Modifikace histonů je kovalentní posttranslační modifikace (PTM) histonových proteinů, která zahrnuje metylaci, fosforylaci, acetylaci, ubikvitilaci a sumoylaci. PTM provedené na histonech mohou ovlivnit genovou expresi změnou struktury chromatinu nebo náborem histonových modifikátorů. Histonové proteiny působí jako obal DNA, která se obtáčí kolem osmi histonů, do chromozomů. Modifikace histonů se podílejí na různých biologických procesech, jako je aktivace/deaktivace transkripce, balení chromozomů a poškození/oprava DNA. U většiny druhů je histon H3 především acetylován na lyzinech 9, 14, 18, 23 a 56, metylován na argininu 2 a lyzinech 4, 9, 27, 36 a 79 a fosforylován na ser10, ser28, Thr3 a Thr11. Histon H4 je především acetylován na lyzinech 5, 8, 12 a 16, metylován na argininu 3 a lyzinu 20 a fosforylován na serinu 1. Kvantitativní detekce různých modifikací histonů by tak poskytla užitečné informace pro lepší pochopení epigenetické regulace buněčných procesů a vývoj léčiv cílených na enzymy modifikující histony.
Acetylace/deacetylace histonů
Acetylace histonů probíhá enzymatickým přidáním acetylové skupiny (COCH3) z acetylokoenzymu A. Acetylace histonů probíhá na základě enzymatického přidání acetylové skupiny (COCH3). Proces acetylace histonů je úzce zapojen do regulace mnoha buněčných procesů včetně dynamiky chromatinu a transkripce, umlčování genů, průběhu buněčného cyklu, apoptózy, diferenciace, replikace DNA, opravy DNA, jaderného importu a neuronální represe. Modifikační enzymy, které se podílejí na acetylaci histonů, se nazývají histonacetyltransferázy (HAT) a hrají klíčovou roli při řízení acetylace histonů H3 a H4. Bylo identifikováno více než 20 HAT, které lze rozdělit do pěti rodin:
Histonové deacetylázy (HDAC) katalyzují hydrolytické odstraňování acetylových skupin z lyzinových zbytků histonů. Nerovnováha v rovnováze acetylace histonů je spojována s tumorigenezí a progresí rakoviny. Zjištění, zda je histon H3 acetylován na svých lyzinových zbytcích, by poskytlo užitečné informace pro další charakterizaci vzorců nebo míst acetylace, což by vedlo k lepšímu pochopení epigenetické regulace aktivace genů a také k vývoji léčiv cílených na HAT. Podobně jako HAT hrají HDAC klíčovou roli v různých buněčných procesech zahrnujících histony H3 a H4. Dosud byly identifikovány nejméně 4 třídy HDAC. Do třídy I patří HDAC 1, 2, 3 a 8. Do třídy II HDAC patří 4, 5, 6, 7, 9 a 10. Enzymy třídy III, známé jako sirtuiny, vyžadují kofaktory NAD+ a zahrnují SIRT 1-7. Enzym třídy IV, který obsahuje pouze HDAC11, má vlastnosti jak třídy I, tak třídy II. Inhibice HDAC vykazuje významné účinky na apoptózu, zástavu buněčného cyklu a diferenciaci nádorových buněk. Inhibitory HDAC jsou v současné době vyvíjeny jako protinádorové látky.2
Extrahujte jaderné proteiny ze vzorku, který vás zajímá, a poté použijte metodu podobnou ELISA k měření množství proteinů HDAC nebo úrovně aktivity HDAC nebo úrovně aktivity HAT.
