Subjekty a zobrazovací postupy
Experiment 1 (3,0 T): Dvacet zdravých dospělých osob (11 mužů, věk 26,2 ± 3,1 let) poskytlo informovaný souhlas s účastí v experimentu. Údaje 16 účastníků již byly uvedeny v naší předchozí studii15. Čtyři účastníci byli pro tuto studii přijati nově. Mezi vylučovací kritéria patřila významná psychiatrická nebo neurologická anamnéza. Tato studie byla schválena Radou pro etiku výzkumu (REB) Torontské univerzity a REB nemocnice SickKids. Pro určení velikosti vzorku nebyl a priori proveden žádný statistický test. Velikost vzorku, kterou jsme zvolili, je podobná velikosti vzorku použité v předchozích publikacích16, 26. Experiment byl proveden pomocí systému fMRI 3,0 T (Siemens Trio). Nejprve byly shromážděny lokalizační snímky, aby se zorné pole (FOV) zarovnalo na střed mozku každého účastníka. Před spuštěním experimentálního echo-planárního zobrazování (EPI) byly získány anatomické snímky vážené T1 (1 mm3, 256 × 256 FOV; sekvence MPRAGE). Pro funkční zobrazování byla použita gradientní echo-planární sekvence (doba opakování (TR) = 2000 ms; doba echa (TE) = 27 ms; úhel převrácení = 70°). Každý funkční běh se skládal z 263 akvizic celého mozku (40 × 3,5 mm řezů; prokládaná akvizice; FOV = 192 mm; velikost matice = 64 × 64; rozlišení v rovině 3 mm). První čtyři funkční snímky v každém cyklu byly z analýzy vyloučeny, aby bylo možné vyrovnat podélnou magnetizaci.
Experiment 2 (7,0 T): Jedenáct zdravých dospělých osob (6 mužů, věk 22,2 ± 2,2 let) poskytlo informovaný souhlas s účastí v experimentu. Tato studie byla schválena etickou komisí japonského Národního ústavu pro fyziologické vědy. Pro určení velikosti vzorku nebyl a priori proveden žádný statistický test. Velikost vzorku, kterou jsme zvolili, je podobná velikosti vzorku použité v předchozích publikacích16, 26. Experiment byl proveden pomocí systému fMRI 7,0 T (Siemens Magnetom). Nejprve byly shromážděny lokalizační snímky, aby se FOV zarovnalo na střed mozku každého účastníka. Byly získány anatomické snímky vážené T1 (izometrie 0,75 mm, FOV 224 × 300; sekvence MPRAGE). Pro funkční zobrazování byla použita gradientní echo-planární sekvence (TR = 500 ms; TE = 25 ms; úhel překlopení = 35°; multiband faktor = 4). Každý funkční běh sestával z 1010 akvizic celého mozku (32 × 2,0 mm řezů; prokládaná akvizice; FOV = 208 mm; velikost matice = 104 × 104; rozlišení v rovině 2 mm). První čtyři funkční snímky v každém běhu byly z analýzy vyloučeny, aby bylo možné vyrovnat podélnou magnetizaci.
Postupy chování
Experiment 1: Gustativní podněty byly dodávány plastovými trubičkami sbíhajícími se v plastovém rozdělovači, jehož tryska kapala chuťové roztoky do úst. Trubičky byly předem naplněny tak, že mezi prezentací vizuálního podnětu a dodáním tekutiny nebyla pozorována téměř žádná prodleva. Sto pokusů s chuťovými roztoky bylo randomizováno a vyváženo v pěti bězích. V každém pokusu bylo dodáno 0,5 ml chuťového roztoku po dobu 1244 ms. Po ukončení podávání tekutiny se na obrazovce objevil pokyn, aby účastníci tekutinu spolkli (1 s). Po 7756 ms se objevily stupnice hodnotící pozitivitu (3 s) a poté negativitu (3 s) tekutiny. Následovalo dodání 0,5 ml kapaliny bez chuti během 1244 ms pro opláchnutí, po kterém následoval pokyn k polknutí trvající 1 s. Po intervalu 7756 ms mezi pokusy začal další pokus.
