Eine Histonmodifikation ist eine kovalente posttranslationale Modifikation (PTM) an Histonproteinen, die Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitylierung und Sumoylierung umfasst. Die an Histonen vorgenommenen PTMs können die Genexpression beeinflussen, indem sie die Chromatinstruktur verändern oder Histon-Modifikatoren rekrutieren. Histonproteine verpacken die DNA, die sich um die acht Histone wickelt, in Chromosomen. Histonmodifikationen wirken bei verschiedenen biologischen Prozessen wie der Aktivierung/Inaktivierung der Transkription, der Verpackung der Chromosomen und der Beschädigung/Reparatur der DNA. Bei den meisten Arten ist Histon H3 hauptsächlich an den Lysinen 9, 14, 18, 23 und 56 acetyliert, an Arginin 2 und den Lysinen 4, 9, 27, 36 und 79 methyliert und an Ser10, Ser28, Thr3 und Thr11 phosphoryliert. Histon H4 wird hauptsächlich an den Lysinen 5, 8, 12 und 16 acetyliert, an Arginin 3 und Lysin 20 methyliert und an Serin 1 phosphoryliert. Ein quantitativer Nachweis verschiedener Histonmodifikationen würde daher nützliche Informationen für ein besseres Verständnis der epigenetischen Regulierung zellulärer Prozesse und die Entwicklung von Arzneimitteln liefern, die gezielt auf histonmodifizierende Enzyme abzielen.
Histonacetylierung/Deacetylierung
Die Histonacetylierung erfolgt durch die enzymatische Anlagerung einer Acetylgruppe (COCH3) von Acetylcoenzym A. Der Prozess der Histonacetylierung ist eng mit der Regulierung vieler zellulärer Prozesse verbunden, darunter die Chromatindynamik und Transkription, das Gen-Silencing, der Verlauf des Zellzyklus, die Apoptose, die Differenzierung, die DNA-Replikation, die DNA-Reparatur, der Kernimport und die neuronale Unterdrückung. Die an der Histon-Acetylierung beteiligten modifizierenden Enzyme werden als Histon-Acetyltransferasen (HATs) bezeichnet und spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Histon-H3- und H4-Acetylierung. Es wurden mehr als 20 HATs identifiziert, die sich in fünf Familien einteilen lassen: GNAT1, MYST, TAFII250, P300/CBP und nukleare Rezeptor-Koaktivatoren wie ACTR.1 Die Histon-H3-Acetylierung kann durch Hemmung von Histondeacetylasen (HDACs) erhöht und durch HAT-Hemmung verringert werden.
Histondeacetylasen (HDACs) katalysieren die hydrolytische Entfernung von Acetylgruppen aus Histon-Lysinresten. Ein Ungleichgewicht im Gleichgewicht der Histon-Acetylierung wird mit der Tumorentstehung und dem Fortschreiten von Krebs in Verbindung gebracht. Der Nachweis, ob Histon H3 an seinen Lysinresten acetyliert ist, würde nützliche Informationen für die weitere Charakterisierung von Acetylierungsmustern oder -stellen liefern und damit zu einem besseren Verständnis der epigenetischen Regulierung der Genaktivierung sowie zur Entwicklung von HAT-gerichteten Medikamenten führen. Ähnlich wie die HATs spielen auch die HDACs eine entscheidende Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen, an denen Histon H3 und H4 beteiligt sind. Bislang sind mindestens 4 Klassen von HDACs identifiziert worden. Zu den HDACs der Klasse I gehören 1, 2, 3 und 8. Zur Klasse II der HDACs gehören die Enzyme 4, 5, 6, 7, 9 und 10. Enzyme der Klasse III, die so genannten Sirtuine, benötigen NAD+-Cofaktoren und umfassen die SIRTs 1-7. Das Enzym der Klasse IV, das nur HDAC11 enthält, weist Merkmale sowohl der Klasse I als auch der Klasse II auf. Die Hemmung von HDAC hat signifikante Auswirkungen auf Apoptose, Zellzyklusstillstand und Differenzierung in Krebszellen. HDAC-Inhibitoren werden derzeit als Krebsmedikamente entwickelt.2
Extrahieren Sie Ihre Kernproteine aus der Probe, die Sie interessiert, und verwenden Sie dann eine ELISA-ähnliche Methode, um die Menge der HDAC-Proteine oder die Aktivitätsniveaus von HDAC oder die Aktivitätsniveaus von HAT zu messen.
