenetisch mechanisme voor de regulering van genexpressie. Hoewel bloedplaatjes anucleate zijn, hebben eerdere transcriptomische studies geïdentificeerd histon-specifieke transcripten in bloedplaatjes, met name H2A, H2B, H3, en H4 . Hoewel histon-acetylering door aspirine overtuigend is aangetoond, is het belangrijk op te merken dat histon-expressie in bloedplaatjes niet is bevestigd. In plaats daarvan is verondersteld dat de aanwezigheid van histon-transcripten in bloedplaatjes een artefact is van een afwijkende celcyclus in megakaryocyten die aanleiding geven tot bloedplaatjes. Belangrijker is dat de rol van histonen in het controleren van expressie op DNA niveau afwezig is in anucleate bloedplaatjes.

Effecten van aspirine op het metabolisme van bloedplaatjes

Het metabolisme van bloedplaatjes is voornamelijk oxidatief in tegenstelling tot neutrofielen die voornamelijk glycolytisch zijn . Blokkade van anaërobe glycolyse vermindert ATP niet en remt evenmin de bloedplaatjesfunctie. Er is aangetoond dat acetylering van enzymen van de tricarbonzuurcyclus (TCA) en van componenten van de elektronentransportketen (ETC) een gebruikelijke methode van regulering is, in het bijzonder voor enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme, zoals malaatdehydrogenase in het koolstofmetabolisme, de regulering van het vetmetabolisme, en in de ureumcyclus voor de ontgifting van ammoniak. Hieruit volgt dat acetylatie van TCA-cyclus enzymen en ETC-componenten een belangrijk effect kan hebben op de bio-energetica van bloedplaatjes. Proteomische studies van aspirine acetylatie hebben consequent onthuld aspirine-gemedieerde acetylatie van malaat dehydrogenase, die de omschakeling regelt tussen koolhydraat en vetzuur synthese , en isocitraat dehydrogenase, die wordt gereguleerd in de mitochondria door deacetylatie via sirtuin (Sirt3 en Sirt5) eiwitten . Sirtuin deacetylase activiteit is geassocieerd met een aantal TCA enzymen in de mitochondriale matrix en wordt verondersteld de antioxidant regeneratie, TCA flux regulatie, en anapleurose te reguleren . Hoewel we bij het opstellen en drukken van dit overzicht niet op de hoogte zijn van studies die rechtstreeks ingaan op de mate van aspirine-gemedieerde acetylering van metabole enzymen of het effect van aspirine op metabole flux, suggereert het proteomische bewijs dat dit een belangrijk niet-canoniek effect van aspirine op de biochemie van bloedplaatjes kan zijn.

Effecten van aspirine op de lokalisatie van bloedplaatjes in tumoren

Nieuw bewijs komt naar voren dat bloedplaatjes zelf een belangrijke rol kunnen spelen in carcinogenese en meer in het bijzonder in de ontwikkeling van metastase. In metastatische muismodellen waar tumorcellen direct in de circulatie worden geïnjecteerd, zijn strategieën om het aantal circulerende bloedplaatjes te verminderen effectief gebleken in het verminderen van de tumorlast. Andere studies in metastatische modellen waarbij oplosbare fibrine en tumorcellen samen werden geïnjecteerd om het stollingseffect te versterken, toonden aan dat de incidentie van metastase in vivo toenam. Deze studies werden ondersteund door in vitro experimenten waar oplosbare fibrine de interacties tussen bloedplaatjes en tumorcellen in kweekomstandigheden versterkte. Deze studies ondersteunen de hypothese dat de activering van de aggregatie van bloedplaatjes, naast de verwachte toename van fibrine, de adhesie van bloedplaatjes aan tumorcellen verhoogt en de metastatische verspreiding vergemakkelijkt. Naast fibrine hebben aanvullende studies de rol van trombine, PAR-1, en stollingsfactor VII (FVII) beschouwd, en hun associatie met verhoging van de levensvatbaarheid van kankercellen, de groei en verspreiding van kanker, verhoogde kwaadaardigheid van de tumor, en metastatische ondersteuning .

Naast het moduleren van de biologie van tumorcellen in de systemische circulatie, is ook aangetoond dat bloedplaatjes een belangrijke rol spelen bij de groei van tumorcellen. In één studie werd aangetoond dat aspirine de mate van proliferatie van eierstokkanker zowel in vitro als in vivo aanzienlijk verminderde. In dezelfde studie werd ook vastgesteld dat de activering van bloedplaatjes de proliferatie en de groei van tumorcellen kan doen toenemen na co-incubatie van tumorcellen en bloedplaatjes. Inhibitie van de adhesieve receptoren van bloedplaatjes, waaronder GPIβα, GPIIβIIIα en P-selectine, verminderde de proliferatieve effecten van bloedplaatjes echter niet. Dit suggereert dat door bloedplaatjes afgescheiden eiwitten en andere factoren een rol kunnen spelen bij het reguleren van tumorcelgroei. Zo werd bijvoorbeeld vastgesteld dat de vermindering van TGF-β1 van bloedplaatjes de proliferatie verminderde van eierstokkankercellen die aan bloedplaatjes werden blootgesteld. Verder is ook aangetoond dat aspirine uitzaaiing van colorectale kanker voorkomt via een COX-1 mechanisme waarbij TXA2 en PGE2 betrokken zijn, hetgeen suggereert dat geactiveerde bloedplaatjes uitzaaiing kunnen ondersteunen via COX-1 afhankelijke prostaglandine productie. Tenslotte is aangetoond dat een nieuw aspirine-fosfotidylcholineconjugaat (Aspirine-PC) de door bloedplaatjes en tumorcellen geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) verstoort via VEGF en thromboxaanafgifte. Deze formulering bleek ook de celproliferatie en angiogenese te remmen en tegelijkertijd de apoptose te verhogen in ovarium- en colorectale kankercelmodellen .