Experiment 2: Ve srovnání s experimentem 1 se podávání chuťových podnětů lišilo pouze v jejich načasování a množství. Sto pokusů s chuťovým roztokem bylo randomizováno a vyváženo v pěti bězích. V každém pokusu bylo během 2 s dodáno 0,88 ml chuťového roztoku. Po skončení dodávání tekutiny se na obrazovce objevil pokyn, aby účastníci tekutinu spolkli (2 s). Po 4000 ms se objevily stupnice hodnotící pozitivitu (3 s) a poté negativitu (3 s) tekutiny. Následovalo dodání 0,88 ml tekutiny bez chuti během 2 s pro opláchnutí, po kterém následoval pokyn k polknutí za 2 s. Po intervalu 7 s mezi pokusy začal další pokus.
Předexperimentální sezení
Experiment 1: Aby se zohlednily individuální rozdíly v subjektivním prožívání různých chutí, byli účastníci požádáni, aby ochutnali větší rozsah intenzity (měřeno molární koncentrací) různých chuťových roztoků (kyselý, slaný, hořký a sladký). V tomto předexperimentálním sezení byli účastníci testováni na 1 pokus (2 ml) každého z 16 chuťových roztoků následovně: (1) kyselé/kyseliny citronové: 1 × 10-1 M, 3,2 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M a 1,0 × 10-2 M; (2) slané/stolní soli: 5,6 × 10-1 M, 2,5 × 10-1 M, 1,8 × 10-1 M a 1,0 × 10-1 M; 3) hořká/chinin sulfát: 1,0 × 10-3 M, 1,8 × 10-4 M, 3,2 × 10-5 M a 7,8 × 10-6 M; a 4) sladká/sukóza: Pořadí prezentace bylo náhodně určeno podle chuti a poté podle koncentrace v rámci každé chuti. Po vypití každého roztoku se účastníci opláchli a spolkli 5 ml vody, poté ohodnotili intenzitu a příjemnost (valenci) zážitku z roztoku na samostatných stupnicích 1-9. Pro každou chuť byly vybrány koncentrace, které se shodovaly v intenzitě. Předchozí práce2 ukázala, že účastníci mají různé výchozí hodnoty hodnocení a nejspolehlivěji se vybírají koncentrace nad střední intenzitou, kterou sami uvádějí. Všechny roztoky byly namíchány s použitím chemických sloučenin farmaceutické kvality od společnosti Sigma Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com), které jsou bezpečné pro konzumaci.
Experiment 2: Účastníci byli testováni na 1 pokus (1 ml) každého z 16 chuťových roztoků následujícím způsobem: (1) sladká 1/glukóza: 2,0 M, 1,1 M, 0,56 M a 0,38 M; (2) sladká 2/sukralóza: 2,1 × 10-3 M, 1,1 × 10-3 M, 0,53 × 10-4 M a 0,26 × 10-4 M; (3) hořká 1/katechin: 3,5 × 10-2 M, 1,8 × 10-2 M, 8,8 × 10-3 M a 4,4 × 10-3 M; a (4) hořká 2/chlorid hořečnatý: Pořadí prezentace bylo náhodně určeno podle chuti a poté podle koncentrace v rámci každé chuti. Po vypití každého roztoku se účastníci opláchli a spolkli 5 ml vody, poté hodnotili intenzitu a příjemnost (valenci) zážitku z roztoku na samostatných stupnicích od 1 do 9 bodů. Pro každou chuť byly vybrány koncentrace, které se shodovaly v intenzitě. Všechny roztoky byly namíchány s použitím potravinářských chemických sloučenin od společností DHC (katechin), FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (chlorid hořečnatý), Tsuruya Chemical Industries (sukralóza) a Nichiga (glukóza).
Analýza dat
Data byla analyzována pomocí softwaru SPM8 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/). Funkční obrazy byly znovu zarovnány, korigováno časování řezů a normalizovány na šablonu MNI (ICBM 152) s interpolací na prostor 2 × 2 × 2 mm. Data byla prostorově vyhlazena (plná šířka, poloviční maximum (FWHM) = 6 mm) pro jednorozměrnou parametrickou modulační analýzu, ale ne pro analýzu multivoxelových vzorů, protože to může zhoršit výkonnost19. Každá prezentace podnětu byla modelována jako samostatná událost pomocí kanonické funkce v SPM8. Pro každý voxel byly t-hodnoty jednotlivých pokusů demeanizovány odečtením průměrné hodnoty napříč pokusy. K vizualizaci výsledků zobrazování byl po úpravě použit software freesurfer39 (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) a SPM surfrend toolbox (napsal I. Kahn; http://spmsurfrend.sourceforge.net).