Metylace/demetylace histonů
Metylace histonů je definována jako přenos jedné, dvou nebo tří metylových skupin z S-adenosyl-L-methioninu na lysinové nebo argininové zbytky histonových proteinů histonmethyltransferázami (HMT). HMT kontrolují nebo regulují metylaci DNA prostřednictvím transkripční represe nebo aktivace závislé na chromatinu. V buněčném jádře se při metylaci histonů mohou aktivovat nebo umlčet specifické geny v DNA zkomplexované s histonem.3 Existuje několik různých histonmetyltransferáz, které jsou specifické pro lyzinový nebo argininový zbytek, který modifikují. U histonu H3 jsou to například SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx a SMYD3, které katalyzují metylaci histonu H3 na lyzinu 4 (H3-K4) v savčích buňkách. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 a Eu-HMTase jsou histonmetyltransferázy, které katalyzují metylaci histonu H3 na lyzinu 9 (H3-K9) v savčích buňkách. G9a a enzymy skupiny polycomb, jako je EZH2, jsou histonové metyltransferázy, které v savčích buňkách katalyzují metylaci histonu H3 na lyzinu 27 (H3-K27).4 Metylace H3-K9 i H3-K27 zprostředkovává tvorbu heterochromatinu a podílí se také na umlčování genové exprese v euchromatických místech. Zjistilo se také, že zvýšená globální metylace H3-K27 se podílí na některých patologických procesech, například na progresi rakoviny.
Na druhé straně argininová metylace histonů H3 a H4 podporuje transkripční aktivaci a je zprostředkována rodinou proteinových argininmetyltransferáz (PRMT). U člověka se vyskytuje 9 typů PRMT, ale pouze 7 jejich členů metyluje histony. Mohou zprostředkovávat mono- nebo dimetylaci argininových zbytků. Na základě polohy přídavku metylové skupiny lze PRMT rozdělit na typ I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 a PRMT8) a typ II (PRMT5 a PRMT7). Zjistilo se, že PRMT typu II se výrazně podílejí na onemocněních, jako je rakovina.5 Například PRMT5 hraje roli v represi některých nádorových supresorových genů, jako jsou nádorové supresory RB, zatímco nadměrná exprese PRMT7 je pozorována u rakoviny prsu. Detekce aktivity a inhibice PRMT typu II i dalších HMT by byla důležitá pro objasnění mechanismů epigenetické regulace aktivace a umlčování genů, stejně jako pro diagnostiku a terapii rakoviny.
Začněte izolací histonových proteinů ze vzorků, které vás zajímají, a poté vyberte vhodnou soupravu ELISA pro detekci hladin metylace histonů.
Demetylace histonů je odstraňování metylových skupin v modifikovaných histonových proteinech prostřednictvím histonových demetyláz. Bylo zjištěno, že tyto demetylázy mají potenciální onkogenní funkce a podílejí se na dalších patologických procesech. Objev histonových demetylas ukazuje, že metylace histonů není trvalá modifikace, ale spíše dynamičtější proces. Byly objeveny dvě hlavní rodiny demetyláz: Lysin specifická demetyláza 1 (LSD1) a histonové demetylázy obsahující doménu Jumonji (JmjC) (JMJD2, JMJD3/UTX a JARID). Konkrétní aminokyselinový zbytek a stupeň metylace určuje demetylační enzym. Například na histonu H3 je mono- a di-metylovaný lysin 4 demethylován LSD1 (BHC110, KDM1) a tri-metylovaný lysin 4 JARID (1A-1D); di- a trimetylovaný lysin 27 je demethylován JMJD3 a UTX (KDM6A) a mono- a di-metylovaný lysin 9 je demethylován JMJD1 a tri-metylovaný lysin 9 je demethylován JMJD2.6 Inhibice histonových demetyláz může vést k remetylaci histonů na specifických zbytcích důležitých pro dynamiku chromatinu a expresi genů. Detekce aktivity a inhibice těchto enzymů by navíc byla důležitá pro objasnění mechanismů epigenetické regulace aktivace a umlčování genů a mohla by být přínosem pro diagnostiku a terapii rakoviny.
Extrahujte jaderné proteiny ze vzorku, který vás zajímá, a poté použijte techniku založenou na ELISA ke zkoumání aktivity a úrovně inhibice histonových demetyláz rodiny LSD1 a JmjC-domény.
Jste připraveni poznat další epigenetický mechanismus? Čtěte dále: Nekódující RNA
.