Histon-Methylierung/Demethylierung
Histon-Methylierung ist definiert als die Übertragung von einer, zwei oder drei Methylgruppen von S-Adenosyl-L-Methionin auf Lysin- oder Arginin-Reste von Histon-Proteinen durch Histon-Methyltransferasen (HMTs). HMTs kontrollieren oder regulieren die DNA-Methylierung durch chromatinabhängige Transkriptionsunterdrückung oder -aktivierung. Wenn im Zellkern eine Histon-Methylierung stattfindet, können bestimmte Gene innerhalb der mit dem Histon komplexierten DNA aktiviert oder zum Schweigen gebracht werden.3 Es gibt mehrere verschiedene Histon-Methyltransferasen, die spezifisch für den Lysin- oder Argininrest sind, den sie verändern. Beim Histon H3 sind beispielsweise SET1, SET7/9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx und SMYD3 Histon-Methyltransferasen, die die Methylierung von Histon H3 an Lysin 4 (H3-K4) in Säugetierzellen katalysieren. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 und Eu-HMTase sind Histon-Methyltransferasen, die in Säugetierzellen die Methylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3-K9) katalysieren. G9a und Enzyme der Polycomb-Gruppe wie EZH2 sind Histon-Methyltransferasen, die die Methylierung von Histon H3 an Lysin 27 (H3-K27) in Säugetierzellen katalysieren.4 Sowohl die H3-K9- als auch die H3-K27-Methylierung vermittelt die Bildung von Heterochromatin und ist auch am Silencing der Genexpression an euchromatischen Stellen beteiligt. Eine erhöhte globale H3-K27-Methylierung wird auch bei einigen pathologischen Prozessen wie der Krebsentstehung festgestellt.
Andererseits fördert die Arginin-Methylierung der Histone H3 und H4 die Transkriptionsaktivierung und wird durch eine Familie von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) vermittelt. Es gibt 9 Arten von PRMTs, die beim Menschen vorkommen, aber nur von 7 Mitgliedern wird berichtet, dass sie Histone methylieren. Sie können die Mono- oder Dimethylierung von Argininresten vermitteln. Anhand der Position der Methylgruppenaddition lassen sich die PRMTs in Typ I (CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 und PRMT8) und Typ II (PRMT5 und PRMT7) einteilen. PRMTs vom Typ II spielen eine wichtige Rolle bei Krankheiten wie Krebs.5 So spielt PRMT5 beispielsweise eine Rolle bei der Unterdrückung bestimmter Tumorsuppressorgene wie RB-Tumorsuppressoren, während eine Überexpression von PRMT7 bei Brustkrebs beobachtet wird. Der Nachweis der Aktivität und Hemmung von PRMTs des Typs II sowie anderer HMTs wäre wichtig für die Aufklärung der Mechanismen der epigenetischen Regulierung der Genaktivierung und -silencing sowie für die Krebsdiagnostik und -therapie.
Starten Sie mit der Isolierung Ihrer Histonproteine aus den Proben, die Sie interessieren, und wählen Sie dann ein geeignetes ELISA-Kit zum Nachweis der Histon-Methylierung.
Histon-Demethylierung ist die Entfernung von Methylgruppen in modifizierten Histonproteinen durch Histon-Demethylasen. Es wurde festgestellt, dass diese Demethylasen potenziell onkogene Funktionen haben und an anderen pathologischen Prozessen beteiligt sind. Die Entdeckung der Histon-Demethylasen zeigt, dass die Histon-Methylierung keine permanente Modifikation ist, sondern eher ein dynamischer Prozess. Es wurden zwei große Familien von Demethylasen entdeckt: Die Lysin-spezifische Demethylase 1 (LSD1) und die Histondemethylasen mit Jumonji-Domäne (JmjC-Domäne) (JMJD2, JMJD3/UTX und JARIDs). Der spezifische Aminosäurerest und der Grad der Methylierung bestimmen das Demethylierungsenzym. Am Histon H3 wird beispielsweise mono- und di-methyliertes Lysin 4 durch LSD1 (BHC110, KDM1) und tri-methyliertes Lysin 4 durch JARID (1A-1D) demethyliert; di- und trimethyliertes Lysin 27 wird durch JMJD3 und UTX (KDM6A) demethyliert, und mono- und di-methyliertes Lysin 9 wird durch JMJD1 demethyliert und trimethyliertes Lysin 9 wird durch JMJD2 demethyliert.6 Die Hemmung von Histondemethylasen kann zu einer Remethylierung von Histon an spezifischen Resten führen, die für die Chromatindynamik und die Genexpression wichtig sind. Darüber hinaus wäre der Nachweis der Aktivität und Hemmung dieser Enzyme wichtig für die Aufklärung der Mechanismen der epigenetischen Regulierung der Genaktivierung und des Gen-Silencing und könnte der Krebsdiagnostik und -therapie zugute kommen.
Extrahieren Sie Ihre Kernproteine aus der Probe, die Sie interessiert, und wenden Sie dann eine ELISA-basierte Technik an, um die Aktivität und den Hemmungsgrad von Histondemethylasen der LSD1- und JmjC-Domänenfamilien zu untersuchen.
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