Jednotlivá analýza
Provedli jsme jednorozměrné analýzy, abychom zjistili, zda jsou základní chutě kódovány specifickými voxely v insule. Regresory kódující jednotlivé chutě byly časově vázány na prezentaci podnětů. Univariační analýzy byly provedeny dvakrát: s regresory hedonické valence a bez nich (obr. 1). Abychom zviditelnili, jak velký rozptyl lze vysvětlit regresory hedonické valence v oblastech citlivých na hořkou chuť, vybrali jsme významné voxely v kontrastu „hořká vs. bez chuti“ bez regresoru valence (doplňkový obrázek 1). Průměrná aktivita byla zobrazena pro aktivitu proti klidové základní linii (doplňkový obrázek 1a), aktivitu proti bez chuti (doplňkový obrázek 1b) a aktivitu proti bez chuti s regresí valence (doplňkový obrázek 1c). Abychom otestovali existenci voxelově specifického ladění chuti, rozdělili jsme u každého účastníka liché a sudé běhy a porovnali aktivitu voxelu pro každou chuť v lichých bězích s aktivitou voxelu pro každou chuť v sudých bězích. Pro ilustraci, když byly voxely seřazeny podle aktivace pro každou chuť v sudých bězích, zjistili jsme konzistentní vzorce odpovídajícího poklesu aktivace pro všechny čtyři chutě v lichých bězích (obr. 1b, doplňkový obrázek 4). Pro aktivaci voxelů mezi lichými a sudými běhy byly vypočteny korelace mezi všemi kombinacemi chutí v rámci každého účastníka, které byly podrobeny jednovýběrovému t-testu napříč účastníky (obr. 1c, obr. 4a, b). Dále jsme vypočítali korelace mezi lichými a sudými běhy pro všechny stejné a různé kombinace chutí v rámci každého účastníka. Korelační koeficienty byly z-transformovány a podrobeny jednovýběrovému t-testu napříč účastníky (obr. 1d, obr. 4b, d).
Analýza vyhledávacího světla pro reprezentace chuťových typů
Analyzovali jsme data fMRI insulární kůry pomocí analýzy vyhledávacího světla (poloměr 4 mm, zahrnující 33 voxelů)20 . V rámci dané sféry pro každého účastníka byl vytvořen vektor obsahující prostorový vzorec signálu BOLD-MRI časově vázaný na prezentaci podnětu (normalizované t-hodnoty na voxel). Abychom vyhodnotili, zda jsou vzorce aktivity ve sférách reflektorů schopny rozlišit typy chutí, použili jsme křížovou validaci s ponecháním jedné stimulační dvojice40. Při tomto postupu byl klasifikátor LDA natrénován na 38 pokusech, které zahrnovaly testovaný typ chuti a jiný typ chuti (19 pokusů pro každý z nich), a poté testován na vynechané dvojici podnětů. Klasifikační výkon pro každou chuť byl zprůměrován v porovnání s jinými chutěmi (např. klasifikační výkon pro kyselou chuť byl zprůměrován pro kyselou chuť vs. sladkou, kyselou chuť vs. hořkou, kyselou chuť vs. slanou a kyselou chuť vs. chuť bez chuti). Na úrovni jednotlivců odpovídala 58,7% přesnost klasifikace p < 0,05 bez korekce. Pro skupinovou analýzu byly mapy výkonnosti individuální klasifikace vyhlazeny Gaussovým jádrem s FWHM 4 mm a poté podrobeny jednovýběrovému permutačnímu testu pomocí SnPM13 (http://warwick.ac.uk/snpm). Při tomto postupu byla data od každého účastníka náhodně převrácena vynásobením – 1 po odečtení 50 % (přesnost na úrovni náhody) a poté podrobena jednovýběrovému t-testu napříč účastníky. Ten byl permutován 10 000krát, čímž bylo získáno rozložení maximálních t v rámci insula. Na základě tohoto rozdělení byl stanoven 5% práh FWE.
