Onze klanten bij Biotage hebben interessante en diverse achtergronden, van zeer bekwame synthetisch scheikundigen, tot deskundigen op het gebied van de chemie van natuurlijke producten, tot mensen die nog maar net zijn begonnen met scheikunde. Wat ik in de loop van mijn meer dan 40-jarige carrière in de “kunst” van de chromatografie heb geleerd, is dat er bij veel van deze fijne mensen een gebrek aan begrip is van de chromatografische principes. Dit gebrek aan inzicht is, denk ik, alleen te wijten aan hun kerncurriculum, waarin scheidingswetenschap wordt gebruikt als een hulpmiddel tijdens laboratoriumwerk, maar de principes achter waarom de componenten van een mengsel scheiden (of niet scheiden) misschien niet effectief worden uitgelegd, begrepen, of bestudeerd.
Er zijn vier basistypen chromatografie, waaronder:
- Gas-vloeistofchromatografie (GC)
- Liquid-liquid chromatografie (LLC)
- Liquid-solid chromatografie (LSC)
- Size exclusion/gel permeation chromatography (SEC/GPC)
Voor deze post zal ik me richten op vloeistof-vaste stof chromatografie.
Cromatografie van vloeistof/vaste stof
Dit is de populairste van de bovengenoemde technieken, omdat hij bruikbaar is voor scheidingen van halfvluchtige en niet-vluchtige verbindingen. Aangezien er geen warmte nodig is om verbindingen uit een scheidingskolom te elueren (zoals bij GC), vereist vloeistof-vaste-stofchromatografie het gebruik van een oplosmiddel of een mengsel van mengbare oplosmiddelen met verschillende polariteit om de chemische bestanddelen van het monster van elkaar te scheiden.
Bij LSC wordt het monster op een vaste drager of stationaire fase geladen. De bestanddelen van het monster binden zich aan de stationaire fase, maar in verschillende mate. De mate van interactie met de stationaire fase bepaalt de scheidingssnelheid en de effectiviteit. Hoe groter dus de aantrekkingskracht op de stationaire fase, hoe langer het duurt voordat de verbindingen geëlueerd zijn. Om die sterk gebonden verbindingen te helpen elueren, moet de solventverhouding in de loop van de tijd veranderen (toenemende sterkte).
Binnen het gebied van LSC zijn verschillende chromatografische technieken…
- Papierchromatografie (PC)
- Dunnelaagchromatografie (TLC)
- High-performance vloeistofchromatografie (HPLC)
- Flitschromatografie (FC)
- Ionuitwisselingschromatografie (IX)
- Affiniteitschromatografie (AC)
- Chirale chromatografie (CC)
- Superkritische vloeistofchromatografie (SFC)
In dit bericht zal ik me richten op flitschromatografie, waarvan de principes dezelfde zijn als die van HPLC. Beide maken gebruik van kolommen gevuld met een stationaire fase waarin het monster wordt geïnjecteerd en waar het oplosmiddel doorheen wordt gepompt. Bij flashchromatografie worden echter grotere kolommen gebruikt dan bij HPLC, dat meestal een analytische scheidingstechniek is.
Flashchromatografie is een voorbereidende chromatografische techniek waarvan de kolommen ook zijn gevuld met een vaste drager of media die een grotere deeltjesgrootte hebben dan HPLC-kolommen. Door deze verschillen in media- en kolomgrootte kunnen flashkolommen meer verbindingen per gram medium zuiveren dan HPLC.
- Flashchromatografie gebruikt mediadeeltjes van 15 µm tot wel 60 µm
- HPLC gebruikt mediadeeltjes van 1,7 µm tot 10 µm
Wat er in de kolom gebeurt
De meeste flashchromatografie en HPLC worden uitgevoerd met een normale-fase- of reversed-fase-methode. De verschillen tussen deze methodologieën liggen in de stationaire fase-chemie en de oplosmiddelen die worden gebruikt om de afzonderlijke chemische componenten van een mengsel te scheiden.
- Normale-fase gebruikt apolaire en matige oplosmiddelen (b.v. hexaan en ethylacetaat) voor de mobiele fase en een polair medium (b.v. silica) als de stationaire fase.silica) als stationaire fase
- Reversed-phase is precies het tegenovergestelde, met gebruikmaking van polaire oplosmiddelen en een apolaire stationaire fase
Want deze methodologieën zijn “polaire” tegenpolen van elkaar (woordspeling bedoeld), de elutievolgorde voor de meeste verbindingen is omgekeerd. Dit is waar de chemie achter chromatografische scheidingen plaatsvindt.
Laten we ons nu concentreren op normale-fase chromatografie.
Normale-fase chromatografie
Bij normale-fase chromatografie worden de chemische verbindingen waaruit een mengsel bestaat (b.v. reactiemengsel, natuurproductextract, enz.), opgelost in een geschikt oplosmiddel en in de kolom geïnjecteerd. Wanneer het mengsel in contact komt met de polaire stationaire fase, laten we zeggen silica, concurreren de verbindingen van het mengsel en hun oplosmiddel met de mobiele fase om de bindingsplaatsen van het silica. Hoe polairder de chemische stof, hoe sterker deze wordt aangetrokken door het silica. Deze aantrekking wordt adsorptie genoemd (anders dan absorptie).