Analýza konjunkce chutí
Pro analýzu konjunkce více chutí (obr. 2b) byl každý voxel testován na to, zda překročil práh pro čtyři diskriminace chuťových typů, kde každá diskriminace chuťového typu zprůměrovala klasifikační výkon ve čtyřech srovnáních (např. kyselá vs. sladká, kyselá vs. hořká, kyselá vs. slaná a kyselá vs. bez chuti) a překročila náhodnou klasifikaci (50 %). Platná konjunktivní inference vyžaduje signifikantní výsledky pro všechna porovnání41. Počítali jsme tedy počet typů chutí splňujících 5% hranici FWE v každém voxelu v rámci insula.
Analýza chuťových párů
Pro analýzu konkrétních chuťových párů jsme zkoumali nezávisle definovanou ROI v rámci insula. Nejprve jsme použili postup „leave-one-subject-out“, kdy jsme vyloučili každý z 20 subjektů, a poté jsme vypočítali mapu spojení 4 chutí (tj. voxely splňující všechny 4 výše popsané chuťové kontrasty) se zbývajícími 19 subjekty, čímž jsme získali 20 map. Překrytí těchto 20 skupinových map je znázorněno na obr. 2c. Voxely z mapy splňující 5% práh FWE byly definovány jako ROI schopné chuťové diskriminace. V rámci této ROI jsme zkoumali diskriminaci konkrétních chuťových párů a vypočítali výkonnost klasifikace každého chuťového páru. Výkonnost skupiny byla vypočtena jako průměrná klasifikační výkonnost 20 subjektů (obr. 2d).
Pro diskriminaci chuťových párů na základě hodnocení valence (obr. 2e) jsme provedli analýzu LDA s použitím hodnocení valence subjektem (tj. nezávisle na datech fMRI). Valence byla vypočtena odečtením hodnocení negativity od hodnocení pozitivity pro každý pokus. Klasifikace chutí byla vypočtena pomocí tréninku vynechání jednoho pokusu na 19 zbývajících pokusech pro každý typ chuti.
Analýza valence a typu chuti
Pro testování nezávislosti typu chuti na valenci jsme zkoumali podobnost dat fMRI v rámci ROI definované výše uvedenou mapou spojení čtyř chutí. Pro každý subjekt byly vypočteny korelace po jednotlivých pokusech, což vedlo k získání 4950 (100 × 99/2) korelačních koeficientů, roztříděných do 2 × 2 kategorií typ chuti (stejná, odlišná) × hedonická valence (stejná, odlišná). Korelační koeficienty byly zprůměrovány v rámci každé buňky na subjekt a poté byla data všech subjektů podrobena dvoucestné analýze ANOVA s opakovanými měřeními s typem chuti a valencí jako faktory (obr. 2g).
Dále jsme provedli následnou analýzu bez závislosti dat v korelacích po jednotlivých pokusech v rámci 2 × 2 buněk. Každou buňku jsme náhodně naplnili 100 pokusy a tento postup jsme opakovali 1 000 000krát. Z nich jsme analyzovali permutaci s největší shodou mezi faktory 2 × 2 a skutečnými kategoriemi pokusů (na základě maximálního geometrického průměru podílu redukovaných dat ve čtyřech buňkách). Poté jsme vypočítali korelace mezi pokusy pouze v rámci každé buňky, čímž jsme zajistili, že nedojde k závislosti mezi buňkami. Korelační koeficienty byly zprůměrovány v rámci každé buňky na subjekt a poté byla data všech zbývajících subjektů podrobena dvoucestné analýze ANOVA s opakovanými měřeními (doplňkový obrázek 3).
Schémata chuti se lišila nezávisle na valenci chuti, tj. mapy diskriminace chuti byly oddělitelné od chuti. Vzhledem k silné vazbě mezi typem chuti a valencí nebyly kombinace pokusů na různých úrovních stejné. Například stejné valence s různými typy chutí byly poměrně vzácné (doplňková tabulka 4). To však nenaznačuje multikolinearitu ve velikosti účinku.
Statistika
Údaje jsme analyzovali bez předpokladu normálního rozdělení, pomocí neparametrické statistiky. Před ANOVOU (obr. 2g) byl proveden Leveneův test, aby se zajistilo splnění předpokladu homoskedasticity. Byly použity korekce pro vícenásobná srovnání s použitím Bonferroniho korekce.
Souhrn zpráv
Další informace o experimentálním designu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.
.