Absorptie is wat zich voordoet wanneer een spons of een papieren handdoek in contact komt met een vloeistof. Adsorptie is een combinatie van fysische en chemische interacties waarbij het polaire oppervlak van silica de chemische componenten waarmee het in contact komt chemisch bindt, meestal door verschijnselen die bekend staan als waterstofbinding en van der Walls-krachten.
Wanneer een chemische stof in contact komt met droog silica (zoals gebruikt bij een nieuwe flash-kolom), treedt adsorptie op. Bij deze interactie komt warmte vrij, wat problemen kan veroorzaken voor de stabiliteit van verbindingen en chromatografische resultaten. Daarom worden silica-kolommen meestal vooraf bevochtigd met een oplosmiddel met een lage polariteit voordat het monster wordt toegevoegd. Oplosmiddelen met een lage polariteit (b.v. hexaan, heptaan, cyclohexaan) zijn zwakke oplosmiddelen en worden niet goed door silica of andere polaire media geadsorbeerd.
De oppervlaktechemie van silica bestaat uit een mengsel van hydroxylgroepen (silanolen) en silylethers, figuur 1. Deze functionele groepen zijn polair, worden geacht negatief geladen te zijn, en adsorberen elektronarme verbindingen. De pi-clouds van aromatische verbindingen kunnen tijdens de adsorptie een waterstofbrug vormen met de hydroxylgroepen van het silica.1
Figuur 1. De chemie van chromatografisch silica bestaat uit een mengsel van silanolen en silyletherfunctionaliteiten. Deze verbindingen binden zich met chemicaliën door waterstofbinding/adsorptie.
Om te zorgen voor een goede binding (adsorptie) van de monstercomponent moet het te zuiveren monster ofwel in een zwak oplosmiddel worden opgelost en in de kolom worden geladen (laden in vloeibare vorm) of worden opgelost met een sterker (polair) oplosmiddel, worden gemengd met een inert medium (bv. silica, kiezelgoer), worden gedroogd en in een andere kolom worden geplaatst die in-line met de zuiveringskolom is geplaatst (laden in droge vorm). Droog laden elimineert veel problemen die zich voordoen bij het gebruik van een vloeibare lading, vooral met een monster dat is opgelost in een polair oplosmiddel.
Na het laden van het monster worden de mobiele fase-oplosmiddelen ingebracht. Om een scheiding te verkrijgen moeten de monstercomponenten echter met verschillende snelheden van de stationaire fase desorberen. Hoewel dit mogelijk is met een oplosmiddel met constante polariteit (isocratische elutie), is een betere zuivering meestal mogelijk met een mobiele fase die met een lage polariteit begint en de polariteit in de loop van de tijd verhoogt. Dit staat bekend als gradiëntelutie.
Bij een gradiënt desorberen de verbindingen met een hogere oplosbaarheid in het oplosmiddel met een lage polariteit (verbindingen met een lagere polariteit) het eerst en passeren ze de kolom. Naarmate de polariteit van het oplosmiddel in de mobiele fase toeneemt, desorberen de geadsorbeerde verbindingen met verschillende snelheden van de media af op basis van hun oplosbaarheid in de steeds polairder wordende mobiele fase, Figuur 2.
Figuur 2. Boven – Bij isocratische elutie (constante polariteit van de mobiele fase) desorberen verbindingen langzamer dan bij gebruik van een gradiënt (onder). Gradiënte elutie geeft meestal een betere scheiding/zuivering dan isocratische elutie.
Een interessante eigenschap van normale-fase chromatografie is dat wanneer een verbinding eenmaal desorbeert uit het medium, zij nooit meer adsorbeert omdat de steeds polairder wordende mobiele fase bij voorkeur in haar plaats adsorbeert.
Polariteitsverschillen (bindingssterkte) tussen verbindingen kunnen zo subtiel zijn als de toevoeging van een andere functionele groep, verschillen in de plaats van de functionele groep (Parida, 2006) zoals op een aromatische ring, of zo duidelijk als verbindingen met totaal verschillende structuren, Figuur 3.
Figuur 3. Scheiding van verbindingen met verschillende polariteiten op basis van het type functionele groep en de plaats op het molecuul. In volgorde van elutie – naftaleen (geen polaire functionaliteit), 1-nitronaftaleen, o-nitroaniline, m-nitroaniline, p-nitroaniline. De nitroanilines verschillen alleen in de plaats van de nitro-functiegroep ten opzichte van de amine.
Samenvattend kan dus worden gesteld dat scheidingen in normale-fase chromatografie gebaseerd zijn op verschillen in polariteit van verbindingen (zowel duidelijk als subtiel), hun aantrekkingskracht op de stationaire fase en hun oplosbaarheid in de mobiele fase. Om de beste zuiveringsresultaten te verkrijgen, wordt solvent scouting aanbevolen met behulp van TLC.
Interesseert u zich in meer informatie over flashchromatografie, download dan onze whitepaper – Succesvolle Flash Chromatography.
1. https://doi.org/10.1016/j.cis.2006.05.028
